一種便捷、快速Vero細胞的復甦方法與流程

2023-07-10 21:59:16 1

本發明屬於生物技術應用領域，具體地，涉及一種便捷、快速vero細胞的復甦方法。

背景技術：

細胞培養是生物與健康相關研究領域的一項重要技術。隨著生命科學的迅速發展，目前細胞培養已成為細胞生物學、分子生物學、遺傳學和免疫學等學科研究的重要基礎。為了深入探討細胞的生長活動規律、有關疾病的病理和藥物的藥理（毒理）機制，開發具有不同針對性的細胞培養方法具有重要意義。細胞復甦是培養細胞的一種，是生命及再生醫學領域中廣泛應用的關鍵技術，在研究中往往需要對凍存的細胞進行復甦，從而進行體內外的相關研究。

vero細胞是日本學者1962年從非洲綠猴(cercopithecusaethiopsmonkey)腎建立的猴腎細胞系。其名稱的由來是取自世界語中「綠」字的verde前兩個字母和「腎」字前兩個字母合在一起，但世界語中不允許vere存在，而需以「o」結尾，故命名為「vero」。其第93代被帶到美國nih的過敏與傳染病研究所熱帶病毒研究室，第113代被提交給atcc，編號為atccno.ccl-81。

除了常規的科研需要之外，經過全面的研究鑑定，vero細胞具有胞核學穩定，沒有外源因子汙染和致瘤性的優點，完全符合1987年who關於用於生物製品的傳代細胞的規程要求，並已被who批准可用作疫苗生產的基質。於是，vero細胞小兒麻痺滅活疫苗、小兒麻痺活疫苗、vero細胞狂犬病疫苗相繼在法國被研製出來並獲批准生產。因此，vero細胞的應用前景以及需求量極大。

技術實現要素：

發明目的：本發明提供了一種便捷、快速vero細胞的復甦方法。

技術方案：本發明提供了一種便捷、快速vero細胞的復甦方法，包括以下步驟：將凍存的vero細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出後1min內於37℃搖晃至含有vero細胞專用凍存液的vero細胞液完全融化，將vero細胞液均勻加入到盛有7-9ml新鮮的vero細胞專用培養基的細胞培養皿中，順時針搖晃細胞培養皿3-5下，於37℃，5%co2培養箱中培養；所述vero細胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸5-15份、羥乙基澱粉3-8份、葡萄糖5-15份、維生素e1-5份、20%甘露醇2-10份、丙二醇1-2份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺醯基-2-甲基-1,4-二氮環庚烷0.8-2份和基礎培養基80-90份。本發明所述的便捷、快速vero細胞的復甦方法，復甦操作簡單、快捷，復甦速度快，效率高，復甦後的vero細胞存活率高，細胞生長速度快，細胞狀態好，邊界清晰，可以有利於乳腺癌轉移的相關研究。其中，vero細胞專用凍存液對細胞損傷小，20%甘露醇為滲透性保護液，而(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基)磺醯基-2-甲基-1,4-二氮環庚烷則抑制細胞活動和基因表達，維生素e的抗氧化性好，在保證休眠vero細胞的營養的同時還可以顯著減少對細胞的損傷，提高凍存細胞的存活率，並且在增殖方面也保持很好的狀態。

進一步的，上述的便捷、快速vero細胞的復甦方法，所述vero細胞專用培養基包括70-90%的基礎培養基以及10-30%的胎牛血清。vero細胞專用培養基，組分合理，可以進一步為復甦的細胞的提供營養物質。

進一步的，上述的便捷、快速vero細胞的復甦方法，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82-88份、碳酸氫鈉12-25份、丙酮酸鈉10-16份、人血白蛋白5-9份、氯化鉀35-45份、無水硫酸鎂6-10份、氯化鈉70-78份、無水磷酸二氫鈉10-14份、pha-植物血球凝集素0.4-0.8份、葉酸0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、煙醯胺0.3-0.6份、無水氯化鈣25-35份、硝酸鐵0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸鈉12-16份、d-泛酸鈣0.3-0.6份、酒石酸膽鹼0.6-0.8份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.2-0.4份、鹽酸吡哆辛0.3-0.5份、還原穀胱甘肽0.2-0.6份、膽固醇2-4份、抗壞血酸磷酸酯0.6-1份、聚碳酸酯0.4-0.9份、酚紅鈉1-1.3份和去離子水100份。

