核糖核苷酸還原酶m1基因檢測試劑盒的製作方法

2023-07-10 10:36:16 1

專利名稱：核糖核苷酸還原酶m1基因檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型屬生物技術領域，涉及核糖核苷酸還原酶Ml基因檢測試劑盒， 是通過利用SYBR GREEN I螢光定量PCR，檢測腫瘤組織中吉西他濱抗癌藥 敏感性相關基因，核糖核苷酸還原酶M1亞單位(RRM1)基因mRNA表達水 平的試劑盒。 技術背景核糖核苷酸還原酶(ribonucleotide reductase ,RR)是DNA合成通路中的限 速酶,它能逆轉二磷酸核苷酸為二磷酸脫氧核苷酸，後者是DNA合成和修復必 不可少的。RR包括2個亞單位:M1和M2 。 Ml亞單位控制底物的特異性和 整個酶的活性;M2亞單位攜帶接觸抑制區,控制底物轉化。RRM1基因被認為 是一種抑癌基因,能抑制腫瘤轉移，定位於染色體Uql5. 5區域著絲粒部分，該 區域稱為LOHllA, 75 y。的NSCLC患者有異質性缺失，這種異質性缺失與患者 預後差成正比。吉西他濱是嘧啶類抗代謝藥物，主要作用於DNA合成期(S期)，也可阻止 Gl期向S期進展,是細胞周期特異性藥物。吉西他濱作為一種前藥在細胞內是 脫氧胸苷激酶磷酸化的良好底物,在酶的作用下轉化成吉西他濱一磷酸鹽、吉西 他濱二磷酸鹽、吉西他濱三磷酸鹽，其中吉西他濱二磷酸鹽、吉西他濱三磷酸鹽 為活性產物。吉西他濱三磷酸鹽插入DNA鏈後,可抑制DNA聚合,進而抑制 DNA合成和修復;吉西他濱二磷酸鹽可抑制核糖核苷酸還原酶,從而減少了 DNA合成和修復所需的脫氧核苷酸的量,使DNA合成發生障礙。當RRM1表 達過高,則會干擾吉西他濱的代謝,產生耐藥。在一些回顧性研究中發現，RRM1 與吉西他濱耐藥密切相關,接受過吉西他濱和順鉑聯合治療的NSCLC患者，體 內低RRM1 mRNA水平與生存時間成正比。免疫組化是檢測組織標本中RRM1蛋白表達常用的方法，但大多數腫瘤患 者是晚期，失去了手術機會，大快腫瘤組織難以獲得。而實時螢光定量PCR 技術以其特異性強、所需組織少(活檢組織，脫落細胞等)、定量、敏感、方 便等優點已得到全世界的公認，廣泛用於腫瘤相關基因、病原體等諸多臨床檢 測。用定量RT-PCR法檢測藥物敏感相關基因來預測藥物療效是必然趨勢，而成熟、標準的試劑盒是定量PCR成功檢測的關鍵。目前螢光實時定量PCR所 使用的螢光化學方法主要有染料法(SYBRGreenI染料)和探針法。其中SYBR Green I染料法不需要設計合成序列特異性探針，而且熔點曲線來分析產物的 均一性有助於更準確地分析和識別擴增產物和引物二聚體，是一種簡便，性價 比較高的實時監測方法。 發明內容本實用新型的目的是為克服定量PCR探針法技術需要設計合成序列特異 性探針，檢測成本高的不足之處，採用SYBR Green I染料定量PCR技術，提 供一種核糖核苷酸還原酶M1基因檢測試劑盒。本實用新型由盒體、襯墊，染料法(SYBR Green I染料)PCR反應液、 Taq酶、標準品、陰性對照、陽性對照組成，襯墊上設有容器孔，分別染料法 (SYBR Green I染料)PCR反應液、Taq酶、標準品、陰性對照、陽性對照。其中PCR反應液的成份包含PCR緩衝液、SYBR Green I染料、MgCl2、 dNTPs、檢測用引物。檢測用引物有兩對檢測基因，RRM1;管家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶 (GAPDH )。其中RRM1引物RRM1-F ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC RRM1-R TACAACTTTGCGGACACGACCTTGAPDH引物GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTCRRM1標準品序列為acc tggagccttg gcatttagac atctttgaat tccttgattt aaagaagaac acaggaaagg aagagcagcg tgccagagat cttttctttg ctctttggat tccggatctc ttcatgaaac gagtggagac taatcaggac tggtctttga tgtgtccaaa tgagtgtcct ggtctggatg鄉tttgggg agaggaattt gagaaactat atgcaagtta tgagaaacaa ggtcgtgtcc gcaasgttgt aGAPDH標準品序列為gaa ggtgaaggtc ggagtc咖g gatttggtcg tattgggcgc ctggtcacca gggctgcttt taactctggt aaagtggata ttgttgccat caatgacccc ttcattgacc tcaactacat ggtttacatg ttccaatatg attccaccca tggcaaattc catggcaccg tcaaggctga gaacgggaag cttgtcatca atggaaatcc catcaccatc ttc對照品分為陽性對照和陰性對照，陰性對照為無RRMl表達的cDNA樣本， 陽性對照為有RRMl表達的cDNA樣本。