應力可調控旋轉式細胞/組織三維培養器及其培養方法
2023-07-10 12:15:01
專利名稱：應力可調控旋轉式細胞/組織三維培養器及其培養方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學工程中組織醫學工程技術中的細胞／組織培養器及其培養方法，特別是涉及一種具有應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器及其培養方法。
細胞培養技術和裝置的發展已有百餘年歷史，但是，90年代中期以前，醫學界未能培養出具有與在體組織功能相同或相似的生物細胞／組織來。其主要原因是不可避免的重力作用使得細胞(或微載體)沉降於培養器底部，這樣細胞在培養器器壁之間的接觸抑制使得所培養的細胞不能真正三維生長，從而限制了細胞功能分化，長不成所需要的組織。另外一般生物化學工程中使用的生物反應器，如藉助於機械攪拌(包括實驗室用的搖瓶、搖床等)或吹入氣體引起強迫對流等方法避免培養物沉降，並改善x營養供應。這種方法在微生物培養(如抗生素生產)中是成功的，但對於哺乳動物細胞培養來說是不適宜的。因為(1)哺乳動物細胞培養比微生物『嬌嫩』得多，機械攪拌造成的流動剪切和直接作用很容易損傷乃至破壞細胞，造成壞死。
(2)機械攪拌造成的流動剪切使得細胞難以(甚至不能)聚集，而細胞聚集是從細胞培養成組織的第一步。
空間微重力環境為細胞三維生長創造了條件，美國宇航局(NASA)從80年代中期著手發展空間生物反應器，90年代初期發展了旋轉式生物反應器(RWV)。在文獻[1]Culturing aFuture，Fall，1998，Microgravity News中有介紹；應用旋轉式生物反應器在低剪應力條件下實現了細胞三維培養，並在1995、1997年兩次太空梭搭載實驗中成功地培養出結腸癌等組織。經組織切片觀察表明它具有和在體組織相似的結構，而且其尺寸比用傳統方法培養的組織大的多，達釐米量級。但是，該裝置是在兩個同步旋轉的同心圓筒之間進行細胞培養，可以利用流體動力學效應，使細胞或微載體懸浮，進行三維培養，而且流動剪應力趨於零。
但從生物力學的觀點來看，過分強調零剪應力對於培養功能高度分化的組織來說違背了生物力學的應力-生長適應性原理，因為(1)生物體內的器官和組織都是在一定力學環境裡發揮其功能的，正常生物條件下，活體器官、組織內的應力(應變)分布應符合該組織、器官功能，而合理的應力分布是誘導細胞分化，長成具有和在體組織相同(或相似)功能的組織的重要條件。
(2)國外和我們關於流體動力對血管內皮細胞生長的影響的研究均表明，在培養細胞的過程中應力是調控細胞結構和功能(基因表達)的一個重要的因素。在細胞離體培養過程中，力學環境不僅影響細胞的聚集、粘附(細胞-細胞，細胞-基質表面等)，還影響其微結構和基因表達，進而影響細胞間通訊和功能分化。合理的力學環境將誘導、維持、促進並優化細胞的分化，形成一定的結構，長成具有特定功能的組織。
(3)實驗表明(i)細胞生長過程中必然在周圍介質裡造成應力(即細胞生長本身將改變自身的力學微環境)。(ii)細胞生長引起的應力導致周圍生物大分子排列有序化，可見應力是細胞間通訊的重要內容，也是細胞功能分化、進行組織構建的一個重要的信號系統。
另外，以1997年進行的軟骨培養實驗為例，如表1所示，儘管地面上用RWV培養的關節軟骨GAG的含量及集合強度與天然軟骨無統計差異，但細胞含量及動力學剛度與天然軟骨有顯著差異。前者和軟骨組織的活性密切相關，而後者則是關節軟骨的功能的重要表徵。關節軟骨是承受動力學載荷的組織，故從生物力學觀點來看，造成RWV系統培養的關節軟骨和天然軟骨這種重大差異的主要原因在於RWV系統中的應力不能滿足誘導並節軟骨功能分化的需要。
