高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體、細胞系、方法及其組成的生產系統的製作方法

2023-07-10 03:35:26

專利名稱：高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體、細胞系、方法及其組成的生產系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體、細胞系、方法及其組成的生產系統，屬於病毒基因工程領域。
背景技術：
在基因治療研究中，rAAV載體由於其宿主範圍廣、副作用小、可介導目的基因長時間穩定表達等特點而獲得廣泛應用。但是rAAV大規模製備是限制其在基因治療中廣泛應用的主要因素，這可以從提高單個細胞產生病毒顆粒數目和培養大量生產病毒的細胞來大規模製備rAAV。
目前的生產技術中，利用哺乳動物細胞，病毒的產量一般僅100病毒顆粒/細胞。經過大量優化後，病毒產量可達104病毒顆粒/細胞，但是生產用的細胞系主要是人胚腎293細胞等貼壁細胞，這些細胞大規模培養比較困難，因此重組病毒仍難以進行大規模生產。近年來有研究者使用杆狀病毒表達AAV輔助蛋白，在昆蟲細胞中生產rAAV病毒，據報導可達105/細胞。昆蟲細胞系(如Sf9細胞)適合懸浮培養，可以在細胞培養罐中大量培養，有利於rAAV病毒的大規模生產。目前使用的昆蟲系統中，需要使用三個重組杆狀病毒載體，分別表達rAAV的Rep、Cap及ITR，其感染過程仍較繁雜。

發明內容
本發明的第一個目的是提供高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體。
本發明的另一個目的是提供高效生產重組腺病毒伴隨病毒的細胞。
本發明的第三個目的是提供高效生產重組腺病毒伴隨病毒方法。
本發明的第四個目的是提供高效生產重組腺病毒伴隨病毒的生產系統。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體，該病毒載體為重組杆狀病毒載體，在該載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列這三者中的一個或幾個，其中ITR序列間均包含真核啟動子、多克隆位點或目標基因。
杆狀病毒目前常用的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcMNPV和家蠶杆狀病毒BmPV，本發明所使用的是苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcMNPV。使用杆狀病毒，可以在昆蟲細胞中高效、按比例的表達腺相關病毒的有關蛋白；ITR序列提供了腺病毒相關病毒的包裝信號、整合啟動子、以及可克隆外源基因的多克隆位點；Rep提供了腺病毒相關病毒複製所需的酶；Cap基因提供了病毒包裝所需的結構蛋白。
所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Cap基因。
所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Rep基因和Cap基因。
所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的ITR序列。
所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Cap基因和ITR序列。
所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Rep基因、Cap基因和ITR序列。
一種高效生產重組腺病毒伴隨病毒的細胞系，該細胞係為整合昆蟲細胞系，在該細胞系的染色體中整合有腺病毒伴隨病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列這三者中的一個或幾個，其中ITR序列間均包含真核啟動子、多克隆位點或目標基因。昆蟲細胞系是杆狀病毒的主要宿主細胞，容易培養，有利於提高重組腺病毒相關病毒的生產效率和產量；目前常用的有3個細胞株Sf9和Sf21以及High-FiveTM，都是商業化的細胞系。將腺病毒相關病毒的有關序列整合到昆蟲細胞的染色體上後可避免反覆使用重組杆狀病毒感染昆蟲細胞。
所述的整合昆蟲細胞系的染色體上整合有腺病毒伴隨病毒的Rep基因。
所述的整合昆蟲細胞系的染色體上整合有腺病毒伴隨病毒的ITR序列。
所述的整合昆蟲細胞系的染色體上整合有腺病毒伴隨病毒的Rep基因和ITR序列。