進一步的，上述的便捷、快速vero細胞的復甦方法，所述基礎培養基還包括3-8份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5-10份、l-鹽酸胱氨酸3-8份、l-絲氨酸3-6份、甘氨酸1-5份、l-鹽酸組氨酸4-6份、l-異亮氨酸8-20份、l-亮氨酸7-18份、l-鹽酸賴氨酸10-20份、l-甲硫氨酸1-6份、l-苯丙氨酸2-8份、l-蘇氨酸5-15份、l-色氨酸1-3份、l-酪氨酸5-9份和l-纈氨酸8-12份。

進一步的，上述的便捷、快速vero細胞的復甦方法，所述基礎培養基還包括2-5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子2-10份、白介素23-8份、白介素43-6份、白介素141-5份、ifn-γ3-6份和神經白細胞素1-4份。基礎培養基組分合理，營養豐富，富含生長因子，可以為vero細胞培養提供更多的營養物，細胞生長速度快，細胞狀態好，邊界清晰，鏡下觀察透亮、分裂相更多、形態及分散度佳，用於vero細胞的培養以及研究。

進一步的，上述的便捷、快速vero細胞的復甦方法，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。可以有效防止復甦的細胞被汙染。

進一步的，上述的便捷、快速vero細胞的復甦方法，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。青黴素和鏈黴素活性好，效果佳。

有益效果：本發明所述的便捷、快速vero細胞的復甦方法，復甦操作簡單、快捷，復甦速度快，效率高，復甦後的vero細胞存活率高，細胞生長速度快，細胞狀態好，邊界清晰，可以有利於乳腺癌轉移的相關研究。

具體實施方式

下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發明，這些實施例只是為了說明問題，並不是一種限制。

實施例1

一種便捷、快速vero細胞的復甦方法，包括以下步驟：將凍存的vero細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出後1min內於37℃搖晃至含有vero細胞專用凍存液的vero細胞液完全融化，將vero細胞液均勻加入到盛有7ml新鮮的vero細胞專用培養基的細胞培養皿中，順時針搖晃細胞培養皿3下，於37℃，5%co2培養箱中培養。

其中，所述vero細胞專用培養基包括70%的基礎培養基以及30%的胎牛血清。此外，所述vero細胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸5份、羥乙基澱粉3份、葡萄糖5份、維生素e1份、20%甘露醇2份、丙二醇1份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺醯基-2-甲基-1,4-二氮環庚烷0.8份和基礎培養基80份。

進一步的，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉10份、人血白蛋白5份、氯化鉀35份、無水硫酸鎂6份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉10份、pha-植物血球凝集素0.4份、葉酸0.3份、肌醇0.8份、煙醯胺0.3份、無水氯化鈣25份、硝酸鐵0.2份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.3份、酒石酸膽鹼0.6份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.3份、還原穀胱甘肽0.2份、膽固醇2份、抗壞血酸磷酸酯0.6份、聚碳酸酯0.4份、酚紅鈉1份和去離子水100份。

另，所述基礎培養基還包括3份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸3份、甘氨酸1份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸8份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸10份、l-甲硫氨酸1份、l-苯丙氨酸2份、l-蘇氨酸5份、l-色氨酸1份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸8份。

再，所述基礎培養基還包括2份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子2份、白介素23份、白介素43份、白介素141份、ifn-γ3份和神經白細胞素1份。

此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。並且，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。

實施例2

一種便捷、快速vero細胞的復甦方法，包括以下步驟：將凍存的vero細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出後1min內於37℃搖晃至含有vero細胞專用凍存液的vero細胞液完全融化，將vero細胞液均勻加入到盛有9ml新鮮的vero細胞專用培養基的細胞培養皿中，順時針搖晃細胞培養皿5下，於37℃，5%co2培養箱中培養。

其中，所述vero細胞專用培養基包括90%的基礎培養基以及10%的胎牛血清。此外，所述vero細胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸15份、羥乙基澱粉8份、葡萄糖15份、維生素e5份、20%甘露醇10份、丙二醇2份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺醯基-2-甲基-1,4-二氮環庚烷2份和基礎培養基90份。

進一步的，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉16份、人血白蛋白9份、氯化鉀45份、無水硫酸鎂10份、氯化鈉78份、無水磷酸二氫鈉14份、pha-植物血球凝集素0.8份、葉酸0.5份、肌醇1.2份、煙醯胺0.6份、無水氯化鈣35份、硝酸鐵0.4份、丁二酸8份、丁二酸鈉16份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽鹼0.8份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.5份、還原穀胱甘肽0.6份、膽固醇4份、抗壞血酸磷酸酯1份、聚碳酸酯0.9份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎培養基還包括8份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸10份、l-鹽酸胱氨酸8份、l-絲氨酸6份、甘氨酸5份、l-鹽酸組氨酸6份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸18份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸6份、l-苯丙氨酸8份、l-蘇氨酸15份、l-色氨酸3份、l-酪氨酸9份和l-纈氨酸12份。