表1 RWV系統在地基和空間培養的軟骨組織的若干性能參數與天然軟骨的比較
*表示達到同一水平供一種既可滿足細胞三維生長條件，又可隨著培養過程中細胞生長，聚集、功能分化的需要來調控培養介質應力水平(從零剪應力到所培養細胞／組織的生理應力)以創造一個合理的力學環境，來誘導細胞功能定向分化的，生長成一定結構的、具有特定功能的細胞／組織的可對應力分布進行有效調控的應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器。
本發明的目的是這樣實現的本發明提供的應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器，包括由氣室、細胞培養室、培養液流動室三層同心圓筒套裝構成的培養器主體、底座上固定的支架、由馬達和變速器組成的傳動機構，供液-排液及供氣-排氣系統，其特徵在於筒壁上設有簍孔的內筒外表面上貼敷有液／液交換膜，其內腔為培養液流動室，筒壁上設有簍孔的中筒外表面上貼敷有氣／液交換膜，其內腔為細胞培養室，外室筒壁上設有進氣孔和出氣孔，其內腔為氣室，作為氣室的外筒固定在支架上，不作軸向旋轉，而作為培養液流動室的內筒和作為細胞培養室的中筒分別由各自的由馬達和變速器組成的傳動機構驅動作軸向旋轉，其軸向旋轉的角速度相同或不同，作為培養液流動室的內筒中同心地設置一根端部超出培養液流動室筒壁上設置的液／液交換膜軸向邊緣的細長培養液流動管，其進口端的內筒上安裝一與支架固定的隔離器，隔離器為一空心圓柱體，其內部徑向設置與其中心線垂直的培養液進口和代謝物出口，培養液進口和代謝物出口中分別安裝進液管和代謝物出液管，進液管與內筒中設置的培養液流動管相連通，代謝物出液管與內筒中培養液流動管管外的空腔，即代謝物環形回流通道相連通，隔離器中培養液進口和代謝物出口之間設置將其密封隔開的密封圈；供氣-排氣系統包括氣源、氣泵及輸氣管道，與氣泵相連的輸氣管道與外筒上的進氣口相連通；供液-排液系統包括培養液儲液器、液泵及輸液管道，與液泵相連的輸液管道與隔離器上的培養液進液管相連通。所述的氣源與氣室相連的輸氣管道上設有穩壓、調壓閥，氣室的出氣口通過輸氣管道連接餘氣收集器；隔離器上的代謝物出液管通過輸液管道連通阻尼器，阻尼器出口連通培養液透析器，培養液透析器出口分別連通代謝物收集器和氣／液交換器，氣／液交換器連通培養液儲液器，儲液器出口通過輸液管道與隔離器上的進液管相連通。
使用上述應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器進行細胞／組織三維培養的方法，按常規培養工藝將培養物、新鮮培養液裝入本發明的應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器內，培養條件與常規工藝的培養條件相同，其特徵在於培養器內應力可調控，即在細胞培養之初，作為細胞培養室的中筒及作為培養液流動室的內筒軸向同步旋轉，轉速決定於不同培養物的尺度在培養介質中的懸浮，大於或等於培養物懸浮的最小角速度，一般轉速為5-40轉／分，此時，細胞培養室內剪應力分布趨於零，隨著細胞培養過程細胞聚集體的形成，內筒和中筒的軸向旋轉由同步旋轉變為差動旋轉，並且可調控，其差動範圍為 此時，細胞培養室內的剪應力由趨於零到所培養細胞／組織的生理應力，在培養過程中，其供氣-排氣系統的氣源對氣室的供氣流量為0．4-10ml／min，供液-排液系統對細胞培養室的供液流量為0．1-10ml／min。
