參與巖芹酸生物合成的新基因和用於生產巖芹酸的方法

2023-07-10 04:24:56

專利名稱：：參與巖芹酸生物合成的新基因和用於生產巖芹酸的方法
技術領域：
：本發明涉及參與巖芹酸生物合成的新基因。本發明尤其涉及源自胡蘿蔔的A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶基因和源自植物的巖芽醯-ACP硫酯酶基因。本發明還涉及使用這些新基因產生巖芽酸的方法。
背景技術：
：近年，在樹脂材料領域，從建立再循環社會而不依賴石油資源觀點出發，正在進行源自生物量的生產樹脂的技術開發。尼龍是一種人工合成的塑料，其自氨基羧酸作為原材料合成，或通過聯氨與二羧酸的聚合合成。大多數原材料單體是通過化學工業技術自化石資源生產的。使用癸二酸(l，10-癸二酸)作為尼龍的源自生物量的原材料。該癸二酸是通過對提取自蓖麻油植物的蓖麻油使用苛性鹼裂解製備的，用作尼龍6,10的原材料。但是尼龍6，10的應用是有限的，因此尼龍6，10不能廣泛地用作樹脂材料。已知二羧酸可通過氧化分解不飽和脂肪酸而製備。至今為止，研究了製備作為尼龍6，6的原材料單體己二酸的原材料巖芽酸(順-6-十八碳烯酸)的技術(非專利文獻1-8)。包括芫荽、胡蘿蔔等在內的傘形科植物(Umbellifers)含有佔種子的脂肪和油含量80%或以上的巖,酸。但是，由於它們的種子產量低，因此不適用於產生巖芽酸。在質體(葉綠體)中新合成了植物脂肪酸。如下合成巖芽酸。將前體_棕櫚醯ACP通過A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶(下文中稱為4DES)轉化為順-4-十六烯醯ACP,然後通過原核型脂肪酸合成酶複合體延長鏈以產生巖芽醯-ACP。然後，通過巖芽醯-ACP硫酯酶(下文中稱為PTE)合成游離的巖芽酸，並轉運至細胞質。認為在合成巖芽酸的植物中存在對巖芽酸的合成特異的一系列生物合成酶和它們的基因。在這些基因中，已克隆了源自芫荽的A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶基因，並導入至本來不產生巖芽酸的擬南芥菜(Arabidopsisthaliana)中，以產生經轉化的植物。雖然已證實了巖芽酸的累積，但累積量僅佔種子中脂肪和油含量的約1%。關於PTE,已顯示了酶活性的存在(非專利文獻8)，但尚未克隆其基因。不僅在質體中的脂肪酸生物合成體系，而且在細胞質內的脂肪酸衍生物的輸送、在內質網膜中甘油三酯合成體系均參與了植物中脂肪和油的生產以及組成性脂肪酸的組成。對於使用基因重組技術生產巖齊酸，還需解決許多問題。專利文獻1美國專利號5,430,134專利文獻2國際7>開號94/01565非專利文獻lProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89，11184-11188，1992非專利文獻2PlantJ.，17(6)，679-688，1999非專利文獻3Prog.LipidRes.,33(1/2)，155-163,1994非專利文獻4PlantPhysiol.，124，681-692，2000非專利文獻5PlantMol.Biol.,47，507-518,2001非專利文獻6Metab.Eng.，4，12-21，2002非專利文獻7Biochim.Biophys.Acta.,1212，134-136，1994非專利文獻8PlantPhysiol.,104,839-844，1994非專利文獻9Planta215:584-5952002。發明公開根據以上所述，本發明的目的是提供能夠促進巖芽酸累積的新基因並提供使用此類基因製備巖芽酸的方法。為了實現上述目的，本發明人進行了深入研究，並新發現了源自傘形科的胡蘿蔔(Daucuscarota)的A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶在巖芹酸合成能力方面優於源自芫荽的A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶。而且，本發明人首次成功地分離到巖芽醯-ACP硫酯酶基因，並發明了涉及使用該基因和A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶基因使得實現約2倍巖芽酸合成能力的技術。本發明包含以下方面(1)編碼以下蛋白質(a)、(b)或(c)的基因(a)包含SEQIDNO:2所示絲,列的蛋白質；(b)包含在SEQIDNO:2所示M酸序列中刪除、替換或添加一個或多個胺基酸的M酸序列並具有A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性的蛋白質；或者(c)由在嚴格條件下與包含互補於SEQIDNO:1所示核苷酸序列的核蛋白質。在上述(b)和(c)中，"具有A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性的蛋白質"可描述為通過在培養的植物細胞或植物中表達，能夠增加順-4-十六碳烯酸、巖芽酸(順-6-十八碳烯酸)、或順-8-二十碳烯酸(cis-8-icosenoicacid)的累積量的蛋白質。(2)編碼以下蛋白質(a)、(b)或(c)的基因(a)包含SEQIDNO:4或6所示^J^餅列的蛋白質；(b)包含在SEQIDNO:4或6所示^J^酸序列中刪除、替換或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列並具有巖芽醯-ACP硫酯酶活性的蛋白質；或者(c)由在嚴格條件下與包含互補於SEQIDNO:3或5所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼並具有巖芽醯-ACP硫酯酶活性的蛋白質。在上述(b)和(c)中，"具有巖芽醯-ACP硫酯酶活性的蛋白質"可描述為通過在培養的植物細胞或植物中與具有A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性的蛋白質共表達該蛋白質，能夠增加順-4-十六碳烯酸、巖芽酸(順-6-十八碳烯酸)、或順-8-二十碳烯酸的累積量的蛋白質，其中通過共表達獲得的累積量大於通過僅表達具有A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性的蛋白質而獲得的累積量。本說明書包括在本申請的優先權文件日本專利申請號2005-191775的說明書和/或附圖中公開的部分或全部內容。