肌纖維體外培養試劑盒的製作方法
2023-07-10 06:33:26
肌纖維體外培養試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體來說是一種肌纖維體外培養試劑盒，包括消化酶、D-Hanks液、肌細胞培養液A和肌細胞培養液B。本發明培養基可快速通過體外培養獲得骨骼肌肌纖維衛星細胞，所培養的細胞形態均一，繁殖活力強，在分化誘導後具有融合成肌管得能力；利用本發明試劑盒進行體外培養肌衛星細胞的方法不但操作簡便，而且大大節省了培養成本，具有一定的經濟意義，且可以獲得大量傳代穩定性好的細胞。
【專利說明】肌纖維體外培養試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，具體來說是一種肌纖維體外培養試劑盒。
【背景技術】
[0002]實驗表明骨胳肌中的肌衛星細胞有自我更新及成肌、成骨、成脂肪等能力，亦稱之為「肌肉乾細胞」，這種細胞是向成肌細胞系定向的一種前體細胞；肌肉再生過程主要是由肌衛星細胞來完成的；肌衛星細胞位於肌纖維的肌膜與基底膜之間，一般為小梭形扁平的單核細胞；當肌肉組織受到刺激時如骨骼肌受損時，衛星細胞就會被激活，大量分裂、增殖並相互融合形成再生肌纖維；激活的衛星細胞與受損傷細胞融合以修復受損傷細胞，或幾個成肌細胞融合形成肌管，進而生成新的肌細胞。衛星細胞的激活、增殖和分化也是骨骼肌細胞肥大、數目增多以及肌纖維轉化的重要機制。肌衛星細胞體外分離培養成為研究肌肉分化途徑及性狀改良的分子機制的重要技術平臺，為改良家畜肌肉品質及畜牧業生產領域奠定研究基礎。
[0003]肌細胞是肌組織的前體細胞，易培養、可塑性強，具有骨骼肌的許多重要生物特性，對於肌衛星細胞的研究成為生物組織工程中的一個熱門領域。不同年齡、不同肌肉類型中衛星細胞的數目不同，因此取材對於肌衛星細胞的原代培養很重要；一般來說，年幼個體的衛星細胞含量較豐富。開發一種肌纖維體外培養試劑盒對肌纖維的研究具有重要意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的 是提供一種肌纖維體外培養試劑盒。
[0005]為實現上述目的，本發明採用的技術方案是:一種肌纖維體外培養試劑盒，其特徵在於:包括消化酶、D-Hanks液、肌細胞培養液A和肌細胞培養液B。
[0006]進一步的:所述消化酶包括胰酶和I型膠原酶。
[0007]進一步的:所述D-Hanks 液由 8g 的 NaCU0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KC1、0.6g的KH2P04、3.5g的NaHC03、5g的青鏈黴素、1.0g的兩性黴素B和1000mL三蒸水組成。
[0008]進一步的:所述細胞生長培養液A由70ml的DMEM高糖培養基、20ml的FBS、IOml的胎牛血清、Ig的青鏈黴素和Ig的兩性黴素B組成。
[0009]進一步的:所述細胞生長培養液B由98ml的DMEM高糖培養液、2m的胎牛血清組成。
[0010]進一步的:所述細胞生長培養液pH值為7.2。
[0011]本發明的有益技術效果是:本發明培養基可快速通過體外培養獲得骨骼肌肌纖維衛星細胞，所培養的細胞形態均一，繁殖活力強，在分化誘導後具有融合成肌管得能力；利用本發明試劑盒進行體外培養肌衛星細胞的方法不但操作簡便，而且大大節省了培養成本，具有一定的經濟意義，且可以獲得大量傳代穩定性好的細胞。
【具體實施方式】[0012]下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
[0013]實施例一
肌纖維體外培養試劑盒，包括消化酶、D-Hanks液、肌細胞培養液A和肌細胞培養液B。
[0014]其中:消化酶包括胰酶和I型膠原酶。
[0015]其中=D-Hanks液由 8g 的 NaCl、0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KCl、0.6g 的 KH2PO4'
3.5g的NaHC03、5g的青鏈黴素、1.0g的兩性黴素B和1000mL三蒸水組成。