所述的細胞培養室內剪應力可調控通過供液-排液系統中的阻尼器調節液泵的輸出壓力和／或直接調節液泵的輸出壓力改變培養液流動室內的壓力分布，來改變細胞培養室內的二次流。
所述的細胞培養器內剪應力可調控通過供氣-排氣系統中的穩壓、調壓閥改變氣室內壓力，以調節細胞培養室內的壓力。
所述的細胞培養器內剪應力可調控在培養液中加入調節細胞培養室內介質粘度，改變剪應力的無毒、有利細胞生長的粘度與培養液不同的添加物，所加入的添加物包括高分子右旋糖酐dextran2000T。
本發明原理根據流體力學原理若兩個同軸圓筒以等角速度旋轉，經過一定的時間，充滿於其間的粘性流體就會象固體一樣以和圓筒相同的角速度旋轉，各層流體之間沒有相對運動，因而整個流場中流動剪應力為零，這就不會損傷細胞，而且有利於細胞聚集。而且在一定的角速度下，細胞、微載體細胞聚集體等可以藉助於流體動力的作用，克服重力沉降而懸浮於培養液中，避免了與容器壁接觸而導致接觸抑止，從而確保細胞能真正三維生長。
本發明提供的應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器和培養方法，按常規培養工藝將培養物、新鮮培養液裝入本發明的培養器內，培養條件和常規培養條件相同，其區別在於培養器內剪應力可調控。在細胞培養之初，內筒和中筒同步旋轉，轉速決定於不同培養物(細胞、微載體、細胞-材料構架種植體)的尺度在培養介質中的懸浮(不沉降條件)，如
圖1所示。此時，介質內剪應力水平趨於零，有利於細胞聚集、粘附；而隨著細胞聚集體的形成，再把內筒和中筒的旋轉變為差動旋轉，來調控細胞培養室內的剪應力分布，以誘導細胞功能的定向分化。剪應力水平的控制，因培養目標、生長狀況而異。應力調控可通過以下途徑實現(1)內筒和中筒的旋轉差動旋轉，在穩定性界限內，流動剪應力水平的改變可達3～4個量級；(2)調節內筒轉速，和／或通過供液-排液系統中的阻尼器和／或液泵的輸出壓力改變培養液流動室內的壓力分布，從而改變細胞培養室內的二次流，一達到調控細胞培養室內介質應力分布的目的；(3)通過供氣排氣系統中穩壓、調壓閥調控進入氣室的氣流來改變氣室內壓力，調節細胞培養室內的壓力水平；(4)通過培養液供液-排液系統，在培養液中加入添加物，調節細胞培養室內介質的粘度，以改變其剪應力水平，而實現從細胞培養開始時細胞培養室內剪應力為零到隨細胞聚集體形成剪應力為所培養的細胞／組織的生理應力，所加入的添加物的添加的量視培養目標來定。
本發明的培養方法既可用於細胞懸浮培養、微載體培養，亦可用於細胞一材料構架件聚集體等培養。至於培養液的組分則因培養對象而異。PH值、溫度等條件和常規的細胞培養相同。只是在必要時，可加入添加物調節培養液的粘度和密度，以利於培養物懸浮，並改變介質剪應力水平。所述的添加物包括高分子右旋糖酐等。
為維持細胞生長化學微環境的穩態，必須保證足夠的氧和營養的供應，並能及時帶走代謝產物。單純靠擴散是不能滿足需要的，而傳統生物反應器的攪拌或氣升法也是不適用的(會損傷細胞或改變其結構、功能)。這是細胞／組織三維培養器的又一關鍵技術問題。本發明的培養器具有合理的流體力學設計，既可形成一定強度的對流擴散，又可將流體動力控制在一個合理的範圍內，不致損傷細胞或導致細胞結構-功能的質的改變。
本發明的培養器藉助流體動力避免重力沉降，確保培養物懸浮三維生長。
本發明的效果1．本發明提供的應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器按照不同的培養對象(細胞、組織等)，在不同的細胞培養階段，有效地調控細胞培養室內介質的剪應力分布，改善生長環境以利於細胞生長、運動、聚集、粘附，並誘導其分化，以形成所需要的特定組織。