一種高效生產重組腺病毒伴隨病毒的方法，利用上述重組杆狀病毒載體感染昆蟲細胞系或利用上述重組杆狀病毒載體感染上述整合昆蟲細胞系，高效生產重組腺病毒伴隨病毒。所述的杆狀病毒載體為苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcMNPV。
利用上述方法得到的高效生產重組腺病毒伴隨病毒生產系統，該系統由重組杆狀病毒載體和昆蟲細胞系組成，或由重組杆狀病毒載體和整合昆蟲細胞系組成。所述的杆狀病毒載體為苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcMNPV。
所述的重組腺病毒伴隨病毒生產系統由昆蟲細胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、構建有腺病毒伴隨病毒Rep基因和Cap基因的杆狀病毒載體和構建有腺病毒伴隨病毒ITR序列的杆狀病毒載體組成。
所述的重組腺病毒伴隨病毒生產系統由昆蟲細胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和構建有腺病毒伴隨病毒Rep基因、Cap基因和ITR序列的杆狀病毒載體組成。
所述的重組腺病毒伴隨病毒生產系統由整合有腺病毒伴隨病毒Rep基因的整合昆蟲細胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和構建有腺病毒伴隨病毒Cap基因和ITR序列的杆狀病毒載體組成。
所述的重組腺病毒伴隨病毒生產系統由整合有腺病毒伴隨病毒ITR序列的整合昆蟲細胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和構建有腺病毒伴隨病毒Rep基因和Cap基因的杆狀病毒載體組成。
本發明的優點是所使用的重組杆狀病毒在細胞系中能自行繁殖，可大量提供生產rAAV所需蛋白質或基因組；昆蟲細胞系適合懸浮大量培養，大大降低了生產成本；使用一個或兩個重組杆狀病毒感染昆蟲細胞系生產rAAV，更簡便易行；同時該體系通過調節有關基因、蛋白質的數量或表達時間，可大大提高生產rAAV的效率。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步說明，並非對本發明的限定。


圖1為載體pBac-Cap質粒構建圖。
圖2為載體pBac-RC質粒構建圖。
圖3為載體pBac-ITR質粒構建圖。
圖4為載體pBac-Cap-ITR質粒構建圖。
圖5為載體pBac-Cap-Rep-ITR(pAllinOne)質粒構建圖。
圖6為載體pIB-Rep質粒構建圖。
圖7為載體pIB-Cap-Rep質粒構建圖。
圖8為載體pIB-ITR質粒構建圖。
圖9為rAAV-LacZ感染人胚腎293細胞後LacZ表達檢測圖。
具體實施例方式
實施例1、攜帶和表達AAV cap基因的重組杆狀病毒rBac-Cap的構建1、通過DNA合成儀(Applied BioSystem 373A)合成下列引物PCapA5』CGGGATCCTGTTAAGACGGCTGCCGACGGTTATCTACCCGATTGGCTC，其中斜體為BamHI位點，下劃線為突變點。第一個ATG突變為ACG以降低VP1的表達水平；第二個讀框錯位的ATG突變為ACG，以消除對下遊VP2及VP3表達的影響。
PCapB5』ACAAGCTTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGG，其中斜體為HindIII位點，下劃線為終止密碼。
2、以質粒pAAV-RC(Stragagene公司產品)為模板，採用Roche高保真PCR體系進行PCR擴增，獲得AAV-2的Cap基因。反應條件如下模板1ng，引物P1和P2各100ng，dNTP 0.25mmol/L，反應緩衝液10微升，酶2.5單位，補去離子水至100微升。採用美國PE公司9600型PCR儀進行PCR反應(94℃ 30秒，50℃30秒，72℃ 3分，共擴增30循環。經瓊脂糖電泳獲得2.3kb DNA片段。
3、上述獲得的DNA片段及載體質粒pFastBacDual(invitrogen公司產品)各200ng用BamHI+HindIII(均為Promega公司產品)進行酶切，回收片段用T4 DNA連接酶(Promega公司產品)連接，16℃ 6小時後，按分子克隆所述條件轉化大腸桿菌DH5α，塗氨苄抗性平板，篩選正確的質粒，獲得可表達AAV Cap蛋白的質粒載體pBac-Cap.質粒的構建見圖1。