附圖簡述圖1顯示了多種類型的巖芽醯-ACP硫酯酶和油醯基-ACP硫酯酶的氨基絲列同源性(％)。圖l中，DcPTE是指源自胡蘿蔔(Daucuscarota)的巖芽醯-ACP硫酯酶，CsPTE是指源自芫荽(Coriandrumsativum)的巖芽醯-ACP石危酯酶，AgPTE是指源自碎蘿(Anethumgraveolens)的巖芽醯-ACP硫酯酶，CsOTE是指源自芫荽(Coriandrumsativum)的油醯基-ACP硫酯酶，且DcOTE是指源自胡蘿蔔(Daucuscarota)的油醯基-ACP硫酯酶。圖2-1顯示了多種類型的巖,醯-ACP疏酯酶和油醯基-ACP硫酯酶的胺基酸序列的比對。圖2-2顯示了多種類型的巖芽醯-ACP硫酯酶和油醯基-ACP硫酯酶的胺基酸序列比對。圖3顯示了源自胡蘿蔔(Daucuscarota)的A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶(稱為Dc4DES)的胺基酸序列和源自芫荽(Coriandrumsativum)的A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶(稱為Cs4DES)的^J^酸序列的比對。圖4為利用大腸桿菌(Escherichiacoli)的純化的源自胡蘿蔔(Dcarota)的巖萍醯-ACP硫酯酶(稱為DcPTE)、源自芫荽(Coriandrumsativum)的油醯基-ACP硫酯酶(稱為CsOTE)、和源自胡蘿蔔(Daucuscarota)的油醯基-ACP硫酯酶(稱為DcOTE)的組氨酸標記蛋白質洗脫液中，對每一級分進行SDS-PAGE的結果的照片。圖5顯示了在純化的DcPTE和DcOTE的組氨酸標記蛋白質洗脫液中使用醯基ACP作為底物反應後，進行SDS-PAGE的結果的照片。圖6為顯示對圖5所示照片中包含的條帶使用圖像分析軟體進行定量的結果的特徵圖。圖7為顯示在實施例中製備的用於持續全身表達的栽體的組成圖。圖8為顯示在實施例中製備的用於種子特異性表達的載體的組成圖。圖9顯示了對經轉化植物的種子進行脂肪酸組成分析的結果圖。本發明的優選實施方案下文中參照附圖詳細地描述了本發明的新基因和製備巖芽酸的方法。1.分離源自胡蘿蔔(Daucuscarota)的A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶基因(Dc4DES基因)Dc4DES基因編碼包含SEQIDNO:2所示胺基酸序列的蛋白質(Dc4DES)。Dc4DES為具有對作為C16飽和脂肪酸的棕櫚醯-ACP(棕櫚醯-醯基載體蛋白)的厶4位置去飽和活性的蛋白質。作為Dc4DES基因的一個例子，為SEQIDNO:1所示的編碼包含SEQIDNO:2所示^J^酸序列的蛋白質的基因。而且，在本發明中，Dc4DES基因可為編碼包含在SEQIDNO:2所示M酸序列中刪除、替換或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列並具有厶4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性的蛋白質的基因。此處，術語"多個胺基酸"是指2至150個，優選地2至80個，且更優選地2至40個胺基酸。欲進行刪除、替換或添加的區域的例子包括但不限於SEQIDNO:2所示胺基酸序列中第1至99位胺基酸之間的區域或第270至386位M酸之間的區域，優選地SEQIDNO:2所示胺基酸序列中第1至99位^J^酸之間的區域或第301至386位胺基酸之間的區域，更優選地SEQIDNO:2所示胺基酸序列中第1至53位胺基酸之間的區域或第381至386位胺基酸之間的區域。而且，在本發明中，Dc4DES基因可為編碼包含與SEQIDNO:2所示^J^酸序列具有50%或更高、優選地70%或更高、更優選地90%或更高同源性的胺基酸序列並具有A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性的蛋白質的基因。上述多個代表同源性的數值可使用序列分析軟體DNASIS(HitachiSoftwareEngineeringCo.，Ltd.),例如通過執4亍最大匹配法的指令而求得。其中使用的參數為預設參數(起始設定的參數)。而且，本發明的Dc4DES基因可為編碼這樣的蛋白質的基因，所述蛋白質為由在嚴格條件下與包含互補於SEQIDNO:1所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼並具有A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性的蛋白質。此處，術語"在嚴格條件下雜交"是指例如即使於溶液(6xSSC，0.5%SDS,和50%甲醯胺)中42。C加熱後，於溶液(0.1xSSC和0.5%SDS)中68。C洗的條件下，仍然觀察到陽性雜交信號。術語"A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性"是指對棕櫚醯-ACPA4位置的去飽和活性。此活性的有無可如下測試。將編碼欲測試的蛋白質的DNA片段導入不累積順-4-十六碳烯酸、巖芽酸和順-8-二十碳烯酸的宿主植物細胞(如菸草或擬南芥菜)，從而基因能發揮作用。測定在導入了DNA片段的植物體的脂質中順-4-十六碳烯酸、巖芽酸和順-8-二十碳烯酸的有無。例如，使用通過在持續性表達啟動子或特異表達啟動子下遊定位有Dc4DES基因，即所述基因定位於受相關啟動子調節的位置而製備的表達載體轉化不累積順-4-十六碳烯酸、巖芽酸和順-8-二十碳烯酸的植物細胞(如菸草或擬脂類。將提取的脂類用甲醇鹽酸等處理得^脂肪酸甲酯。、通過氣相色譜等測定其中含有的巖芽酸甲酯的量、順-4-十六碳烯酸脂肪酸甲酯的量、順-8-二十碳烯酸脂肪酸甲酯的量。如果可以檢測到這些脂肪酸曱酯，則可以說受試蛋白質具有A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性。如果未能檢測到這些脂肪酸曱酯，則可以說受試蛋白質缺乏A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性。通過將Dc4DES基因以能發揮功能的形式導入宿主植物細胞，則Dc4DES基因具有在所述細胞中發揮促進巖芽酸合成的功能。例如，使用通過在持續性表達啟動子或特異表達啟動子下遊定位有Dc4DES基因，即所述基因定位於受相關啟動子調節的位置構建的表達載體轉化植物細胞。