創傷性腦損傷的治療的製作方法

2023-07-10 08:13:31

專利名稱：創傷性腦損傷的治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶在製備用於治療創傷性腦損傷(TBI)的藥物製劑中的應用。
背景技術：
EP-A10 296 721公開了一類哌啶或1，2，3，6-四氫吡啶化合物，其5-位被一個5-元雜環基取代，包括一組任意取代的5-四唑基-1，2，3，6-四氫吡啶化合物。已揭示此類化合物對中樞膽鹼能受體具有高親和性，特別是對中樞毒蕈鹼M1受體具有高親和性，因此，可用於治療阿爾茨海默病，老年痴呆症，以及學習和記憶功能障阻。
Moltzen等人J.Med.Chem.1994，37，4085-4099描述了該一組化合物的結構-活性關係。已報導其中一種化合物，即5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶對毒蕈鹼受體具有選擇性作用，並對M1受體比對M2和M3受體具有高几倍的親和性(毒蕈鹼受體的亞型，第六屆國際學術討論會，Nov.9-12，1994，FortLauderdale)。其功能作用被描述為M1受體的部分激動劑，以及M2和M3受體的拮抗劑。並且，已報導的體內試驗中唯一突出的作用是分別對幼大鼠和成年大鼠空間記憶獲得的效力。
在人群中由物理的或神經的狀態，或者各種疾病所引起的TBI，其重要性正在不斷增加，因此，對用於治療這種疾病及其後遺症有效並安全的藥物有巨大的需求。
現在已驚奇地發現，化合物5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶在用於治療TBI及其後遺症中，顯示出有益的作用。
發明概述因此，本發明涉及5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶，或它的酸加成鹽在製備用於治療創傷性腦損傷或其後遺症的藥物製劑中的應用。
在說明書和權利要求書中，名詞「創傷性腦損傷(TBI)」意指包括與腦或脊髓創傷有關的所有病症，例如，由作用於腦底(Scull)或脊柱的物理力，局部缺血，中風，呼吸停止，心跳停止，腦血栓形成或栓塞，AIDS所致神經障礙，大腦出血，腦脊髓炎，腦積水，術後事件，腦感染，震蕩或顱內壓升高所引起的與腦或脊髓創傷有關的病症。
本發明所用的該化合物的可藥用的酸加成鹽，是以無毒的有機或無機酸形成的鹽。這類有機鹽的實例有下列有機酸形成的鹽馬來酸，富馬酸，苯甲酸，抗壞血酸，雙羥萘酸，琥珀酸，草酸，雙-亞甲水楊酸，甲磺酸，乙二磺酸，乙酸，丙酸，酒石酸，水楊酸，檸檬酸，葡糖酸，乳酸，蘋果酸，扁桃酸，肉桂酸，檸康酸，尺冬氨酸，硬脂酸，棕櫚酸，衣康酸，乙醇酸，對-氨基苯甲酸，穀氨酸，苯磺酸，和茶葉鹼乙酸，以及8-滷代茶葉鹼，如8-溴代茶葉鹼。這類無機鹽的實例有以鹽酸，氫溴酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸和硝酸形成的鹽。
現在已發現，本發明所用的化合物對治療TBI是有用的。例如，它能改善中度創傷性腦損傷之後的識別能力，以及能夠降低膽鹼能神經元的損傷退化性減少。而且還發現，在被認為是臨床適合的劑量下，它不引起有害的心博或其它的副作用。
另一方面，本發明提供了一種用於預防或治療人TBI的方法，包括對需要這種治療的病人給予治療有效量5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶或其酸加成鹽的步驟。
本發明所用的化合物及其可藥用的酸加成鹽，可通過任何適當的途經給藥，例如口服或非經腸道給藥，並且，該化合物還可以以任何適當的形式給藥，例如以片劑，膠囊，粉劑或糖漿劑的形式，或者溶液或分散體的注射劑型。
本發明化合物或其可藥用的鹽，其有效的日劑量是10μg/kg體重-10mg/kg體重，優選的是25μg/日/kg體重-1.0mg/日/kg體重。因此，適合的日劑量是500μg/日-600mg/日，優選的是1.0mg/日-100mg/日。
本發明所用的化合物可按照EP-A10 296 721中所述的方法得到，其酸加成鹽可通過本領域熟知的方法容易地製備。藥理學通過如下公認的可靠方法，對本發明所用的化合物進行了測定TBI之後的識別功能按照Dixon.C.E等人J.Neurosurgery，67(1987)110-119所述的方法，使大鼠形成中樞流體衝擊創傷性腦損傷。對受損傷的動物從受傷後24小時開始治療，以生理鹽水或5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶，以3.6μmol/kg或15μmol/kg的劑量，每日皮下注射給藥1-15天。