4、質粒pBac-Cap 1ng與100μl感受態大腸桿菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分後42℃熱激活45秒，立即冰浴2分鐘，加900μl SOC培養基(見分子克隆)，37℃培養1小時後塗平板(含50μg/ml卡那黴素，7μg/ml慶大黴素，10μg/ml四環素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司產品)和40μg/ml IPTG)。37℃培養48小時後挑取白色的菌落進行分析。鑑定正確的陽性克隆接種至含有上述抗生素的LB液體培養基中過夜培養，用Invitrogen公司的MidPrep試劑盒進行質粒抽提，獲得重組杆狀病毒載體DNA。
5、上述質粒DNA用Cellfectin試劑(Invitrogen公司)轉染Sf9細胞(按試劑盒說明書進行)，轉染後細胞培養於Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen公司)，在27℃培養72小時，收集含重組杆狀病毒(r Bac-Cap)的上清。
實施例2、攜帶和表達AAV cap\rep基因的重組杆狀病毒rBac-RC的構建本實施例的主要目的是在同一個Bac載體上同時表達AAV的Cap基因和複製相關基因Rep基因。
1、通過ABI 381 DNA合成儀合成下列DNA片段P52ATCCA CCCGGGATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCG，其中斜體為SmaI位點。
P52BTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGATCAGAGAGAGTGTCCTCGAGCCAAT斜體為與BGH polyA信號5』引物互補序列。
BGHACTCTCTGA TCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCA，斜體為與Rep52互補序列。
BGHBGGCGTTATCGTTTATTGCCATAGAGCCCACCGCATCC斜體為與IEPromoter互補序列。
IE promoterIE1GGATGCGGTGGGCTCTATGGCAATAAACGATAACGCCGTTGGTGGCGTGAGGCATGTAAAAGGTTACATCATTATCTTGTTCATCCGGTTGIE2CAAAAACCAACATGAACGTCTATTTATACCAACCGGATGAACAAGATAATGATGTAACIE3GTATAAATAGACGTTCATGTTGGTTTTTGTTTCAGTTGCAAGTTGGCTGCGGCGCGCG CAG CACCTTTAGCCATGGCGGGGTTTTACG4GATTG，斜體為與Rep78互補序列。
P78AAGCCATGGCGGGGTTTTACGAGATTGP78BCGGAATTCCGCTAGCCACCACTGTCTTATTCCTTC，斜體為NheI位點2、以質粒pAAV-RC 1ng為模板，分別以引物P52A+P52B，P78A+P78B進行PCR擴增(條件同實施例1)，擴增出AAV 2的Rep52基因和Rep78基因；以質粒pCDNA3.1/Myc-His(Invitrogen公司產品)1ng為模板，用引物PBHGH1和PBGH2進行PCR擴增，獲得BGH的Poly A信號序列；將上述序列進行瓊脂糖電泳，切割含DNA片段的條帶，使用QIAGEN的Gel Extraction Kit回收DNA片段，上述片段各5ng，，加入合成的IE啟動之片段(IE1，IE2，IE3)各5ng，以上述混合片段為模板，使用P52A和P78B為引物進行PCR擴增，獲得含有Rep52及其BGHpolyA信號、帶缺失突變的IE啟動子及Rep78基因的DNA片段。
上述片段及由例一所構建的質粒pBac-Cap均用SmaI+NheI酶切，並如例1用T4 DNA連接酶連接，構建可表達AAV Cap蛋白和Rep蛋白的杆狀病毒載體。質粒的構建過程見圖2。
3、質粒pBac-RC 1ng與100μl感受態大腸桿菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分後42℃熱激活45秒，立即冰浴2分鐘，加900μl SOC培養基(見分子克隆)，37℃培養1小時後塗平板(含50μg/ml卡那黴素，7μg/ml慶大黴素，10μg/ml四環素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司產品)和40μg/ml IPTG)。37℃培養48小時後挑取白色的菌落進行分析。鑑定正確的陽性克隆接種至含有上述抗生素的LB液體培養基中過夜培養，用Invitrogen公司的MidPrep試劑盒進行質粒抽提，獲得重組杆狀病毒載體DNA。
4、上述質粒DNA用Cellfectin試劑(Invitrogen公司)轉染Sf9細胞(按試劑盒說明書進行)，轉染後細胞培養於Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen公司)，在27℃培養72小時，收集含重組杆狀病毒(r Bac-RC)的上清。