本試劑盒保存於-4°C，儘量減少反覆凍融。本實用新型主要用於在化療前通過檢測腫瘤組織中RRM1表達的水平來預測 患者對吉西他濱抗癌藥的敏感性，從而指導臨床化療方案的選擇，有利於患者 進行個體化治療。本實用新型建立了利用SYBR Green I螢光染料PCR技術檢測RRM1表達的方 法，並經檢測患者標本證實該方法切實可行。SYBR Green I是一種結合於小溝 中的雙鏈DNA結合染料，檢測靈敏度很高。但是，由於SYBR Green I與所有的 雙鏈DNA相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起 的假陽性會影響定量的精確性。在本檢測項目中，通過優化引物和SYBR Green IPCR反應液，避免了非特異性的擴增，通過溶解曲線分析確定這種定量方法 不僅保持了PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基因的特異性大大提高。與探針 法相比較，方便且便宜。本試劑盒使用方法每次檢測均應設立陽性和陰性對照。標準品用無菌去離子水稀釋為1X108 一lX10'2拷貝/ml。擴增檢測在螢光定量PCR儀上進行，總體積50ul,其中47.5ul PCR反應 液，2.0ul檢測樣品(逆轉錄產物、標準品、陽性和陰性對照)，0.5ulTaqDNA 聚合酶。反應條件50°C 2分鐘，95°C 10分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘共 40個循環，72'C10分鐘。溶解曲線分析擴增產物確定無非特異性擴增，根據 所獲得的標準曲線，分別計算標本中RRM1和GAPDH的量(拷貝/ul)。 RRM1 與GAPDH的比值即為RRM1表達指數。本實用新型具有的特點是探針法和SYBR Green I螢光染料法是實時定 量PCR中的常用方法，本實用新型通過優化PCR的引物、SYBRGreenI螢光 染料和PCR的條件，避免了 SYBR Green I螢光染料的缺陷，非特異性的擴增， 通過溶解曲線分析該試劑盒不僅保持了 PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基 因的特異性大大提高。本實用新型設計合理，與現有探針法相比較，不需要設 計螢光探針，使用方便而且成本低。

圖1為本實用新型試劑盒結構示意圖。圖2為GAPDH標準品(濃度為1X1012 -1X108拷貝/ul)擴增曲線。圖3為GAPDH標準曲線。圖4為GAPDH標準品溶解曲線。圖5為RRM1標準品(濃度為lX10^-lXlS拷貝/ul)擴增曲線。圖6為RRM1標準曲線。圖7為RRM1標準品溶解曲線。
具體實施方式
本實用新型結合具體實施例和附圖作進一步說明。應理解，這些實施例僅 用於說明目的，而不用於限制本發明範圍。 實施例l參見圖l，本實用新型試劑盒由盒體l、襯墊2，染料法(SYBRGreen I 染料)PCR反應液3、 Taq酶4、標準品5、陰性對照6、陽性對照7組成，襯 墊2上設有容器孔，分別放置染料法(SYBR Green I染料)PCR反應液3、 Taq酶4、標準品5、陰性對照6、陽性對照7。陰性對照6為無RRM1表達的cDNA樣本，陽性對照7為有RRM1表達 的cDNA樣本。實施例2 SYBR Green I螢光染料PCR技術檢測RRM1表達及應用1. 材料組織總RNA提取試劑盒購於美國Qiagen公司，逆轉錄試劑盒,SYBR Green I螢光染料購於美國Invitrogen公司，pGEM -T Easy克隆系統,Taq DNA 聚合酶購於美國Promega公司。7500型定量PCR儀為美國ABI公司產品。2. 引物及探針設計與合成分別以RRMl和GAPDH全長cDNA序列(GeneBank登錄號分別為BC0064981和NM-002046)為模板，在www.idtdna.com網上設計並分析引物，並根據基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合。標準品PCR和檢測用PCR引物序列相同， RRMl -F ACCTGGAGCCTTGGCATTTAGAC RRMl -R TACAACTTTGCGGACACGACCTT GAPDH-F GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAPDH-R GAAGATGGTGATGGGATTTC3. 