按照Dixon et al 1987，同上文獻的方法測定動物TBI後的翻正反射抑制。
在動物受損傷之前和受損傷後1-5天記錄體重，並按照Hamm.R.J.等人J.Neurotreuma，11(1994)187-196中的方法，在受傷後1-5天測定動物旋轉杆的能力。旋轉杆試驗可用於測定TBI後的運動能力。
最後，在受傷後11-15天，測定動物在Morris水迷宮中找到目標平臺的平均消耗時間(+S.E.M.)。藉助於ANOVA對此結果進行分析。在水迷宮試驗過程中，對所有的動物在水迷宮測定前10分鐘進行了注射治療。
試驗中還包括用於對比的假損傷動物(使動物受損傷，但未受到中樞流體衝擊)。
TBI之後對ChAT神經元的定量測定如上所述使大鼠形成中樞流體衝擊創傷性腦損傷，並進行治療。以生理鹽水(n＝5)或待測化合物(5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶，15μmol/kg)(n＝5)對動物作皮下注射。對假損傷大鼠也以生理鹽水(n＝4)或待測化合物15μmol/kg(n＝4)注射(皮下)治療。
如上所述測定翻正反射的抑制。
通過對前腦基底部膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)免疫反應性神經元進行定量計數，可測定TBI之後膽鹼能神經元的可能損失。在受損傷後15天(最後一次注射給藥後的2-4小時)，將所有的動物用戊巴比妥麻醉(90mg/kg腹膜內注射)後，先用200-250ml等滲鹽水，隨後用以0.1M磷酸鹽緩衝液配製的500ml 4.0％多聚甲醛/0.2％苦味酸，在室溫下，以500ml/30分鐘的速度作主動脈灌流。灌流完成之後，選取修整成二塊腦組織，並在相同的溶液中，10℃後固定24小時。通過前腦各神經核，在振動切片機上切取40μm厚的冠狀切片，並對每個核的第5片切片作ChAT免疫反應性處理。對平行的切片以結晶紫作Nissi體物質染色，用於定量測定前腦基底部神經核中膽鹼能和非膽鹼能神經元的任何可能的損失。
將前腦切片在以含有0.1％triton、X-100的0.01M磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)配製的1.0μg/ml最終ChAT抗體濃度(1∶50)中作自由漂浮孵育。然後對前腦切片進行修整，並在培養板中，以第一抗體在室溫下孵育24小時(4片/300μl/孔)。
在PBS中洗4次後，將這些切片在第二抗體(馬抗小鼠IgG、VectorLaboratories，Burlingame，CA)中37℃孵育1小時。在PBS中洗3次後，以小鼠親合素-生物素-過氧化物酶複合物(ABC)(Vector)技術(Hsu et al，J.Histochem.Cytochem29，1981，577-580)將切片在37℃孵育2小時。用PBS洗3次，用0.1M Tris緩衝鹽水(TBI)洗1次之後，藉助於Shu et al，Neurosci.Lert.85 1988，169-171所述的葡萄糖氧化酶-二氨基聯苯胺-鎳法、對自由漂浮的切片進行處理。通過將切片轉移到TBS中使反應停止。將切片鋪裱在明膠-鉻明礬塗布的載玻片上，並使之在室溫下乾燥過夜，在遞增濃度的乙醇和二甲苯中進行脫水，然後以Permount作蓋玻片封片。
用微型計算機圖象處理系統(MCID)(Imaging Research Inc.Ontario.Canada)，對中隔核(MSN)，對角帶頂葉核(VDB)和外側基底核中的ChAT免疫反應性神經元進行計數。把MSN和VDB之間的界面定義為前連合。NMB被定義為位於黃白球和內囊鄰接部中的免疫標記神經元。從每隻動物，對通過前腦各神經核0.2mm間隔得到的切片進行細胞計數。對於每個前腦神經核，細胞數目以每10000μm2的組平均數表示。
對於以結晶紫染色的平行切片，其MSN，VDB和NMB中的神經元也通過MCID進行計數。因為在全部膽鹼能和非膽鹼能神經元中，整個這些區域被結晶紫染色的神經元數量很多，所以，對每個神經核進行雙側樣品神經元計數。將預先確定面積和網狀方格尺用於每個神經核的細胞計數。對於MSN和VDB核，對每側3個2000μm2的區域進行計數(這樣，在被計數的4片切片中的每片切片，每個神經核取樣的取樣的總面積為12000μm2)。對於NMB，每側計數一個12000μm2的區域(在被計數的4片切片中的每片切片，計數的總面積＝24000μm2)。僅對具有明顯體細胞Nissi體的，並具有非常典型神經元細胞核的大細胞(直徑＞20μm)作定量測定。結果TBI後，在受損傷的任何動物之間，翻正反射的抑制沒有顯著差異。這表明，在每次實驗中，損傷組動物受到了同等程度的損傷。假損傷動物的翻正動作顯著地快於TBI的任何動物(每一比較中P＜0.0001)。假損傷組動物翻正反射的抑制是由於損傷前所用的氣體麻醉引起的。