實施例3、攜帶AAV ITR序列的重組杆狀病毒rBac-ITR的構建1、載體質粒pFastBacDual(invitrogen公司產品)各200ng用Sma I+Stu I(均為Promega公司產品)進行酶切，回收大片段；用Pci I和Sfo I酶切pAAV-MCS(Stratagene)，Klenow酶補平，電泳回收攜帶ITR的片段，將兩個回收片段用T4 DNA連接酶(Promega公司產品)連接，構建攜帶腺相關病毒ITR序列的杆狀病毒載體。質粒的構建過程見圖3。
2、16℃ 6小時後，按分子克隆所述條件轉化大腸桿菌DH5α，塗氨苄抗性平板，篩選正確的質粒，獲得質粒載體pBac-ITR。
3、質粒pBac-ITR1ng與100μl感受態大腸桿菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分後42℃熱激活45秒，立即冰浴2分鐘，加900μl SOC培養基(見分子克隆)，37℃培養1小時後塗平板(含50μg/ml卡那黴素，7μg/ml慶大黴素，10μg/ml四環素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司產品)和40μg/ml IPTG)。37℃培養48小時後挑取白色的菌落進行分析。接種至含有上述抗生素的LB液體培養基中培養24小時，用Invitrogen公司的MidPrep試劑盒進行質粒抽提，獲得重組杆狀病毒載體DNA。
4、上述質粒DNA用Cellfectin試劑(Invitrogen公司)轉染Sf9細胞(按試劑盒說明書進行)，轉染後細胞培養於Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen公司)，在27℃培養72小時，收集含重組杆狀病毒(r Bac-ITR)的上清。實施例4、攜帶和表達AAV基因的重組杆狀病毒rBac-Cap-ITR的構建1、質粒pBac-Cap用Avr II酶切，Klenow酶補平；Pci I和Sfo I酶切pAAV-MCS，Klenow酶補平，電泳回收攜帶ITR的片段，將兩個回收片段用T4 DNA連接酶(Promega公司產品)連接，構建攜帶ITR序列並表達Cap蛋白的杆狀病毒載體。質粒的構建過程見圖4。
2、16℃ 6小時後，按分子克隆所述條件轉化大腸桿菌DH5α，塗氨苄抗性平板，篩選正確的質粒，獲得質粒載體pBac-Cap-ITR。
3、質粒pBac-Cap-ITR 1ng與100μl感受態大腸桿菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分後42℃熱激活45秒，立即冰浴2分鐘，加900μl SOC培養基(見分子克隆)，37℃培養1小時後塗平板(含50μg/ml卡那黴素，7μg/ml慶大黴素，10μg/ml四環素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司產品)和40μg/ml IPTG)。37℃培養48小時後挑取白色的菌落進行分析。接種至含有上述抗生素的LB液體培養基中培養24小時，用Invitrogen公司的MidPrep試劑盒進行質粒抽提，獲得重組杆狀病毒載體DNA。
4、上述質粒DNA用Cellfectin試劑(Invitrogen公司)轉染Sf9細胞(按試劑盒說明書進行)，轉染後細胞培養於Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen公司)，在27℃培養72小時，收集含重組杆狀病毒(r Bac-Cap-ITR)的上清。
實施例5、重組杆狀病毒rBac-Cap-Rep-ITR(rBac-AllinOneAAV)的構建1、質粒pBac-RC用Avr II酶切，Klenow酶補平；pAAV-MCS(LacZ或目的基因插入)用Pci I和Sfo I酶切，Klenow酶補平，回收帶ITR的基因片段，與質粒pBac-RC酶處理的片段連接酶連接。用連接產物轉化大腸桿菌DH5α，篩選出陽性重組克隆，命名為pAllinOneAAV，提取其質粒DNA備用。質粒構建如圖5。
2、質粒pAllinOneAAV 1ng與100μl感受態大腸桿菌Max Efficiency DH10Bac混合，冰浴30分後42℃熱激活45秒，立即冰浴2分鐘，加900μl SOC培養基(見分子克隆)，37℃培養1小時後塗平板(含50μg/ml卡那黴素，7μg/ml慶大黴素，10μg/ml四環素，100μg/ml BluoGal(Invitrogen公司產品)和40μg/ml IPTG)。37℃培養48小時後挑取白色的菌落進行分析。接種至含有上述抗生素的LB液體培養基中培養24小時，用Invitrogen公司的MidPrep試劑盒進行質粒抽提，獲得重組杆狀病毒載體DNA。