2．本發明中培養液流動室、細胞培養室和氣室是三層同心圓筒，內筒為培養液流動室，新鮮培養液進入培養液流動室，經液／液交換膜進入細胞培養室，代謝物由液／液交換膜流出後，由於離心力的作用，形成二次流。從擴散輸運變為對流一擴散輸運，營養供應效率提高且趨於均勻，不易形成「死區」。另一方面，氣室在細胞培養室外側，氧氣通過氣／液交換膜進入培養場後，可藉助細胞培養室流動徑向壓力梯度傳向深部，同樣，細胞培養室內介質的二次流亦有利於氧輸運且趨於均勻。
3．本發明可通過供液-排液系統和供氣-排氣系統中阻尼器和泵，改變流動參數，並對氧和培養液輸運進行在線調節，從而提高對氧和營養輸運效率，以利於細胞生長、運動、聚集、粘附，並誘導其分化，以形成所需要的組織。
4．該培養器有自動供氣-排氣、供液-排液系統，實現了在線供氣、供液的連續運行；並通過氣路上的穩壓、調壓閥可調節培養液流動室內壓力分布，而改變液／液交換膜的交換效率，利用流體動力效應，提高氧和營養物的輸運效率。
5．當其轉速和培養物尺寸符合一定的匹配條件時，該培養器也可在地面重力環境裡使用，利用流體動力克服重力沉降，確保細胞三維生長，實現真正的三維培養。
下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細說明；附圖1為本發明的培養器中培養物尺寸d和懸浮培養所需最低轉速示意圖附圖2為本發明的隔離器結構示意圖；附圖3為本發明的三維培養器結構示意圖；附圖4為內筒、中筒和外筒的半徑及轉速的示意圖；附圖5為本發明三維培養器的輸液-排液路徑方塊圖；附圖6為本發明三維培養器的輸氣-排氣路徑方塊圖；其中細胞培養室1 液／液交換膜2培養液流動室3進液管4 代謝物出液管5隔離器6氣室7 氣／液交換膜8進氣口9出氣口10變速器11、12 馬達13、14支架15 底座16 培養器主體17內筒18 中筒19 外筒20培養液流動管21 培養液進口22 代謝物出口23代謝物環形回流通道24密封圈25 儲液器26液泵27 輸液管道28 阻尼器29透析器30氣／液交換器31 代謝物收集器32
氣源33 穩壓、調壓閥34輸氣管道35、36餘氣收集器37內筒轉速ω1中筒轉速ω2內筒轉速ω3內筒直徑R1中筒直徑R2外筒直徑R3實施例1按圖3製作一臺應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器，包括由氣室7、細胞培養室1、培養液流動室3三層同心圓筒套裝構成的培養器主體17、底座16上固定的支架15、由馬達和變速器組成的傳動機構，供液-排液及供氣-排氣系統，其特徵在於筒壁上設有簍孔的內筒18外表面貼敷有液／液交換膜2，其內腔為培養液流動室3，半徑為R1，由馬達13驅動的變速器11帶動培養液流動室3的軸轉動，培養液流動室3隨軸一起以角速度ω1旋轉，通過貼敷在培養液流動室3外表面上的液／液交換膜2與細胞培養室1進行物質交換，細胞獲得營養，排出代謝產物；筒壁上設有簍孔的中筒19外表面貼敷有氣／液交換膜8，其內腔為細胞培養室1，半徑為R2，由另一套馬達14驅動的變速器12帶動細胞培養室1的軸轉動，細胞培養室1隨軸一起以角速度ω2旋轉；外筒20筒壁上設有進氣孔9和出氣孔10，其內腔為氣室7，由進氣口9進入的新鮮氣體，在氣室7中通過貼敷在細胞培養室1外表面上的氣／液交換膜8進行氣體交換，為細胞培養室1提供氧氣，交換的二氧化碳氣由出氣口10排出，作