將由此獲得的經轉化植物生長為植物體，可促進植物體中巖芽酸的合成。種子特異的表達啟動子優選地用作此種特異的表達啟動子。使用種子特異的表達啟動子，可在種子中累積巖芽酸。可如下檢測巖齊酸。例如，將經轉化的植物生長為植物體，然後粉碎種子等組織。然後將產物與鹽酸-甲醇溶液混合，以將組織中含有的巖芽酸甲酯化，然後用己烷提取。可用氣相色鐠-質鐠(GC-MS)設備檢測己烷提取物。自GC-MS設備的檢測結果可分析促進巖芽酸合成的能力。2.巖芹醯-ACP硫酯酶的酶基因(PTE基因)儘管已指出在芫荽(Coriandrumsativium)中存在PTE基因，但該基因既未被分離也未被克隆。本發明首次分離和克隆了此PTE基因。PTE基因為編碼對在A6位置處具有雙鍵的醯基ACP(醯基載體蛋白)如巖芽醯-ACP有高特異性的硫酯酶(PTE)的基因。PTE參與游離巖芽酸的合成。PTE基因的一個例子為編碼包含SEQIDNO:4或6所示^tj^酸序列的源自胡蘿蔔的PTE的基因。具體地，編碼包含SEQIDNO:4所示胺基酸序列的蛋白質的基因示於SEQIDNO:3。編碼包含SEQIDNO:6所示氨基,列的蛋白質的基因示於SEQIDNO:5。此外，源自胡蘿蔔的PTE基因和PTE分別稱為DcPTE基因和DcPTE。本發明的DcPTE基因可為編碼包含在SEQIDNO:4或6所示^J^酸序列中刪除、替換或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列並具有活性的蛋白質的基因。此處，術語"多個胺基酸，，是指2至188個，優選地2至64個，且更優選地2至44個胺基酸。欲進行刪除、替換或添加的區域的例子包括但不限於SEQIDNO:4所示胺基酸序列中第1至70位氮基酸之間的區域或第311至375位胺基酸之間的區域，優選地SEQIDNO:4所示胺基酸序列中第1至57位胺基酸之間的區域或第368至375位M酸之間的區域，更優選地SEQIDNO:4所示胺基酸序列中第1至32位^J^酸之間的區域。而且，編碼包含在SEQIDNO:4或6所示胺基酸序列中導入了替換、刪除或插入的胺基酸序列的蛋白質的PTE基因可使用公知的技術如Kunkel法或Gappedduplex法或者才艮據它們的方法向SEQIDNO:3或5所示核苷酸序列中導入目的突變而獲得。突變的導入可使用例如利用了定點誘變的誘變試劑盒(如Mutan-K(TAKARA)或Mutan-G(TAKARA))，或者使用LAPCR體外誘變系列試劑盒(TAKARA)實施。而且，在本發明中，DcPTE基因可為編碼包含與SEQIDNO:4或6所示M酸序列具有50%或更高、優選地70%或更高、更優選地90%或更高同源性的M,列並具有巖芽醯-ACP硫酯酶活性的蛋白質的基因。上述多個代表同源性的數值可使用序列分析軟體DNASIS(HitachiSoftwareEngineeringCo.，Ltd.),例如通過執行最大匹配法的指令而求得。其中使用的參數為預設參數(起始設定的參數)。而且，本發明的DcPTE基因可為編碼這樣的蛋白質的基因，所述蛋白質為由在嚴格條件下與包含互補於SEQIDNO:3或5所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼並具有巖芽醯-ACP硫酯酶活性的蛋白質。此處，術語"在嚴格條件下雜交"是指例如即使於溶液(6xSSC，0.5%SDS,和50。/。曱醯胺)中42。C加熱後，於溶液(0.1xSSC和0.5。/。SDS)中68°C洗的條件下，仍然觀察到陽性雜交信號。術語"巖芽醯-ACP硫酯酶活性"是指將巖芽醯-ACP降解為巖芽酸和ACP的活性。此活性可如下測試。混合25mMTris-HCl(pH8.0)、1mMDTT、巖芽醯-ACP和水，然後25。C預孵育5分鐘。將15嗎受試蛋白質添加至100pl反應液中，然後25°C反應30分鐘。反應後，通過SDS-PAGE分離未反應的巖芽醯-ACP和作為反應產物的游離ACP。電泳後，將凝膠進行CBB染色，然後使用光密度計定量作為反應產物的游離ACP(通過SDS-PAGE分離)的量。由此測定了所添加的受試蛋白質的硫酯酶活性。備選地，混合25mMTris-HCl(pH8.0)、1mMDTT、巖芽醯基用氖標記的巖芽醯-ACP和水，然後25。C預孵育5分鐘。將受試蛋白質添加至100ji1反應液，然後25°C反應30分鐘。反應後，添加50|J異丙醇終止反應。其後通過酶反應產生的巖芽酸通過薄層層析分離。由此產生的巖芽酸的量使用閃爍計數儀定量，從而測定所添加蛋白質的硫酯酶活性。此外，本發明中的PTE基因的例子不限於編碼源自胡蘿蔔的PTE的基因。PTE基因的實例包括源自生物合成巖芽酸的植物的PTE基因。生物合成巖芽酸的植物的實例除了包括胡蘿蔔外，還包括傘形科中的如芫荽(Coriandrumsativium)、芽茱(Petroseliumcrispum)、誇蘿(Anethumgraveolens)和五力口科(Araliaceae)植物:i口常青膝(Hederahelix)和惚木(Araliaelata)。當PTE基因獲得自胡蘿蔔以外的植物時，例如可使用SEQIDNO:3或5所示的DcPTE基因核苷酸序列中第187至1128之間的核苷酸區域的全部或部分作為揮:針。當使用長的核酸序列^100bp)作為探針時，也可在中等或高度嚴格條件下進行篩選，以獲得具有80%或更高同源性的來自目的樣本的信號。此外，也可使用非常短的探針。例如，可使用的寡核苷酸長度為至少約10個，優選地至少約15個，且更優選地20個核苷酸。當使用短區域作為探針時，需要較長探針情況下高的序列同一性。特別地，使用上述探針和自胡蘿蔔以外的植物提取的基因組DNA，通過Southern雜交，可分離和鑑定來自該植物基因組的PTE基因。此外，該植物的PTE基因還可不使用基因組DNA，而使用自該植物提取的mRNA作為模板合成的cDNA來分離和鑑定。基於SEQIDNO:3或5所示的DcPTE基因的核苷絲列，自芫荽(Coriandrumsativium)和誇蘿(Anethumgraveolens)分離的DcPTE同源基因的核苷酸序列分別示於SEQIDNO:7和9。此夕卜，由源自芫荽的SEQIDNO:7所示的PTE基因推定的氨基麟列(CsPTE)示於SEQIDNO:8。由源自蒔蘿的SEQIDNO:9所示的PTE基因推定的胺基酸序列(AgPTE)示於SEQIDNO:10。此外，多種植物的硫酯酶蛋白間的胺基酸同源性(％)示於圖1中。如圖1所示，PTE組中的成員(包括DcPTE、CsPTE和AgPTE)具有高同源性。另夕卜，DcOTE顯示與CsOTE具有高同源性。相反，PTE組與OTE組顯示相對低的同源性。