一種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體及其製備方法
2023-08-13 00:35:36 1
專利名稱：一種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體及其製備方法，屬於食品加工和醫
藥技術領域，可應用於功能性食品、保健品和醫藥行業。
背景技術：
心腦血管疾病嚴重地危害著人們健康，已成為人類死亡的第一"殺手"。世界衛生組織(WHO)公布的統計數字顯示，全世界患有各種血栓性疾病的患者在1500萬，其中每年約有800萬患者死亡。據衛生部統計我國每年有近120萬人死於心腦血栓、腦中風、腦梗塞、老年痴呆等心腦血管栓塞性疾病，而表現亞健康的人則更多。栓塞性心腦血管疾病的預防和治療主要是通過溶栓劑，全球每年溶栓劑潛在市場20多億美元。 目前，臨床應用的溶栓劑，如尿激酶(Urokinase,區)、鏈激酶(Str印tokinase，SK)、葡激酶(St即hylokinase)、蛇毒抗栓酶、重組型纖溶酶原激活劑類(t-PA和scu-PA)等，大多為纖溶酶原激活劑，它們主要通過激活體內的纖溶酶原生成纖溶酶而發揮溶栓作用，存在需要靜脈注射，體內半衰期短、穩定性差，無纖維蛋白特異性，需反覆大劑量注射，易誘發全身纖溶亢進，易導致全身出血等毒副作用，或價格昂貴。因此研發新一代預防和治療栓塞性疾病的保健食品和溶栓劑，已成為當前社會的迫切要求。微生物是纖溶蛋白酶的重要來源，現在已發現有些酶的纖溶活性明顯優於目前臨床應用的溶栓劑，因其可批量發酵生產、價格低廉、藥效時間長，可以很好地彌補上述溶栓劑缺陷，是潛在的新生代預防和治療栓塞的藥物。 Bacillus subtilis DC12—33是從中國傳統發酵食品中分離篩選的一株細菌，該菌株可產生強烈纖溶活性的豆豉纖溶酶(fibrinolytic subtilisin) Subtilisin FS33，Subtilisin FS33分子量為30KDa，等電點pi為8. 7±0. 2，且絲氨酸(含羥基)和色氨酸(含吲哚基團)是其酶活性中心或位於酶活性中心附近；在pH7-12範圍內SubtilisinFS33生化性質較穩定，但酸性條件酶活力迅速下降；體外試驗表明Subtilisin FS33在缺乏內源性溶血因子的情況下，仍能溶解血栓纖維蛋白，表現出直接降解血栓纖維蛋白能力；體內試驗研究中，不同劑量Subtilisin FS33靜脈注射給予受試大鼠(動物血栓模型)，其APTT、PT、TT等都明顯延長(P < 0. 05， P < 0. 01)，血槳FDP的含量升高(P < 0. 01) ，D-dimer呈陽性，而機體ELT值顯著降低(P < 0. 05)，表明機體的抗凝能力明顯增高，纖溶能力增強，溶栓效果明顯，因此Subtilisin FS33同時具有直接和間接的溶栓作用。
保健食品的功能性因子是通過胃腸道吸收而發揮其效應，儘管口服給藥的生物利用度可能不如靜脈注射和肌肉注射，但口服痛苦小、最方便、最易接受，所以新型口服給藥系統的研究倍受世人關注。中國科學院和百奧醫藥集團從蚯蚓體內純化出蚓激酶(Lumbrokinase)，並研究證明該蚓激酶可口服吸收，發揮其有效治療效果，已經應用於臨床。 生物活性多肽經腸道轉運吸收，需要克服兩個屏障即胃腸酶屏障和黏膜物理屏障，胃腸道和腸上皮細胞的酶降解作用是活性肽類口服生物利用度低的重要原因。脂質體
3納米載運系統作為一種新型的傳遞和控釋載體，作為多肽蛋白類載體顯示出諸多優越性保護其不被胃酸和消化道酶分解，增加腸道上皮細胞的吸附，延長吸收時間，可以跨越生物屏障、能通過人體血液微循環、改變其體內分布。資料顯示，脂質體的介質材料、製作工藝、表面電荷、粒徑大小、親疏水性、藥物負載類型等因素，都影響著脂質體納米粒的載藥量和吸收率。 一般地講，脂質體疏水性強，易於腸吸收，表面疏水性和電負性越大，越易被機體吞