[0016]其中:細胞生長培養液A由70ml的DMEM高糖培養基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、Ig的青鏈黴素和Ig的兩性黴素B組成，pH值為7.2。
[0017]其中:細胞生長培養液B由98ml的DMEM高糖培養液、2ml的胎牛血清組成，pH值為 7.2。
[0018]利用本發明培養基培養山羊肌纖維衛星細胞的方法步驟如下:
(1)取樣:在無菌條件下，取山羊背最長肌放入冰盒，立即帶回實驗室；
(2)消化:將肌肉樣用剪刀剪碎，加入含有0.25g胰酶和0.2g I型膠原酶的D-Hanks(D-Hanks 液由 8g 的 NaCl、0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KC1、0.6g 的 ΚΗ2Ρ04、3.5g 的 NaHC03、5g的青鏈黴素、1.0g的兩性黴素B和1000mL三蒸水組成)液中，37 °C條件下消化60~120min，得到細胞懸浮液；
(3)過濾:利用篩孔為400目的過濾篩過濾細胞懸液，然後離心，所得細胞沉澱用D-Hanks液重懸並離心，再用細胞生長培養液A (70ml的DMEM高糖培養基、20ml的FBS、IOml的胎牛血清、Ig的青鏈黴素和Ig的兩性黴素B組成，pH值為7.2)重懸細胞；
(4)初代培養:將懸浮的細胞接種於以多聚賴氨酸包被的細胞培養瓶中，採用差速貼壁法培養細胞ppl至pp6，將pp6中的細胞培養至匯合率為95%，然後採用質量濃度為0.25%的胰酶進行傳代(I: 1)，即完成山羊肌衛星細胞的體外分離培養；
(5)誘導分化
A、採用100μ I的DMEM高糖培養液對4 μ g的pEGFP-1RES_Myf6質粒和8 μ I的PEI轉染試劑分別進行孵育5min，然後混合併孵育15min，得PE1-質粒複合物；
B、取體外分離培養的山羊肌衛星細胞並培養至匯合率為75%，棄掉培養液，用DMEM高糖培養液清洗山羊肌衛星細胞兩次，然後補加1.8ml的DMEM高糖培養液，再將PE1-質粒複合物逐滴滴加到山羊肌衛星細胞表面並作用4h，然後更換為細胞生長培養液A (70ml的DMEM高糖培養基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、Ig的青鏈黴素和Ig的兩性黴素B組成，PH值為7.2)培養24h，再更換為細胞生長培養液B (DMEM高糖培養液、2ml的胎牛血清組成，PH值為7.2)，在溫度為37°C並裝有5%C02的培養箱中誘導分化48~72h，即完成山羊肌衛星細胞的誘導分化。
[0019]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.肌纖維體外培養試劑盒，其特徵在於:包括消化酶、D-Hanks液、肌細胞培養液A和肌細胞培養液B。
2.根據權利要求1所述肌纖維體外培養試劑盒，其特徵在於:所述消化酶包括胰酶和I型膠原酶。
3.根據權利要求1所述肌纖維體外培養試劑盒，其特徵在於:所述D-Hanks液由Sg的NaCU0.6g 的 Na2HPO4.2H20、4g 的 KC1、0.6g 的 KH2PO4,3.5g 的 NaHC03、5g 的青鏈黴素、1.0g的兩性黴素B和1000mL三蒸水組成。
4.根據權利要求1所述肌纖維體外培養試劑盒，其特徵在於:所述細胞生長培養液A由70ml的DMEM高糖培養基、20ml的FBSUOml的胎牛血清、Ig的青鏈黴素和Ig的兩性黴素B組成。
5.根據權利要求1所述肌纖維體外培養試劑盒，其特徵在於:所述細胞生長培養液B由98ml的DMEM高糖培養液、2ml的胎牛血清組成。
6.根據權利要求4或5所述肌纖維體外培養試劑盒，其特徵在於:所述細胞生長培養液PH值為7.2。
【文檔編號】C12N5/071GK103667177SQ201310663442
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】段升華 申請人:中山奈德生物科技有限公司