因此，可以說與PTE組中的PTE蛋白質具有高於80%的氮基酸同源性的新蛋白質很可能包括在PTE組中。因此，本發明的PTE基因的例子也包括編碼包含與SEQIDNO:4、6、8或10所示胺基酸序列的同源性高於80%的胺基酸序列的蛋白質的DNA。此外，圖2顯示了DcPTE、CsPTE、AgPTE、DcOTE和CsOTE的胺基酸序列比對。在OTE和PTE之間存在約30y。的氬基酸差異。具體地，OTE組中的一些胺基酸與PTE組中的極性不同。在以下說明中，術語"共有序列中的第X位(胺基酸)(X為自然數)，，是指在圖2的比對中對於上排所賦予的數值。在PTE組中共有序列的第120、125和373位氛基酸為非極性的，而在OTE組中的這些胺基酸為極性的。而且，在PTE組中共有序列的第140和195位氛基酸為極性的，而在OTE組中的這些胺基酸為非極性的。此外，OTE組中的一些帶電荷胺基酸與PTE組中的極性不同。在PTE組中共有序列的第149和246位氛基酸為不帶電荷的，而在OTE組中的這些胺基酸為帶正電荷的。此外，在PTE組中共有序列的第244位氛基酸為帶負電荷的，而在OTE組中的該胺基酸為不帶電荷的。此外，在PTE組中共有序列的第270位氛基酸為帶正電荷的，而在OTE組中的該M酸為不帶電荷的。認為在這些位置處胺基酸極性的有無和電荷的變化導致了底物選擇性的變化。而且，已知在底物結合位點處胺基酸側鏈結構的不同導致底物選擇性的變化。在PTE組中共有序列的第89、147、161、177、192、196、214、217、223、238、270、287和338位胺基酸的側鏈結構不同於OTE組的這些胺基酸的側鏈結構。通過替換OTE組和PTE組之間不同的這些胺基酸可能改變對醯基ACP的底物特異性。當將PTE基因與A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶基因一起以PTE基因能發揮功能的形式導入宿主植物細胞，PTE基因具有顯著促進宿主植物細胞中巖芽酸合成的功能。例如，通過將PTE基因定位於持續性表達啟動子或特異表達啟動子下遊而構建表達載體，即所述PTE基因定位於受相關啟動子調節的位置。用A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶基因轉化的植物細胞(參見上述l)進一步用由此構建的表達載體轉化。備選地，也可使用通過將PTE基因和A4-棕櫚醯-ACP去飽和酶基因定位於持續性表達啟動子或特異表達啟動子下遊而構建的表達載體轉化植物細胞。在這兩種情況下，均可將由此獲得的經轉化植物生長為植物體，並在該植物體中能促進巖芽酸合成。可如下檢測巖芽酸。例如，將經轉化的植物生長為植物體，然後粉碎種子等組織。然後將產物與鹽酸-甲醇溶液混合，以將組織中含有的巖芽酸甲酯化，然後用己烷提取。可用氣相色鐠-質鐠(GC-MS)設備檢測己烷提取物。自GC-MS設備的檢測結果可分析促進巖芽酸合成的能力。表達載體在本發明中，表達載體包含上述1和2描述的Dc4DES基因和/或PTE基因。對本發明所使用的表達栽體沒有特別的限制，只要是質粒型載體或染色體導入型載體(其可摻入宿主生物基因組)即可。此類載體的實例包括質粒DNAs、喧菌體DNAs、反轉錄轉座子DNAs和人工染色體DNAs(YAC:酵母人工染色體)。此類質粒DNAs的實例包括YCp大腸桿菌-酵母穿梭載體(如pRS413，pRS414，pRS415，pRS416，YCp50，pAUR112,和pAUR123)，YEp大腸桿菌-酵母穿梭載體(如pYES2和YEpl3)，YIp大腸桿菌-酵母穿梭載體(如pRS403，pRS404，pRS405，pRS406,pAUR101，和pAUR135)，源自大腸桿菌的質粒(如ColE質粒，例如pBR322,pBR325,pUC18，pUC19,pUC118,pUC119，pTV118N，pTV119N,pBluescript，pHSG298，pHSG396,和pTrc99A;pl5A質粒，例如pACYC177和pACYC184;以及pSC101質粒，例如pMW118，pMW119，pMW218,和pMW219),源自農桿菌(Agrobacterium)的質粒(如pBI101),以及源自枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的質粒(如pUB110和pTP5)。此類噬菌體DNAs的實例包括入噬菌體(如Charon4A,Charon21A,EMBL3，EMBL4,XgtlO，Xgtll，和AZAP),cpX174，M13mpl8，和M13mpl9。反轉錄轉座子的實例包括Ty因子。YAC載體的實例包括pYACC2等。此外，也可使用動物病毒如逆轉錄病毒和痘苗病毒以及昆蟲病毒如杆狀病毒(baculovirus)的載體。需要將Dc4DES基因和/或PTE基因以使所述基因能表達的狀態導入此類表達載體。所述"使所述基因能表達的狀態"是指通過將Dc4DES基因和/或PTE基因連接至啟動子而摻入載體中，從而Dc4DES基因和/或PTE基因可在預定的啟動子控制下於所述基因導入的宿主生物中表達。因此，除了Dc4DES基因和/或PTE基因之外，可將啟動子和終止子，並且根據需要，將順式元件如增強子、剪接信號、添加polyA的信號、選擇標記、核糖體結合序列(SD序列)等連接入載體。此外，此類選擇標記的實例包括抗生素抗性基因如氨節青黴素抗性基因、卡那黴素抗性基因、潮黴素抗性基因和除草劑抗性基因如雙丙氨膦抗性基因。待用於本發明的表達載體中包含的啟動子的實例包括但不特別地限於持續性表達啟動子、組織特異的表達啟動子和刺激誘導性啟動子。在這些實例中，優選使用種子特異的表達啟動子，以在種子中累積合成的巖芽酸。作為種子特異的表達啟動子，可使用源自油菜籽的油菜籽蛋白A啟動子、源自擬南芥菜的FAE1啟動子、油質蛋白啟動子、源自大豆的谷蛋白Bl啟動子、亞麻的硬脂醯-ACP去飽和酶(SAD)啟動子等。轉化體可使用上述表達載體製備轉化體。特別地，可通過將上述表達載體導入宿主而製備轉化體，從而使得在栽體中包含的Dc4DES基因和/或PTE基因可表達。宿主植物所屬的科包括但不特別地限於傘形科、茄科(Solanaceae)、芸莒科(Brassicaceae)、禾本科(Gramineae)、豆科(Leguminosae)、薔薇科(Rosaceae)、菊科(Asteraceae)、百合科(Liliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、葫蘆科(Cucurbitaceae)、-炎花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)。