為氣室7的外筒20固定在支架15上，不作軸向旋轉，而作為培養液流動室3的內筒18和作為細胞培養室1的中筒19分別由各自的由馬達13、14和變速器11、12組成的傳動機構驅動作軸向旋轉，其軸向旋轉的角速度ω1和ω2相同或不同，作為培養液流動室3的內筒18中同心地設置一根培養液流動管21，其進口端的內筒上安裝一與支架15固定的隔離器6，隔離器6為一空心圓柱體，其內部徑向設置與其中心線垂直的培養液進口22和代謝物出口23，培養液進口22和代謝物出口23中分別安裝進液管4和出液管5，進液管4與內筒中設置的培養液流動管21的相連通，出液管5與內筒內腔中的代謝物環形回流通道24相連通，液泵19將新鮮培養液從固定在隔離機構6培養液進口管4泵入，隔離器6中培養液進口22和代謝物出口23之間及代謝物出口2的另一側分別設置將其密封隔開的密封圈25，供氣-排氣系統包括氣源、氣泵及輸氣管道，與氣泵相連的輸氣管道上裝有調壓、穩壓閥並與外筒20上的進氣口9相連通，進氣口9入口處設有進氣濾膜，外筒20上的出氣口10通過輸氣管道連通餘氣收集器。供液-排液系統包括培養液儲液器、液泵及輸液管道，與液泵相連的輸液管道與隔離器6上的培養液進液管4相連通，隔離器6上的代謝物出液管5通過輸液管道連通阻尼器，阻尼器出口連通培養液透析器，培養液透析器出口分別連通代謝物收集器及氣／液交換器，氣／液交換器連通培養液儲液器，培養液儲液器出口通過輸液管道及隔離器6上的進液管4與位於內筒18中的培養液流動管21相連通。
平行的兩支架15支撐培養器主體17，一個馬達14固定其上；16為底座，另一個馬達固連其上；培養液供液-排液系統的路徑，如圖5所示，在圖中26為鮮培養液儲液器，27為流量、壓力可調的液泵，28為培養液輸液管道，它與培養液進口管4相連，進入培養液流動室3經代謝物出口管5流出，29為阻尼器，可採用可調節軟管鬆緊的夾持在輸氣管道的氣管夾子，其作用是調節細胞培養室1內的氣體壓力分布，30是培養液透析器，31是氣／液交換器，培養器主體用聚碳酸脂材料製作，交換膜用市售的半透膜，以上所用的其他部件均是普通市售的，32是代謝物收集器，供液-排液系統中液泵27將新鮮培養液從儲液器26通過輸液管道28經進液管4輸入培養液流動室3，通過貼敷在培養液流動室3筒壁上的液／液交換膜2，為細胞培養室1提供養份，代謝物經出口管5流出，流出培養器的液體中，由於含有新鮮培養液，為節約原料，降低成本，將流出的液體通過阻尼器29送入培養液透析器30進行透析，透析後，將分離出來的代謝產物流入代謝產物收集器32，經透析的培養液流經氣／液交換器31，調節培養液的氧含量和PH值，並添加營養和生長因子後流回培養液存儲器26，以供循環使用。
供氣-排氣系統的路徑，如圖6所示，在圖中33為氣源，為一儲有氧氣的氣瓶，34為穩壓、調壓閥，市售的氣體穩壓、調壓閥，35為輸氣管道，36為輸氣管道，均為普通氣管，37為餘氣收集器；氣源33中的新鮮氣體經穩壓、調壓閥34調壓後，由輸氣管道35經進氣口9進入氣室7，在氣室7經氣／液交換膜8進行氣體交換，為細胞培養室1提供氧氣，交換後的二氧化碳氣體由氣室7的出氣口10和輸氣管道36流至餘氣收集器37。
實施例2使用實施例1的培養器進行人胃癌細胞懸浮培養，微載體可用一般材料，溫度、PH值條件和常規的細胞培養相同。只是在必要時加入高分子dextran 2000T右旋糖酐添加物來調節培養液的粘度和密度，以利於培養物懸浮，並改變介質剪應力水平。其次，為維持細胞生長化學微環境的穩態，必須保證足夠的氧和營養的供應，並能及時帶走代謝產物。本實施例中的供氣供液系統對氣室供氣的供氣流量為0．4ml／min，供液-排液系統對細胞培養室供液的供液流量為0．1ml／min，在培養的初期，其培養器同步旋轉的轉速為5轉／分。通過本發明的培養器合理的流體力學設計，既可形成一定強度的對流擴散，又可將流體動力控制在一個合理的範圍內，不致損傷細胞或導致細胞結構，功能的質的改變。