3、上述質粒DNA用Cellfectin試劑(Invitrogen公司)轉染Sf9細胞(按試劑盒說明書進行)，轉染後細胞培養於Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen公司)，在27℃培養72小時，收集含重組杆狀病毒(r Bac-AllinOneAAV)的上清。
實施例6，穩定表達Rep蛋白的Sf9細胞系構建1、pIB/V5-his載體(Invitrogen公司)用Hind III酶切，Klenow酶補平後，再用Xba I酶切，回收大片段；pBac-RC用Sma I和Nhe I酶切回收Rep基因，與上述處理的載體用DNA連接酶。用連接產物轉化大腸桿菌DH5α，篩選出陽性重組克隆，命名為pIB-Rep，提取其質粒DNA備用。質粒構建如圖6。
2、上述質粒DNA用Cellfectin試劑(Invitrogen公司)轉染Sf9細胞(按試劑盒說明書進行)，轉染後細胞培養於Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen公司)。在27℃培養48小時後，收集細胞並稀釋到1×104細胞/毫升；然後用無抗性的培養基倍比稀釋接種到96孔培養板上，過夜培養後用含適當濃度的抗性培養基篩選抗性克隆(具體操作按照Invitrogen公司的說明書)。最後獲得穩定表達AAV-Rep蛋白的Sf9細胞系，命名為Sf9-Rep。
實施例7、穩定表達AAV-Cap-Rep蛋白的Sf9細胞系構建1、pIB/V5-his載體用BspH I，Klenow酶補平，回收大片段；pBac-Cap質粒用Avr II+Bst1107I酶切，Klenow酶補平後，回收Cap基因，與上述處理的載體用DNA連接酶。用連接產物轉化大腸桿菌DH5α，篩選出陽性重組克隆，命名為pIB-Cap，提取其質粒DNA備用。
2、pIB-Cap-K質粒用Hind III酶切，Klenow酶補平後，XbaI酶切，回收大片段；Rep52-Rep78 PCR擴增產物用Sma I+Nhe I酶切回收大片段，與前面處理的pIB-Cap-K質粒載體用DNA連接酶連接。用連接產物轉化大腸桿菌DH5α，篩選出陽性重組克隆，命名為pIB-Cap-Rep，提取其質粒DNA備用。質粒構建如圖7。
3、上述質粒DNA用Cellfectin試劑(Invitrogen公司)轉染Sf9細胞(按試劑盒說明書進行)，轉染後細胞培養於Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen公司)。在27℃培養48小時後，收集細胞並稀釋到1×104細胞/毫升；然後用無抗性的培養基倍比稀釋接種到96孔培養板上，過夜培養後用含適當濃度的抗性培養基(篩選抗性克隆(具體操作按照Invitrogen公司的說明書)。最後獲得穩定表達AAV-Cap-Rep蛋白的Sf9細胞系，命名為Sf9-Cap-Rep。
實施例8、穩定攜帶AAV-ITR的Sf9細胞系構建1、pIB/V5-his載體用EcoR V酶切；Pci I和Sfo I酶切pAAV-MCS，Klenow酶補平，電泳回收攜帶ITR的片段，將回收片段與載體用T4 DNA連接酶(Promega公司產品)連接，16℃ 6小時後，按分子克隆所述條件轉化大腸桿菌DH5α，塗氨苄抗性平板，篩選正確的質粒，獲得質粒載體pIB-ITR。提取其質粒DNA備用。質粒構建如圖8。
2、上述質粒DNA用Cellfectin試劑(Invitrogen公司)轉染Sf9細胞(按試劑盒說明書進行)，轉染後細胞培養於Grace’s昆蟲細胞培養基(Invitrogen公司)。在27℃培養48小時後，收集細胞並稀釋到1×104細胞/毫升；然後用無抗性的培養基倍比稀釋接種到96孔培養板上，過夜培養後用含適當濃度的抗性培養基篩選抗性克隆(具體操作按照Invitrogen公司的說明書)。最後獲得穩攜帶AAV-ITR的Sf9細胞系，命名為Sf9-ITR。
實施例9、重組AAV病毒顆粒的生產1、材料r Bac-RC、r Bac-ITR、和High-FiveTM細胞2、方法用Grace’s培養基，10％胎牛血清，在27-28℃條件下培養High-FiveTM(Invitrogen公司)昆蟲細胞，在生長至80％單層時，用構建的重組杆狀病毒(rBac-RC與r Bac-ITR)以2 M.O.I共感染昆蟲細胞，在27℃培養72小時後，收集細胞及上清。通過凍融破碎，12000g離心去除細胞碎片，上清加入PEG8000至終濃度為10％，12000g離心獲得病毒顆粒沉澱，經氯化銫密度梯度離心，發現在密度為1.37g/ml分離的病毒顆粒是重組AAV顆粒。按照Stratagene公司AAV效價測定步驟測定重組AAV的效價，結果表明每細胞可達2×104病毒顆粒。