屬於傘形科或芸莒科的植物是尤其希望的宿主植物。當宿主為植物時，經轉化的植物可如下獲得。本發明的待轉化的對象植物是指任一完整的植物體、植物器官(如葉、花瓣、莖、根、和種子)、植物組織(如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質部、維管束、柵狀組織、海綿狀組織)、培養的植物細胞。可使用常規的轉化方法將表達載體導入植物，如真空浸潤法(農桿菌法)、粒子槍法、PEG法、電穿孔法等。例如，可根據已知的技術進行真空浸潤法(Shujunsha,ExperimentalProtocolsforModelPlants,2001,109-113頁)。當使用農桿菌時，將表達載體導入合適的農桿菌(如根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404林)。例如根據葉盤法(HirofumiUchimiya編著，GeneticEngineeringManualsforPlants,1990,27-31頁，KodanshaScientificLtd.,東京)，使用該菌林感染宿主(如菸草)的無菌培養葉片，也可獲得經轉化的此外，當使用粒子槍法時，可直接使用植物體、植物器官、植物組織本身。備選地，可從其製備切片或原生質體並使用。如此製備的樣本可用基因導入設備(如PDS-1000(BIO-RAD公司))處理。處理條件根據植物或樣本的不同而不同。處理通常於壓力約450psi至2000psi之間，距離約3cm至12cm之間進4亍。作為轉化的結果而獲得的腫瘤組織、枝條、毛狀根等可直接用於細胞培養、組織培養或器官培養。而且，此類肺瘤組織、枝條、毛狀根等可使用常規的已知植物組織培養法，通過施與合適濃度的植物激素(如生長素、細胞分裂素、赤黴素、脫落酸、乙烯和油菜素內酯)再生為植物體。可通過PCR法、Southern雜交法、Northern雜交法等證實基因被摻入了宿主。例如，自轉化體製備DNA,設計DNA特異的引物，然後進行PCR。PCR可在用於製備質粒的相似條件下進行。接下來將擴增的產物進行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯醯胺凝膠電泳、或毛細管電泳，然後使用溴化乙錠、SYBRGreen液等染色。然後，通過擴增產物以單一條帶的形式被檢測到，從而證實成功的轉化。此外，也可以使用事先用螢光染料等標記的引物進行PCR來檢測擴增產物。此外，此處可採用的方法還包括將擴增產物結合至固相如微孔板，然後通過螢光反應、酶反應等證實擴增產物。另外，宿主的實例包括屬於埃希氏菌屬(Escherichia)(如大腸桿菌)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(如枯草芽孢桿菌)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(如惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida))或根瘤菌屬(Rhizobium)(如苜蓿才艮瘤菌(Rhizobiummeliloti))的細菌；酵母如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粟酒裂歹直酵母(Schizosaccharomycespombe);動淨勿細胞^口COS細胞和CHO細胞；以及昆蟲細胞如Sf9。當使用細菌如大腸桿菌作為宿主時，重組載體優選地為在細菌中可自主複製的，且同時載體優選地包含有核糖體結合序列、本發明的基因和轉錄終止序列。大腸桿菌的實例包括大腸桿菌DH5oc和大腸桿菌Y1090。枯草菌的實例包括但不限於枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。對將重組載體導入細菌的方法沒有特別的限制，只要是將DNA導入細菌中的方法即可。此類方法的實例包括使用鈣離子的方法[Cohen，S.N.等人Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.,69:2110(1972)和電穿孔法。當使用酵母作為宿主時，可使用釀酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)等。對將重組載體導入酵母的方法沒有特別的限制，只要是將DNA導入酵母中的方法即可。此類方法的實例包括使用電穿孔法[Becker，D.M.等人Methods.Enzymol.，194:182(19卯)、原生質球法[Hinnen，A.等人Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，75:1929(1978)、和醋酸鋰法[Itoh，H.:J.Bacteriol.,153:163(1983)]。當4吏用動物細胞作為宿主時，可使用猴細胞(如COS-7和Vero)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、小鼠L細胞、大鼠GH3、人FL細胞等。用於將重組載體導入動物細胞的方法的實例包括電穿孔法、磷酸鉤法和脂轉染法。當使用昆蟲細胞作為宿主時，可使用Sf9細胞等。用於將重組載體導入昆蟲細胞的方法的實例包括磷酸鉤法、脂轉染法和電穿孔法。用於產生巖芹酸的方法在上述經轉化的植物中可促進巖芽酸合成，因為導入的Dc4DES基因和/或PTE基因的功能。可使用常規的公知技術提取經轉化的植物中合成和累積的巖芽酸。自植物組織(如產油型植物的種子或果實)壓和提取脂肪和油的方法主要分成兩種方法壓榨法和提取法。自具有高的脂肪和油含量的組織如油菜籽的種子獲得脂肪和油的方法包括用滾動壓榨機等粗碎和壓組織，在75°C至85°C之間加熱，使用壓榨機如螺旋式壓榨機壓榨，然後提取脂肪和油(壓榨法)。另外，對於具有低的脂肪和油含量的原材料如大豆，使用溶劑如己烷自組織提取脂肪和油(提取法)。通過這些步驟產生的脂肪和油是脂肪酸(包含巖芽酸)和酯如甘油的混合物。因此，其中含有甘油三酯、甘油二酯、甘油單酯、磷脂等。接下來，將這些脂肪和油水解，獲得脂肪酸。分離和純化由此獲得的脂肪酸混合物，從而可獲得非常純的巖芽酸。此外，將醇如甲醇添加至脂肪和油，然後進行反應，可獲得醇酯如巖芽酸甲酯。下面參照實施例對本發明進行更詳細的說明，但本發明的技術範圍不解釋為受下列實施例的限制。接下來，製備了導入實施例1中克隆的Dc4DES基因和實施例2中克隆的DcPTE基因的經轉化植物。