在受傷組的任何動物之間，TBI後體重下降沒有顯著差異，再次表明受傷組動物有同等的損傷程度。
受損傷組的任何動物之間，在受損傷後1-5天旋轉杆的能力沒有顯著差異。因為是在損傷後1-15天給予待測化合物，所以這些試驗也表明，該藥物對損傷後的體重或旋轉杆能力沒有影響。
ANOVA分析表明，每日以待測化合物注射(皮下)治療的受損傷動物，在Morris水迷宮中比注射鹽水治療的受損傷動物有更好的表現。以待測化合物15μmol/kg治療的受損傷動物，具有顯著改善的能力，P＜0.01。
對於分別以鹽水和待測化合物治療的大鼠，TBI都引起了VDB和NMB中ChAT-1R神以元數量顯著減少。但是，本發明化合物顯著地降低了ChAT-1R神經元的損傷退化性減少(VDB中，與鹽水治療的受損傷組相比較，降低了32％，NMB中降低於51％)。結晶紫染色的平行切片顯示，MSN，VDB或NMB中細胞數目未減少，表明ChAT-1R神經元的損失並不是由於細胞死亡所致。
製劑實施例本發明的藥物製劑可通過本領域常規的方法製備。
例如片劑可通過將活性成分與通常的佐劑和/或稀釋劑混合，然後在常用的壓片機內將此混合物壓片。佐劑或稀釋劑的實例包括玉米澱粉，乳糖，滑石粉，硬脂酸鎂，明膠，樹膠等等。任何其它的佐劑或添加的色素，香料，防腐劑等，只要它們與該活性成分是可配伍的都可加入。
注射液可通過如下程序製備先將活性成分和可能的添加劑溶解於部分賦形劑中，優選的賦形劑是無菌水，並將此溶液校準至所需的體積，再將此溶液滅菌，然後灌裝入適當的安瓿或藥瓶中。還可以加入本領域常規使用的任何適合的添加劑，如滲壓調節劑，防腐劑，抗氧化劑等。
本發明製劑的典型製劑實例如下(活性成分的量是以游離鹼計算)1)片劑5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氫-120mg-甲基吡啶乳糖60mg玉米澱粉30mg羥丙基纖維素2.4mg微晶纖維素 19.2mgA型Croscarmellose鈉 2.4mg硬脂酸鎂0.84mg2)片劑5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氫-110mg-甲基吡啶乳糖46.9mg玉米澱粉23.5mg聚烯吡酮1.8mg微晶纖維素 14.4mgA型Croscarmellose鈉 1.8mg硬脂酸鎂0.63mg3)糖漿劑5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氫-15.0mg-甲基吡啶山梨醇 500mg羥丙基纖維素15mg甘油50mg對羥苯甲酸甲酯 1mg對羥苯甲酸丙酯 0.1mg乙醇0.005ml芳香劑 0.05mg糖精鈉 0.5mg水 加至1ml4)溶液5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氫-11.0mg-甲基吡啶山梨醇 5.1mg乙酸0.08mg注射用水加至1ml
權利要求
1. 5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶或其可藥用的酸加成鹽在製備用於治療創傷性腦損傷藥劑中的應用。
2.根據權利要求1的應用，其特徵在於所製備的藥劑含有單位劑量形式的5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶或其可藥用的酸加成鹽。
3.根據權利要求1的應用，其特徵在於所製備的藥劑含有500μg-600mg/日，優選地為1.0mg-100mg/日劑量的5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氫-1-甲基吡啶或其可藥用的酸加成鹽。
4.根據權利要求1-3中任一權項的應用，其特徵在於所製備的藥劑用於治療由作用於腦底或脊柱的物理力，局部缺血，中風，呼吸停止，心跳停止，腦血栓形成或栓塞，AIDS所致神經障礙，大腦出血，腦脊髓炎，腦積水，術後事件，腦感染，震蕩或顱內壓升高所引起的創傷性腦損傷，和/或用於治療這樣一種病症的後遺症。
全文摘要
式(Ⅰ)化合物5－(2－乙基－2H－四唑－5－基)－1,2,3,6－四氫－1－甲基吡啶,能改善創傷性腦損傷動物的識別能力,並能降低膽鹼能神經元損傷退化性減少,因此可用於製備治療創傷性腦損傷的藥劑。
文檔編號A61K31/44GK1207039SQ9619946
公開日1999年2月3日 申請日期1996年11月5日 優先權日1996年11月5日
發明者B·R·派克 申請人:H·隆德貝克有限公司