噬清除。本發明採用脂質體載運系統包合載運SubtilisinFS33，並進行促腸吸收的酶蛋白改性修飾和脂質體表面修飾，提高Subtilisin FS33的腸吸收效率和生物利用度。
發明內容
本發明提供一種促腸吸收的豆豉纖溶酶載酶脂質體及其製備方法，該促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體的特徵是以改性修飾的豆豉纖溶酶Subtilisin FS33為包合對象，選擇膽固醇和磷脂作為介質材料，PEG改性修飾酶蛋白，0-羧甲基殼聚糖(或殼聚糖或膽酸鹽或凝集素，其中之一或混合物)表面修飾載酶脂質體，優化硫酸銨梯度法製備載酶脂質體的條件，並採用蛋白酶抑制劑抑制消化道蛋白酶活性，丙烯酸樹脂(Eudragit)腸溶包衣等，通過上述技術的集成製備豆豉纖溶酶載酶脂質體系統。
本發明的技術方案 本發明是一種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體及其製備方法，該纖溶酶載酶脂質體是通過選擇合適介質材料(膽固醇和卵磷脂)，適當蛋白酶改性修飾(PEG作為改性劑)和
表面修飾(o-羧甲基殼聚糖或殼聚糖或膽酸鹽或凝集素，其中之一或混合物)作為促腸吸
收劑)，改進載酶脂質體的製備工藝，改變其表面電荷、粒徑大小、親疏水性、負載類型；冷凍乾燥的纖溶酶載酶脂質體添加蛋白酶抑制劑(抑制消化道蛋白酶作用)，利用丙烯酸樹脂(Eudragit，對pH敏感)作為腸溶包衣。上述技術措施的集成構建一個多層屏障和促腸上皮跨膜轉運吸收體系，提高其跨生物膜通透性和生物利用度。 —種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體包合物，其包合物結構特徵為，PEG改性修飾的豆豉纖溶酶Subtilisin FS33被包合在脂質體的空腔內，脂質體經0-羧甲基殼聚糖(或膽酸鹽)表面修飾，形成以脂質體為主體分子、改性修飾豆豉纖溶酶Subtilisin FS33為客體分子的包合物。 本發明是通過以下技術方法實現的稱取適量膽固醇和蛋黃卵磷脂(膽固醇卵磷脂=1 : 2;W/W)—無水乙醇和無水乙醚充分溶解混勻一5(TC減壓蒸發抽乾成脂膜一加入適量O-羧甲基殼聚糖(或殼聚糖或膽酸鹽或凝集素，其中之一或混合物)和0. 5mo1/1濃度(NH4) 2S04溶液充分水化一冰浴超聲(功率450w， 20min) — 0. 22 y m微孔濾膜，整粒一加入改性Subtilisin FS33酶(0. 19mg/ml)—溫度5(TC水浴孵化一製得載酶脂質體一水洗脫鹽一冷凍乾燥一載酶脂質體粒一蛋白酶抑制劑一丙烯酸樹脂作為腸溶包衣一促腸吸收纖溶酶載酶脂質體。
本發明的技術效果 聚乙二醇(PEG)無毒、無抗原性、具有良好的溶解性，且該聚合物的生物相容性和安全性得到美國FDA的認證。PEG可將其優良性質傳遞到修飾的多肽和蛋白質等生物分子上，改變其生物分配行為和溶解行為；PEG可使生物膜傳質能力變大，改變PEG含量可控制藥物透過速度，因此PEG是一種重要的多肽修飾劑和促吸收劑。0-羧甲基殼聚糖(或膽酸鹽、殼聚糖、脫氧膽酸鹽、凝集素)具有脂質體表面修飾，可以實現膜黏附，延長其在腸道壁或腸道特定吸收部位的接觸與轉運時間，改善多肽的促腸吸收作用，促進多肽的腸吸收效率；蛋白酶抑制劑可以抑制消化道蛋白酶的作用，減弱對多肽的裂解作用；丙烯酸樹脂(Eudragit)對pH敏感，可作為腸溶包衣。上述措施構成了一個多層屏障和有利於腸上皮跨膜轉運吸收的體系。這些集成措施提高纖溶酶的腸吸收效率5-8倍，提高生物利用度2. 5倍，其溶栓效果被體內外的試驗結論所證實。改性脂質體包被的Subtilisin FS33對溫度、極端pH和模擬人工腸液及胃腸道的耐受性較未經脂質體包被酶有明顯提高，並提高了纖溶酶的腸吸收效率和生物利用度。這種纖溶酶載體體系可應用於食品和保健品。
具體實施例方式