檢測了經轉化的植物中的巖芽酸合成能力。特別地，製備了其中僅導入了Dc4DES基因的經轉化植物、其中僅導入了DcPTE基因的經轉化植物、和其中Dc4DES基因和DcPTE基因一同導入的經轉化植物。製備用於持續全身表達的DNA構建體在用於轉化的載體中，圖7顯示了用於持續全身表達的載體。在圖7中，"Pnos"是指源自農桿菌的胭脂鹼合成酶啟動子，"Tnos"是指源自農桿菌的胭脂鹼合成酶終止子，"P35S"是指CaMV35S啟動子，且"NPTII"是指新黴素砩酸轉移酶II基因。特別地，將植物表達載體pBI121(Cloetech)中含有的GUS基因替換為Dc4DES基因的cDNA序列。使用所設計的在5，末端側添加了BamHI序列和在3，末端側添加了SacI序列的引物通過PCR法擴增編碼Dc4DES基因ORF區的DNA片段。將PCR產物與pSTBluel(克隆載體，Novagen)混合，然後向該混合物加入等量TaKaRaLigationKitver.2,於16。C30分鐘進行連接反應。將反應液的總量添加至50nl感受態細胞(大腸桿菌DH5ot，TOYOBO),然後按照製造商說明的方法進行轉化。自由此獲得的轉化體(生長於補充有50|Lig/ml卡那黴素的LB瓊脂培養基)製備質粒。由此獲得的質粒用限制性酶(BamHI和SaeI)處理。接下來，為了切下pBI121中連接在CaMV35S啟動子下遊的GUS基因，同樣地用限制性酶(BamHI和SacI)處理。將這些限制性酶消化的產物進行0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳。使用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)和GenecleanII(BIO101)，分別分離和純化含有Dc4DES基因的DNA片段和pBI121骨架(對應於其中GUS基因已移除的部分)。將pBI121骨架片段和欲插入的DNA片段(Dc4DES基因)以1:10的比率混合。-使用等量的TaKaRaLigationKitver.2於16。C進行連接反應30分鐘。將反應液的總量添加至100nl感受態細胞(大腸桿菌菌林DH5a,TOYOBO)，然後按照製造商說明的方法進行轉化。將所得產物塗布至含有50嗎/ml卡那黴素的LB瓊脂培養基，然後過夜培養.用於共表達Dc4DES基因和DcPTE基因的載體(圖6(D))如下構建將DcPTE基因的表達單元(包含啟動子和終止子的DNA片段)插入圖6(A)所示的Dc4DES表達用表達栽體中的T-DNA的LB附近的唯一的EcoRI位點和DraIII位點之間。DcPTE基因的表達單元通過PCR法使用所設計的兩端添加有EcoRI位點和DraIII位點的引物擴增。製備用於種子特異性表達的DNA構建體在用於轉化的載體中，用於種子特異性表達的載體示於圖8(A)至(D)。在圖8(A)至(D)中，"Pnap"是指源自油菜籽(B.campestriscvKizakinonatane)的油菜籽蛋白A啟動子。已知Monsanto公司使用該啟動子調控油菜籽的脂肪和油含量。具體地，通過將圖7所示的載體中的CaMV35S啟動子替換為源自油菜籽的油菜籽蛋白A啟動子而構建種子特異性表達的載體。此外，將GUS基因替換為Dc4DES基因、DcPTE基因、或Cs4DES的cDNA序列。同時，用於共表達Dc4DES基因和DcPTE基因的載體(圖8(D))如下構建將DcPTE基因的表達單元(包含啟動子和終止子的DNA片段)插入圖8(A)所示的Dc4DES表達用表達載體中的T-DNA的LB附近的唯一的EcoRI位點和DraIII位點之間。DcPTE基因的表達單元通過PCR法使用所設計的兩端添加有EcoRI位點和DraIII位點的引物擴增。通過電穿孔法將基因導入農桿菌使用所製備的質粒通過電穿孔法轉化農桿菌。將40pl通過常規方法製備的根癌農桿菌(LBA4404林)的感受態細胞溶解，然後添加5pl(25|ug)DNA溶液。將溶液置於冰上1至2分鐘。接下來，將溶液置於冰冷的小杯(0.2cm,BIO-RAD)中。使用基因導入設備(Shimadzu)施加脈沖電流(1.25kV和10fxF)。加入立即冷卻的SOC培養基460|ul，然後28。C培養1小時。將該溶液塗布至含有50pg/ml卡那黴素和50嗎/ml利福平的LB瓊脂培養基，然後過夜培養。選擇轉化體。對於出現的轉化體菌落進行單菌落分離。挑取多個菌落，通過PCR法證實目標質粒DNAs。通過真空浸潤法製備擬南芥菜轉化體通過真空浸潤法轉化擬南芥菜(Arabidopsisthalianaet.Columbia)。根據ExperimentalProtocolsforModelPlants,Shujunsha,2001,109-113頁實施真空浸潤法。接下來，培養經真空浸潤的擬南芥菜。然後，收集種子並確定為第l世代轉化種子(T1種子)。但是，為了方便，將它們作為世代轉化種子使用。然而，該種子群體的所有種子不是均已被轉化。接下來，將笫1世代轉化種子播種於補充有卡那黴素的培養基(向Murashige&Skoog基本培養基中添加有0.5g/LMES、10g/L蔗糖、8g/L瓊脂、100mg/L羧節青黴素、和50mg/L卡那黴素)。使種子在亮條件下發芽。生長植物約1至2周，然後選擇轉化的個體植物(由於它們的卡那黴素抗性而正常生長)。將其葉已正常展開的植物個體再次移植至相同的培養基，然後生長約1至2周用於再選擇。將由此獲得的植物體確定為第l世代轉化才直物體(T1植物)。將卡那黴素抗性的植物品系移植至未滅菌的蛭石，從而4吏得它們經培育後變得適應未滅菌的環境。接下來，自第1世代轉化植物體收集約100mg蓮座叢葉，在液氮凍存下粉碎。使用DNA製備試劑盒(DNeasyplantminikit,QIAGEN)，按照在試劑盒中包括的標準方法製備DNA。使用以T-DNA中的藥物抗性基因(NPTII)和所導入的脂肪酸合成體系的基因為靶的PCR引物以及使用ExTaqDNA聚合酶(TAKARABIOINC.)進行PCR擴增。將由此獲得的片段(PCR擴增產物)使用0.8%瓊脂糖凝膠和TAE緩衝液進行電泳。然後進行溴化乙錠染色，證實目標片段的擴增。基於擴增的有無確定所導入基因的有無。接下來，繼續栽培上述確認了T-DNA導入的植物品系，收集的種子確定為第二世代轉化種子(T2種子)。對每一構建體收穫15個或更多品系的T2種子，並用於以下的脂肪酸組成分析。用於分析擬南芥菜種子的脂肪酸組成的方法為了進行種子中脂肪酸組成的分析，將種子中的脂肪酸用鹽酸-甲醇進行甲酯化，然後對其正己烷提取物通過GC-MS分析。