本實施例的培養條件與常規工藝的培養條件相同，特點是培養器內應力可調控，即在細胞培養之初，作為細胞培養室的中筒及作為培養液流動室的內筒軸向同步旋轉，此時，細胞培養室內應力分布趨於零，隨著細胞培養過程細胞聚集體的形成，調控細胞培養室內的剪應力由趨於零到所培養胃癌細胞的生理應力0．5dym／cm2。
本實施例細胞培養器內剪應力的調控是這樣實現的在細胞培養之初，內筒和中筒同步旋轉，轉速ω1=ω2=5轉／分種，其轉速決定於不同培養物的尺度在培養介質中的懸浮，即為胃癌細胞懸浮的最小角速度；隨著細胞培養過程細胞聚集體的形成，內筒和中筒的軸向旋轉由同步變為差動旋轉，ω1≠ω2，並且可調控，ω2／ω1=0．9。
本實施例所述的細胞培養器內剪應力的調控液液可這樣實現通過供液-排液系統中阻尼器調節液泵的輸出壓力和／或直接調節液泵的輸出壓力改變培養液流動室內的壓力5MPa，來改變細胞培養室內的二次流。
本實施例所述的細胞培養器內剪應力的調控還可以這樣實現通過供氣-排氣系統改變氣室內壓力，來調節細胞培養室內的壓力0．1MPa。
本實施例所述的細胞培養器內剪應力的調控又可以這樣實現通過在培養液中加入調節細胞培養室內介質粘度，改變剪應力的添加物，添加物為高分子右旋糖酐dextran2000T。
實施例3使用實施例1的培養器進行人軟骨細胞懸浮培養，微載體可用一般材料，溫度、PH值條件和常規的細胞培養相同。只是在必要時加入高分子dextran 2000T右旋糖酐添加物來調節培養液的粘度和密度，以利於培養物懸浮，並改變介質剪應力水平。其次，為維持細胞生長化學微環境的穩態，必須保證足夠的氧和營養的供應，並能及時帶走代謝產物。本實施例中的供氣供液系統對氣室供氣的供氣流量為6ml／min，供液-排液系統對細胞培養室供液的供液流量為6ml／min，在培養的初期，其培養器同步旋轉的轉速為20轉／分。通過本發明的培養器合理的流體力學設計，既可形成一定強度的對流擴散，又可將流體動力控制在一個合理的範圍內，不致損傷細胞或導致細胞結構，功能的質的改變。
本實施例的培養條件與常規工藝的培養條件相同，特點是培養器內應力可調控，即在細胞培養之初，作為細胞培養室的中筒及作為培養液流動室的內筒軸向同步旋轉，此時，細胞培養室內應力分布趨於零，隨著細胞培養過程細胞聚集體的形成，調控細胞培養室內的剪應力由趨於零到所培養軟骨細胞的生理應力3dym／cm2。
本實施例細胞培養器內剪應力的調控是這樣實現的在細胞培養之初，內筒和中筒同步旋轉，轉速ω1=ω2=20轉／分種，其轉速決定於不同培養物的尺度在培養介質中的懸浮，即為胃癌細胞懸浮的最小角速度；隨著細胞培養過程細胞聚集體的形成，內筒和中筒的軸向旋轉由同步變為差動旋轉，ω1≠ω2，並且可調控，ω2／ω1=0．3。
本實施例所述的細胞培養器內剪應力的調控液液可這樣實現通過供液-排液系統中阻尼器調節液泵的輸出壓力和／或直接調節液泵的輸出壓力改變培養液流動室內的壓力4MPa，來改變細胞培養室內的二次流。
本實施例所述的細胞培養器內剪應力的調控還可以這樣實現通過供氣-排氣系統改變氣室內壓力，來調節細胞培養室內的壓力00．8MPa。
本實施例所述的細胞培養器內剪應力的調控又可以這樣實現通過在培養液中加入調節細胞培養室內介質粘度，改變剪應力的添加物，添加物為高分子右旋糖酐dextran2000T。