實施例10、重組AAV病毒顆粒的生產1、材料r Bac-AllinOneAAV和Sf21細胞2、方法培養Sf21昆蟲細胞，在合適的生長密度條件下，用構建的重組杆狀病毒(rBac-AllinOneAAV)感染昆蟲細胞，在27℃培養72小時後，收集細胞及上清。通過凍融破碎，12000g離心去除細胞碎片，上清加入PEG8000至終濃度為10％，12000g離心獲得病毒顆粒沉澱，經氯化銫密度梯度離心，發現在密度為1.37-1.4g/ml分離的病毒顆粒是重組AAV顆粒。按照Stratagene公司AAV效價測定步驟測定重組AAV的效價，結果表明每細胞可達4×104病毒顆粒。
實施例11、重組AAV病毒顆粒的生產1、材料r Bac-Cap-ITR和Sf9-Rep細胞2、方法r Bac-Cap和r Bac-ITR共感染Sf9-Rep昆蟲細胞系生產rAAV病毒載體，具體操作同實施例10。結果表明每細胞可達105病毒顆粒。
實施例12、重組AAV病毒顆粒的生產1、材料rBac-RC，r Bac-Cap，r Bac-Rep和Sf9-ITR細胞2、方法r Bac-Rep和r Bac-Cap共感染Sf9-ITR昆蟲細胞系生產rAAV病毒載體，具體操作同實施例10。
r Bac-RC感染Sf9-ITR昆蟲細胞系生產rAAV病毒載體，具體操作同實施例10。結果表明每細胞可達4×104病毒顆粒。
實施例13、昆蟲細胞生產的攜帶β-半乳糖苷酶基因的AAV感染人胚腎293細胞在上述實施例中ITR之間的多克隆位點上均插入LacZ基因作為報告基因，因為產生的rAAV均攜帶LacZ基因。檢測LacZ基因的表達情況可以反應我們生產的rAAV滴度和生產系統的效率。
用在昆蟲細胞中生產的rAAV-LacZ顆粒，感染培養的293細胞，用X-gal染色24小時後，照相，結果見圖9。
結果顯示，杆狀病毒生產的rAAV-LacZ感染人胚腎293細胞可以檢測到LacZ的表達。
權利要求
1.一種高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體，其特徵在於該病毒載體為重組杆狀病毒載體，在該載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列這三者中的一個或幾個，其中ITR序列間均包含真核啟動子、多克隆位點或目標基因。
2.一種高效生產重組腺病毒伴隨病毒的細胞系，其特徵在於該細胞係為整合昆蟲細胞系，在該細胞系的染色體中整合有腺病毒伴隨病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列這三者中的一個或幾個，其中ITR序列間均包含真核啟動子、多克隆位點或目標基因。
3.一種高效生產重組腺病毒伴隨病毒的方法，利用權利要求1所述的重組杆狀病毒載體感染昆蟲細胞系或利用權利要求1所述的重組杆狀病毒載體感染權利要求2所述的整合昆蟲細胞系，高效生產重組腺病毒伴隨病毒。
4.根據權利要求3所述的方法得到的高效生產重組腺病毒伴隨病毒生產系統，其特徵在於該系統由重組杆狀病毒載體和昆蟲細胞系組成，或由重組杆狀病毒載體和整合昆蟲細胞系組成。
5.根據權利要求1所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體，其特徵在於所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Cap基因。
6.根據權利要求1所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體，其特徵在於所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Rep基因和Cap基因。
7.根據權利要求1所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體，其特徵在於所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的ITR序列。
8.根據權利要求1所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體，其特徵在於所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Cap基因和ITR序列。
9.根據權利要求1所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體，其特徵在於所述的重組杆狀病毒載體中構建有腺病毒伴隨病毒的Rep基因、Cap基因和ITR序列。