此夕卜，添加BHT(丁基化羥基甲苯)作為樣本的抗氧化劑。另外，作為內部標準，將植物油中不含有的十五烷酸(C15:0)的甲酯(SIGMA)的甲醇溶液直接添加至稱重後的種子，用於校正在製備分析用樣本時出現的實驗誤差。適於鄰苯二甲酸酯分析用的正己烷(TokyoChemicalIndustryCo.,Ltd.)用於提取。這可消除鄰苯二甲酸酯的影響，其中所述鄰苯二甲酸酯在GC分析中顯示出與脂肪酸類似的特性。表3顯示了用於定性分析的方法，且表4顯示了用於定量分析的方法。表3用於定性分析的方法(1)稱重5mg樣本(鮮重)(2)將樣本添加至1.5-mLeppendorf管(PP),然後添加1粒Tangsten珠(Qiagen)(3)添加0.1%BHT和5mMC15:0國OMe/MeOH(各500pi)(4)在Freq:l/20s,1分鐘條件下粉碎(混合研磨機MM300,Qiagen)所得物(5)添加500pi10%HCl/MeOH(TokyoChemicalIndustry,保存在4°C)(6)於80。C維持1小時(恆溫金屬浴儀(Heatblock)，Iwaki)(7)加入1ml正己烷(用於鄰苯二甲酸酯分析，TokyoChemicalIndustry)(8)渦旋(混合)5秒(9)轉移上層(己烷相，800pl)至1.5-mleppendolf管(10)在減壓條件下乾燥和固化(Concentrator5301，EppendolQ(11)添加100jul正己烷(用於鄰苯二甲酸酯分才斤，TokyoChemicalIndustry)(12)轉移所得物至GC用玻璃管瓶並密封瓶(13)GC/MS分析表4用於定量分析的方法(1)稱重10粒樣本種子(鮮重)(2)將種子加至1.5-mLeppendorf管(PP)，然後添加1粒Tangsten珠(Qiagen)(3)添加0.002%BHT和0.1mMC15:0-OMe/MeOH(各500jil)(4)在Freq:l/20s，1分鐘條件下粉碎(混合研磨機MM300,Qiagen)(5)添加500pi10%HCl/MeOH(TokyoChemicalIndustry,保存在4。C)(6)於80。C維持1小時(恆溫金屬^1,Iwaki)(7)加入lml正己烷(用於鄰苯二曱酸酯分析，TokyoChemicalIndustry)(8)渦4t(混合)5秒(9)轉移上層(己烷相，800nl)至l,5-mleppendolf管(10)在減壓條件下千燥和固化(Concentrator5301，Eppendolf)(11)添加100|al正己烷(用於鄰苯二甲酸酯分析，TokyoChemicalIndustry)(12)轉移所得物至GC用玻璃管瓶並密封瓶(13)GC/MS分析(HP)通過根據上述方法進行處理所得的譜在表5的條件下分析。所述條件為能夠將由於雙鍵位置不同的位置異構體油酸(C18:l，A9)和巖芽酸(C18:l，A6)通過GC分離並分析的條件。表5分析4義器HEWLETTPACKARDGC/MSHP6890系列GC系統，5973MassSelectiveDetector柱SUPELCOSP-2380(內徑0.25mm，100m)分離程序80°C(開始時)，以3。C/分鐘升溫—180°C(維持該溫度35分鐘)，以30。C/分鐘升溫—240。<:(維持該溫度10分鐘)，總計:約80分鐘分析模式分裂(分裂比率加1)載氣:氦，流速lmL/分鐘，壓力29.9psi，平均速率20cm/秒在GC-MS系統質量檢測儀的總離子色譜圖(TotalIonChromatogram)中，用每一峰的積分值除以內部標準和相關分子量。由此計算的值的和確定為脂肪酸總量。在脂肪酸總量中的每一脂肪酸的百分率以摩爾百分率(mol-。/。)表示。此外，使用質量檢測儀檢測的碎片強度隨物質的不同而不同，已知不能簡單地反映分子量。但是，當在相同條件下分析時，再現性和定量可靠性非常高，因此進行相對比較是充分可能的。分析結果1為了測試根據本發明獲得的Dc4DES基因對巖芽酸生產的效果，使用在CaMV35S啟動子控制下的表達Dc4DES基因的pB-4DES構建體製備持續全身表達型的經轉化的植物。自經轉化的植物收集葉，提取脂肪和油成分，才艮據上述方法分析脂肪酸組成。此外，文中分析的脂肪酸組分為巖芽酸和巖萍酸前體順-4-十六碳烯酸(16:1A4)。表6顯示了這些單烯不飽和脂肪酸的分析結果。表6tableseeoriginaldocumentpage35結果，在其中導入了pB-Dc4DES的轉化體的葉中，相對於總脂肪酸量，累積了7.67wt。/。巖芽酸(在野生型擬南芥菜中未分析到)。特別地，顯示了通過^f吏用源自胡蘿蔔的Dc4DES基因，可在植物細胞中有效地生產巖芽酸(表6)。如之前所報導的(專利文獻1)，向培養的菸草細胞中導入源自芫荽的Cs4DES基因，巖芽酸含量為2.7wt%。因此，揭示了對於巖芽酸的合成和累積而言，源自胡蘿蔔Dc4DES基因的功能優於源自芫荽的Cs4DES基因的功能。分析結果2製備了使用種子特異性表達的油菜籽的油菜籽蛋白啟動子以種子特異性方式表達Dc4DES基因、Cs4DES基因、或DcPTE基因的經轉化植物。從這些種子提取脂肪和油成分，然後通過上述方法分析脂肪酸組分。表7顯示了單烯不飽和脂肪酸的分析結果。此外表7中的"NT"是"未測試"的縮寫。表7基因型脂肪酸(mol%)C16:1A4SEC18:1A6SEC20:1A8SE總計SE實驗值WT0.000.000.000.00pNCs4DES/WTT2(n=3)0.38±0.040.81±0.110.35±0.051.54±0.20pNDc4DES/WTT2(n=3)0.40±0.030.89±0.090.41±0.031.70±0.15pNDc4DESPTE/WTT2(n=6)0.37±0.011.37±0.070.53±0.032.28±0.15pNDc4DESPTEAVTT3(n=3)0.42±0.021.83±0.090.68±0.052.93±0.15文獻中的值WT0.00謹0.000.00pN-Cs4DESAVTT2(n,NTNTNT0.6±0.04pN-Cs4DES/fablT2(n=6)NTNTNT2.4±0,2結果，導入pN-Cs4DES的轉化體的種子中累積了0.81niol%巖芽酸。相反，導入pN-Dc4DES的轉化體的種子中累積了0.89mol%巖芽酸。關於在種子中合成和累積巖芹酸，源自胡蘿蔔的Dc4DES基因的功能也優於源自芫荽的Cs4DES基因的功能。在已導入了pN-Dc4DES-DcPTE的轉化體中，累積了1.83mol。/o巖芽酸。