再，所述基礎培養基還包括5份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子10份、白介素28份、白介素46份、白介素145份、ifn-γ6份和神經白細胞素4份。

此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。並且，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。

實施例3

一種便捷、快速vero細胞的復甦方法，包括以下步驟：將凍存的vero細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出後1min內於37℃搖晃至含有vero細胞專用凍存液的vero細胞液完全融化，將vero細胞液均勻加入到盛有8ml新鮮的vero細胞專用培養基的細胞培養皿中，順時針搖晃細胞培養皿4下，於37℃，5%co2培養箱中培養。

其中，所述vero細胞專用培養基包括80%的基礎培養基以及20%的胎牛血清。此外，所述vero細胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸12份、羥乙基澱粉5份、葡萄糖12份、維生素e3份、20%甘露醇8份、丙二醇1.5份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺醯基-2-甲基-1,4-二氮環庚烷1.2份和基礎培養基88份。

進一步的，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、人血白蛋白6份、氯化鉀40份、無水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、無水磷酸二氫鈉12份、pha-植物血球凝集素0.5份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙醯胺0.5份、無水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽鹼0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、還原穀胱甘肽0.5份、膽固醇3份、抗壞血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.8份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份。

另，所述基礎培養基還包括4份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸8份、l-鹽酸胱氨酸6份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸5份、l-異亮氨酸12份、l-亮氨酸10份、l-鹽酸賴氨酸15份、l-甲硫氨酸3份、l-苯丙氨酸4份、l-蘇氨酸9份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸6份和l-纈氨酸9份。

再，所述基礎培養基還包括3份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子8份、白介素26份、白介素44份、白介素143份、ifn-γ5份和神經白細胞素2份。

此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。並且，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。

實施例4

一種便捷、快速vero細胞的復甦方法，包括以下步驟：將凍存的vero細胞凍存管從液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出後1min內於37℃搖晃至含有vero細胞專用凍存液的vero細胞液完全融化，將vero細胞液均勻加入到盛有7ml新鮮的vero細胞專用培養基的細胞培養皿中，順時針搖晃細胞培養皿5下，於37℃，5%co2培養箱中培養。

其中，所述vero細胞專用培養基包括90%的基礎培養基以及10%的胎牛血清。此外，所述vero細胞專用凍存液以重量組分計，包括以下組分：二甲基亞碸5份、羥乙基澱粉8份、葡萄糖9份、維生素e5份、20%甘露醇2份、丙二醇1份、(s)-(-)-1-(4-氟異喹啉-5-基）磺醯基-2-甲基-1,4-二氮環庚烷1.6份和基礎培養基85份。

進一步的，所述基礎培養基以重量組分計，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉12份、人血白蛋白6份、氯化鉀35份、無水硫酸鎂10份、氯化鈉70份、無水磷酸二氫鈉14份、pha-植物血球凝集素0.4份、葉酸0.4份、肌醇0.9份、煙醯胺0.5份、無水氯化鈣28份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽鹼0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.5份、還原穀胱甘肽0.6份、膽固醇3份、抗壞血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.4份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份。

另，所述基礎培養基還包括3份胺基酸，所述胺基酸以重量組分計，由以下組分組成：l-鹽酸精氨酸5份、l-鹽酸胱氨酸3份、l-絲氨酸5份、甘氨酸3份、l-鹽酸組氨酸4份、l-異亮氨酸20份、l-亮氨酸7份、l-鹽酸賴氨酸20份、l-甲硫氨酸4份、l-苯丙氨酸5份、l-蘇氨酸8份、l-色氨酸2份、l-酪氨酸5份和l-纈氨酸12份。

再，所述基礎培養基還包括4份輔助因子，所述輔助因子以重量組分計，由以下組分組成：重組人鹼性成纖維細胞生長因子2份、白介素23份、白介素45份、白介素143份、ifn-γ6份和神經白細胞素4份。

此外，所述基礎培養基以重量組分計，還包括0.006份青黴素和0.01份的鏈黴素。並且，所述青黴素選自10000u/ml，所述鏈黴素選自10000μg/ml。

以上所述僅是發明的幾個實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護範圍。