10.根據權利要求2所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的細胞系，其特徵在於所述的整合昆蟲細胞系的染色體上整合有腺病毒伴隨病毒的Rep基因。
11.根據權利要求2所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的細胞系，其特徵在於所述的整合昆蟲細胞系的染色體上整合有腺病毒伴隨病毒的ITR序列。
12.根據權利要求2所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的細胞系，其特徵在於所述的整合昆蟲細胞系的染色體上整合有腺病毒伴隨病毒的Rep基因和ITR序列。
13.根據權利要求4所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒生產系統，其特徵在於所述的重組腺病毒伴隨病毒生產系統由昆蟲細胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、構建有腺病毒伴隨病毒Rep基因和Cap基因的杆狀病毒載體和構建有腺病毒伴隨病毒ITR序列的杆狀病毒載體組成。
14.根據權利要求4所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒生產系統，其特徵在於所述的重組腺病毒伴隨病毒生產系統由昆蟲細胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和構建有腺病毒伴隨病毒Rep基因、Cap基因和ITR序列的杆狀病毒載體組成。
15.根據權利要求4所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒生產系統，其特徵在於所述的重組腺病毒伴隨病毒生產系統由整合有腺病毒伴隨病毒Rep基因的整合昆蟲細胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和構建有腺病毒伴隨病毒Cap基因和ITR序列的杆狀病毒載體組成。
16.根據權利要求4所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒生產系統，其特徵在於所述的重組腺病毒伴隨病毒生產系統由整合有腺病毒伴隨病毒ITR序列的整合昆蟲細胞系Sf9或Sf21或High-FiveTM、和構建有腺病毒伴隨病毒Rep基因和Cap基因的杆狀病毒載體組成。
17.根據權利要求1、或5、或6、或7、或8、或9所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體，其特徵在於所述的杆狀病毒載體為苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcMNPV。
18.根據權利要求3所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒的方法，其特徵在於所述所述的杆狀病毒載體為苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcMNPV。
19.根據權利要求4、或13、或14、或15、或16所述的高效生產重組腺病毒伴隨病毒生產系統，其特徵在於所述的杆狀病毒載體為苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcMNPV。
全文摘要
本發明公開了一種高效生產重組腺病毒伴隨病毒的病毒載體、細胞系、方法及其組成的生產系統。病毒載體為重組杆狀病毒載體，細胞係為整合昆蟲細胞系，在載體和細胞系中構建或整合有腺病毒伴隨病毒的Cap基因、Rep基因和ITR序列這三者中的一個或幾個，其中ITR序列間均包含真核啟動子、多克隆位點或目標基因。用重組杆狀病毒感染昆蟲細胞系或整合昆蟲細胞系，高效生產重組腺病毒伴隨病毒。高效生產重組腺病毒伴隨病毒生產系統，由重組杆狀病毒和昆蟲細胞系組成，或由重組杆狀病毒和整合昆蟲細胞系組成。其優點是重組杆狀病毒能自行繁殖，大量提供生產rAAV所需蛋白質或基因組；昆蟲細胞系適合懸浮大量培養，降低生產成本；方法簡便易行，同時提高生產效率。
文檔編號C12N15/86GK1570121SQ0315037
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月25日 優先權日2003年7月25日
發明者趙春文, 周志文, 李月娟, 馮宇霞, 魏玲 申請人:北京三諾佳邑生物技術有限責任公司