特別地，與僅導入Cs4DES基因相比，累積的巖芽酸量增加至226。/。。通過導入對巖芽醯-ACP具有高底物特異性的DcPTE,促進了巖芽酸產生。更特別地，揭示了與僅表達Dc4DES基因相比，共表達Dc4DES基因和DcPTE基因可獲得顯著高的巖芽酸累積的效果。而且，通過此共表達獲得2倍或2倍以上。通過與4DES基因共表達而使得巖芽酸累積量增加的巖芽酸生物合成系統基因是至今為止未知的。該巖芽酸生物合成系統基因是世界上首次發現的。此外，如表6所示，發現通過僅表達Dc4DES基因或通過共表達Dc4DES基因和DcPTE基因，不僅產生巖芽酸，也可產生順-8-二十碳烯酸。而且，能夠證實與僅表達Dc4DES基因相比，通過共表達Dc4DES基因和DcPTE基因能更加增加順-8-二十碳烯酸的生產量。此外，至今尚無在植物中成功生產順-8-二十碳烯酸的情形。分析結果3此外，在^4^達Dc4DES基因或DcPTE基因的經轉化的植物中，或在共表達Dc4DES基因和DcPTE基因的經轉化的植物中，分析了每一脂肪酸組成(包括飽和脂肪酸)。結果，揭示了與野生型林、與導入了Cs4DES基因的經轉化植物、以及與導入了Dc4DES基因的經轉化植物相比較，在僅表達DcPTE基因的轉化體或在共表達DcPTE基因和Dc4DES基因的轉化體的種子中飽和脂肪酸含量顯著增加(圖9)。在已導入了DcPTE基因的植物的種子中硬脂酸(C18:0)含量、二十烷酸(C20:0)含量、或二十二烷酸(C22:0)含量達到沒有導入DcPTE基因的植物的種子中相關含量的水平近2倍。基於推定的M酸序列進行分子系統樹分析的結果，將DcPTE基因歸入稱為FatA的組(其成員對不飽和脂肪酸-ACP具有特異性)的硫酯酶基因。而且，根據實施例2所示，DcPTE基因顯示對巖芽醯ACP的底物特異性的結果，可以預測增加不飽和脂肪酸含量的效果。但是，難於預測增加飽和脂肪酸生產的效果。因此，揭示了DcPTE基因具有本領域技術人員無法預測的特別顯著的效果。在通過氧化分解源自植物的脂肪酸而製備尼龍原材料(二羧酸)時，DcPTE基因具有特別有利的特性。特別地，所述特性為除了促進巖芽酸累積之外，還增加C18(或更大碳數)的飽和脂肪酸的含量的效果。更特別地，DcPTE基因能增加飽和脂肪酸含量，從而降低除巖芽酸外的不飽和脂肪酸含量(為由於氧化分解而引起世代不純的原因)。此外，此效果不僅可通過使用與另一基因(如Dc4DES基因)組合而獲得，而且可通過僅使用DcPTE基因獲得，因此，DcPTE基也可用於除巖芽酸累積外的用途(如飽和脂肪酸生產)，以製備樹脂原材料。工業利用性根據本發明，可提供用於在巖芽酸生產中增加巖芽酸合成量的新基因。此外，提供了使用該基因生產巖芽酸的新方法。使用本發明的參與巖芽酸生產的基因，可以例如在植物種子中大量累積巖芽酸。本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請均在本說明書中全文引用作為參考。權利要求1.編碼以下蛋白質(a)、(b)或(c)的基因(a)包含SEQIDNO2所示胺基酸序列的蛋白質；(b)包含在SEQIDNO2所示胺基酸序列中刪除、替換或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列並具有Δ4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性的蛋白質；或者(c)由在嚴格條件下與包含互補於SEQIDNO1所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼並具有Δ4-棕櫚醯-ACP去飽和酶活性的蛋白質。2.編碼以下蛋白質(a)、(b)或(c)的基因(a)包含SEQIDNO:4或6所示^J^酸序列的蛋白質；(b)包含在SEQIDNO:4或6所示胺基酸序列中刪除、替換或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列並具有巖芹醯-ACP硫酯酶活性的蛋白質；或者(c)由在嚴格條件下與包含互補於SEQIDNO:3或5所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼並具有巖芽醯-ACP疏酯酶活性的蛋白質。3.具有根據權利要求1的基因和/或根據權利要求2的基因的表達載體。4.導入了根據權利要求1的基因和/或根據權利要求2的基因的轉化體。5.用於產生巖芽酸的方法，所述方法包括將根據權利要求l的基因和/或根據權利要求2的基因導入植物細胞，產生經轉化的植物的步驟；以及從由經轉化的植物收集來的組織提取巖芽酸的步驟。6.能夠產生巖,酸的經轉化的植物細胞或經轉化的植物，其中導入了根據權利要求1的基因和根據權利要求2的基因。7.能夠產生順-4-十六碳烯酸的經轉化的植物細胞或經轉化的植物，其中導入了根據權利要求1的基因和根據權利要求2的基因。8.能夠產生順-8-二十碳烯酸的經轉化的植物細胞或經轉化的植物，其中導入了才艮據權利要求1的基因和根據權利要求2的基因。9.能夠增加飽和脂肪酸生產的經轉化的植物細胞或經轉化的植物個體，其中導入了根據權利要求2的基因。10.根據權利要求5的用於產生巖芽酸的方法，其包括使用具有種子然後自種子提取巖萍酸。11.根據權利要求5的用於產生順-4-十六碳烯酸的方法，其包括使用具有種子特異的啟動子和位於該啟動子下遊的上述基因的表達載體轉化植物細胞，然後自種子提取順-4-十六碳烯酸。12.根據權利要求5的用於產生順-8-二十碳烯酸的方法，其包括使用具有種子特異的啟動子和位於該啟動子下遊的上述基因的表達載體轉化植物細胞，然後自種子提取順-8-二十碳烯酸。13.根據權利要求5的用於產生飽和脂肪酸的方法，其包括使用具有種子特異的啟動子和位於該啟動子下遊的上述基因的表達載體轉化植物細胞，然後自種子提取飽和脂肪酸。全文摘要提供了能夠促進巖芹酸累積的新基因和使用所述基因生產巖芹酸的方法。此新基因編碼以下蛋白質(a)、(b)或(c)(a)包含SEQIDNO4或6所示胺基酸序列的蛋白質；(b)包含在SEQIDNO4或6所示胺基酸序列中刪除、替換或添加一個或多個胺基酸的胺基酸序列並具有巖芹醯-ACP硫酯酶活性的蛋白質；或者(c)由在嚴格條件下與包含互補於SEQIDNO3或5所示核苷酸序列的核苷酸序列的DNA雜交的DNA編碼並具有巖芹醯-ACP硫酯酶活性的蛋白質。文檔編號C12N15/09GK101213298SQ20068002414公開日2008年7月2日申請日期2006年6月29日優先權日2005年6月30日發明者岡村幸治,山中陽子,村本伸彥,西田生郎申請人:豐田自動車株式會社