實施例4使用實施例1的培養器進行人成纖細胞懸浮培養，微載體可用一般材料，溫度、PH值條件和常規的細胞培養相同。只是在必要時加入高分子dextran 2000T右旋糖酐添加物來調節培養液的粘度和密度，以利於培養物懸浮，並改變介質剪應力水平。其次，為維持細胞生長化學微環境的穩態，必須保證足夠的氧和營養的供應，並能及時帶走代謝產物。本實施例中的供氣供液系統對氣室供氣的供氣流量為10ml／min，供液-排液系統對細胞培養室供液的供液流量為10ml／min，在培養的初期，其培養器同步旋轉的轉速為40轉／分。通過本發明的培養器合理的流體力學設計，既可形成一定強度的對流擴散，又可將流體動力控制在一個合理的範圍內，不致損傷細胞或導致細胞結構，功能的質的改變。
本實施例的培養條件與常規工藝的培養條件相同，特點是培養器內應力可調控，即在細胞培養之初，作為細胞培養室的中筒及作為培養液流動室的內筒軸向同步旋轉，此時，細胞培養室內應力分布趨於零，隨著細胞培養過程細胞聚集體的形成，調控細胞培養室內的剪應力由趨於零到所培養胃癌細胞的生理應力ldym／cm2。
本實施例細胞培養器內剪應力的調控是這樣實現的在細胞培養之初，內筒和中筒同步旋轉，轉速ω1=ω2=40轉／分種，其轉速決定於不同培養物的尺度在培養介質中的懸浮，即為胃癌細胞懸浮的最小角速度；隨著細胞培養過程細胞聚集體的形成，內筒和中筒的軸向旋轉由同步變為差動旋轉，ω1≠ω2，並且可調控，ω2／ω1=0．7。
本實施例所述的細胞培養器內剪應力的調控液液可這樣實現通過供液-排液系統中阻尼器調節液泵的輸出壓力和／或直接調節液泵的輸出壓力改變培養液流動室內的壓力6MPa，來改變細胞培養室內的二次流。
本實施例所述的細胞培養器內剪應力的調控還可以這樣實現通過供氣-排氣系統改變氣室內壓力，來調節細胞培養室內的壓力0．12MPa。
本實施例所述的細胞培養器內剪應力的調控又可以這樣實現通過在培養液中加入調節細胞培養室內介質粘度，改變剪應力的添加物，添加物為高分子右旋糖酐dextran2000T。
權利要求
1．一種應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器，包括由氣室、細胞培養室、培養液流動室三層同心圓筒套裝構成的培養器主體、底座上固定的支架、由馬達和變速器組成的傳動機構，供液-排液及供氣-排氣系統，其特徵在於筒壁上設有簍孔的內筒外表面上貼敷有液／液交換膜，其內腔為培養液流動室，筒壁上設有簍孔的中筒外表面上貼敷有氣／液交換膜，其內腔為細胞培養室，外室筒壁上設有進氣孔和出氣孔，其內腔為氣室，作為氣室的外筒固定在支架上，不作軸向旋轉，而作為培養液流動室的內筒和作為細胞培養室的中筒分別由各自的由馬達和變速器組成的傳動機構驅動作軸向旋轉，其軸向旋轉的角速度相同或不同，作為培養液流動室的內筒中同心地設置一根端部超出培養液流動室筒壁上設置的液／液交換膜軸向邊緣的細長培養液流動管，其進口端的內筒上安裝一與支架固定的隔離器，隔離器為一空心圓柱體，其內部徑向設置與其中心線垂直的培養液進口和代謝物出口，培養液進口和代謝物出口中分別安裝進液管和代謝物出液管，進液管與內筒中設置的培養液流動管相連通，代謝物出液管與內筒中培養液流動管管外的空腔，即代謝物環形回流通道相連通，隔離器中培養液進口和代謝物出口之間設置將其密封隔開的密封圈；供氣-排氣系統包括氣源、氣泵及輸氣管道，與氣泵相連的輸氣管道與外筒上的進氣口相連通；供液-排液系統包括培養液儲液器、液泵及輸液管道，與液泵相連的輸液管道與隔離器上的培養液進液管相連通。