(1)以"-NH廠PEG為引發劑，陰離子開環聚合法製備PEG-Subtilisin FS33改性蛋白酶。 (2)纖溶酶載酶脂質體的製備。稱取適量膽固醇和蛋黃卵磷脂(膽固醇卵磷脂=1 : 2;W/W)，用無水乙醇和無水乙醚充分溶解、混勻，5(TC減壓蒸發抽乾成脂膜後，加入適量0-羧甲基殼聚糖(殼聚糖或膽酸鹽或凝集素，其中之一或其混合物)和O. 5mol/l濃度(NH山S04溶液充分水化，在冰浴條件下超聲波細胞破碎儀(450w)處理20min，然後0. 22 y m微孔濾膜過濾整粒，加入改性PEG-Subtilisin FS33酶，於5(TC水浴孵化，製得載酶脂質體。 (3)促腸吸收纖溶酶載酶脂質體製備。載酶脂質體經冷凍乾燥，並加入蛋白酶抑制劑，丙烯酸樹脂作為腸溶包衣，製得促腸吸收纖溶酶載酶脂質體多元複合體。該載酶脂質體的粒徑50-150nm左右，活性包封率30%左右。
權利要求
一種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體及其製備方法，其特徵是PEG改性修飾的豆豉纖溶酶Subtilisin FS33被包合在脂質體的空腔內，並經O-羧甲基殼聚糖(或殼聚糖或膽酸鹽或凝集素)表面修飾，形成以改性脂質體為主體分子、改性修飾豆豉纖溶酶SubtilisinFS33為客體分子的包合物。
2. 根據權利要求1所述的促腸吸收纖溶酶載酶脂質體及其製備方法，其特徵在於改進載酶脂質體的製備工藝，選擇膽固醇和卵磷脂作為介質材料(其比例為l : 2—1 : 6)，PEG作為蛋白改性修飾劑，O-羧甲基殼聚糖(或殼聚糖或膽酸鹽或凝集素，其中之一或混合物)作為表面修飾和促腸吸收劑，改變其表面電荷、粒徑大小、親疏水性、負載類型和腸膜通透性。
3. 根據權利要求1所述的一種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體及其製備方法，其特徵在於添加蛋白酶抑制劑抑制消化道蛋白酶作用，丙烯酸樹脂(Eudragit，對pH敏感)作為腸溶包衣，集成措施製備促腸吸收纖溶酶載酶脂質體體系。
4. 一種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體及其製備方法，其特徵在於膽固醇與卵磷脂的重量比為l : 2—1 : 6，溶於無水乙醇和無水乙醚，5(TC減壓蒸發抽乾成脂膜，加入適量0-羧甲基殼聚糖(或殼聚糖或膽酸鹽或或凝集素)和O. 5mol/l(NH》^(^溶液充分水化，冰浴超聲，微孔濾膜整粒，加入改性Subtilisin FS33酶，5(TC水浴孵化，製得載酶脂質體。
全文摘要
本發明涉及一種促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體及其製備方法，屬於食品加工和醫藥技術領域，可應用於功能性食品、保健品和醫藥行業。Bacillus subtilis DC12-33是從中國傳統發酵食品中分離篩選的一株細菌，該菌株可產生強烈纖溶活性的豆豉纖溶酶(fibrinolytic subtilisin)Subtilisin FS33，通過體內外的試驗研究證明Subtilisin FS33同時具有直接和間接的溶栓作用。本發明以改性修飾的豆豉纖溶酶Subtilisin FS33為包合對象，選擇膽固醇和磷脂作為介質材料，PEG改性修飾酶蛋白，0-羧甲基殼聚糖(或膽酸鹽、殼聚糖、凝集素)表面修飾脂質體，並採用蛋白酶抑制劑抑制消化道蛋白酶活性，丙烯酸樹脂(Eudragit)腸溶包衣等技術集成措施製備促腸吸收的纖溶酶載酶脂質體系統，構成一個多層屏障和有利於腸上皮跨膜轉運吸收的體系，提高Subtilisin FS33的腸吸收效率和生物利用度。這種纖溶酶載體體系可應用於功能食品和保健品等。
文檔編號A61K9/127GK101703240SQ20091023654
公開日2010年5月12日 申請日期2009年10月30日 優先權日2009年10月30日
發明者孫寶國, 曹雁平, 王成濤, 王靜 申請人:北京工商大學