檢測準備品製備取卵巢癌癌組織，組織提取試劑盒提取總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉成cDNA, 取0.5ulcDNA在普通PCR儀上擴增RRMl和GAPDH基因片段，凝膠電泳分離純化PCR產物，PCR產物插入pGEM⑧-TEasy克隆系統，取陽性克隆，EcoR I酶切鑑定，RRM1 254bp,GAPDH226bp。測定濃度並換算成(拷貝數/ul)。4. 標本檢測30例經病理確診的非小細胞肺癌活檢癌組織標本，標本用組織提取試劑盒 提取總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉成cDNA。標本cDNA、標準品(1X108—1 X10^拷貝/ul)、陽性和陰性對照各取2.0ul，總體積50ul，在螢光定量PCR儀 ABI7500上分別進行RRM1和GAPDH擴增。反應條件50°C 2分鐘，95°C 10 分鐘，95°C 15秒、60°C 1分鐘共40個循環，72°C 10分鐘。溶解曲線分析擴 增產物確定無非特異性擴增，根據所獲得的標準曲線，得出標本中RRM1和 GAPDH的量(拷貝/ul)。 RRM1與GAPDH的比值即為RRM1表達指數。5. 結果GAPDH標準品擴增結果參見圖2。標準曲線見參圖3，圖中標準曲線的斜 率為-3.19;相關係數為0.998。溶解曲線參見圖4，圖3溶解曲線表明GAPDH 擴增無非特異性產物，特異性產物溶解溫度為S1.0。C。 RRM1標準品擴增結果 參見圖5。標準曲線參見圖6，圖中標準曲線的斜率為-3.63;相關係數為0.999。 溶解曲線參見圖7，圖中溶解曲線表明RRM1擴增無非特異性產物，特異性產 物溶解溫度為84.0°C。(1) 30例患者組織檢測結果如下:IDGADra QtyRRM1 Qtyratio12.78E+102. 46E+080.0125. 07E+091. 58E+080. 0332.18E+101. 82E+080.0149.30E+082. 62E+092.8254.44E+105. 5犯+080.0167.87E+108.06E+070. 0072. 52E+101. 7犯+090. 0781.62E+102.12E+090. 1392.63E+070.00E+000. 00101.53E+095.35E+070. 03111.20E+097.96E+070. 07126.16E+080.00E+000. 00132.71E+080.00E+000. 00142. 0犯+090.00E+000. 00151.30E+097. 5犯+080. 58162.37E+090. 00E+000.00175.84E+070.OOE+000. 00186.18E+074.65E+070.75197.22E+101.09E+090. 02201.60E+086.26E+070. 39211. 51E+091.06E+090. 70226.09E+099.25E+080. 15236. 29E+077. 04E+071. 12241.75E+101.22E+090. 07251.35E+080. OOE+000. 00264. 76E+101. 2犯+090.03273.10E+111. 84E+090. 01281.66E+127. 63E+090. 00292. 87E+125. 15E+090. 00301.13E+121.66E+090. 00
權利要求1.一種核糖核苷酸還原酶M1基因檢測試劑盒，由盒體(1)、襯墊(2)，染料法PCR反應液(3)、Taq酶(4)、標準品(5)、陰性對照(6)、陽性對照(7)組成，襯墊(2)上設有容器孔，分別放置染料法PCR反應液(3)、Taq酶(4)、標準品(5)、陰性對照(6)、陽性對照(7)。
專利摘要一種核糖核苷酸還原酶M1基因檢測試劑盒，由盒體1、襯墊2，染料法PCR反應液3、Taq酶4、標準品5、陰性對照6、陽性對照7組成，襯墊2上設有容器孔，分別放置染料法PCR反應液3、Taq酶4、標準品5、陰性對照6、陽性對照7。本實用新型通過優化PCR的引物、SYBR Green I螢光染料和PCR的條件，避免了SYBR Green I螢光染料的缺陷，非特異性的擴增，本試劑盒不僅保持了PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基因的特異性大大提高。本實用新型設計合理，與現有探針法相比較，不需要設計螢光探針，使用方便而且成本低。
文檔編號G01N21/00GK201083678SQ200720183949
公開日2008年7月9日 申請日期2007年9月30日 優先權日2007年9月30日
發明者丹 蘇, 馬勝林 申請人:浙江省腫瘤醫院