2．按權利要求1所述的所述的應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器，其特徵在於氣源與氣室相連的輸氣管道上設有穩壓、調壓閥，氣室的出氣口通過輸氣管道連接餘氣收集器。
3．按權利要求1所述的所述的應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器，其特徵在於隔離器上的代謝物出液管通過輸液管道連通阻尼器，阻尼器出口連通培養液透析器，培養液透析器出口分別連通代謝物收集器和氣／液交換器，氣／液交換器連通培養液儲液器，儲液器出口通過輸液管道與隔離器上的進液管相連通。
4．使用權利要求1所述應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器進行細胞／組織三維培養的方法，按常規培養工藝將培養物、新鮮培養液裝入本發明的應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器內，培養條件與常規工藝的培養條件相同，其特徵在於培養器內應力可調控，即在細胞培養之初，作為細胞培養室的中筒及作為培養液流動室的內筒軸向同步旋轉，轉速決定於不同培養物的尺度在培養介質中的懸浮，大於或等於培養物懸浮的最小角速度，一般轉速為5-40轉／分，此時，細胞培養室內剪應力分布趨於零，隨著細胞培養過程細胞聚集體的形成，內筒和中筒的軸向旋轉由同步旋轉變為差動旋轉，並且可調控，其差動範圍為 此時細胞培養室內的剪應力由趨於零到所培養細胞／組織的生理應力，在培養過程中，其供氣-排氣系統的氣源對氣室的供氣流量為0．4-10ml／min，供液-排液系統對細胞培養室的供液流量為0．1-10ml／min。
5．按權利要求4所述應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器進行細胞／組織三維培養的方法，其特徵在於所述的細胞培養室內剪應力可調控通過供液-排液系統中的阻尼器調節液泵的輸出壓力和／或直接調節液泵的輸出壓力改變培養液流動室內的壓力分布，來改變細胞培養室內的二次流。
6．按權利要求4所述應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器進行細胞／組織三維培養的方法，其特徵在於所述的細胞培養器內剪應力可調控通過供氣-排氣系統中的穩壓、調壓閥改變氣室內壓力，以調節細胞培養室內的壓力。
7．按權利要求4所述應力可調控旋轉式細胞／組織三維培養器進行細胞／組織三維培養的方法，其特徵在於所述的細胞培養器內剪應力可調控在培養液中加入調節細胞培養室內介質粘度，改變剪應力的無毒、有利細胞生長的粘度與培養液不同的添加物，所加入的添加物包括高分子右旋糖酐dextran2000T。
全文摘要
本應力可調控旋轉式細胞/組織三維培養器及培養方法,由三層同心圓筒套裝的內、中、外筒即培養液流動室、細胞培養室、氣室,內、中筒筒壁上分別有液/液交換膜和氣/液交換膜,並分別作軸向旋轉,角速度相同或不同,與液泵相連的輸液管道與內筒內的流動管進口相通,與氣泵相連的輸氣管道與氣室進氣口相通;其培養方法:將培養物、培養液裝入培養器內,培養器內剪應力隨著細胞聚集體的形成,從零調控至培養細胞/組織的生理應力。
文檔編號C12M3/00GK1290742SQ9912388
公開日2001年4月11日 申請日期1999年11月16日 優先權日1999年11月16日
發明者陶祖萊, 姚永龍, 張奕毅, 高宇欣 申請人:中國科學院力學研究所