一株賴氨酸合成缺陷的炭疽桿菌株及其構建方法
2023-07-10 04:51:01
專利名稱：一株賴氨酸合成缺陷的炭疽桿菌株及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一株賴氨酸合成缺陷的炭疽桿菌株及其構建方法。
背景技術：
炭疽桿菌是一種杆狀、能形成芽胞的革蘭氏陽性桿菌，能夠引起人畜的炭疽病，如 果不及時治療，死亡率極高。炭疽是五大人畜共患病之一，危害性極強，對世界各地的人類健康及畜牧業都構成了嚴重威脅。炭疽桿菌的芽孢接觸到皮膚傷口、消化道或呼吸道上皮後，將感染並會導致皮膚炭疽、肺炭疽、腸道炭疽等疾病。肺炭疽最為嚴重，將很快導致疾病和死亡。炭疽桿菌還被用作生物戰劑和製造生物恐怖，對社會穩定構成威脅。故炭疽桿菌相關研究一直廣受關注。定量蛋白質組學是把一個基因組表達的全部蛋白質或一個複雜的混合體系中所有的蛋白質進行精確的定量和鑑定的一門學科。這一概念的提出標誌著蛋白質組技術的不斷改進和完善。蛋白質組學研究已從對蛋白質簡單的定性向精確的定量方向發展。蛋白質組定量的概念是試圖準確地測定蛋白質組間相對含量的差別，而不在於測定其絕對的濃度。2002年，丹麥Mann實驗室建立了 SILAC技術，並首次將其應用於定量蛋白質組研究，為全面、系統地定性和定量分析細胞複雜蛋白質組提供了有效的方案。SILAC基本原理是分別用天然同位素(輕型)或穩定同位素(重型)標記的必需胺基酸取代培養基中相應胺基酸，賴氨酸合成缺陷的菌株只能利用培養基中添加的賴氨酸，因而經5-6個生長周期後，穩定同位素標記的胺基酸將會完全摻入到新合成的蛋白質中替代原有胺基酸。不同標記細胞的裂解蛋白按等比例混合，經分離純化後即可進行定量質譜鑑定。SILAC具有無可比擬的巨大優勢它是一種體內標記技術，穩定同位素標記的胺基酸與天然胺基酸化學性質基本相同，對細胞無毒性，因而所標記的細胞和未標記細胞在生物學行為上幾乎沒有差異，所得實驗結果也自然更加接近樣品真實狀態，並且其標記效率可高達100%。因此，可以說，SILAC技術是定量蛋白質組學研究的不二選擇。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種製備重組菌A的方法。本發明提供的方法，為將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因，即得到重組菌A。上述方法中，所述將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因通過同源重組實現。上述方法中，所述同源重組包括如下步驟I)將含有抗性篩選標記物基因的片段導入所述炭疽桿菌中，通過同源重組將所述抗性篩選標記物基因替換掉所述炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因，得到同源重組後重組菌B ;所述含有抗性篩選標記物基因的片段具體通過重組載體導入炭疽桿菌中；所述含有抗性篩選標記物基因的片段的核苷酸序列為序列表中的序列I ;2)將所述重組菌B在37°C -40°c培養，以去除所述重組載體，得到重組菌C。
上述方法中，步驟I)中，所述含有抗性篩選標記物基因的片段通過重組載體導入炭疽桿菌中；所述重組載體為將序列表中的序列I所示DNA片段通過同源重組插入溫度敏感型穿梭質粒中得到的載體；所述溫度敏感型穿梭質粒具體為PKSV7 ；上述方法中，在所述步驟I)前，還包括將所述重組載體去甲基化的步驟。上述將所述重組載體去甲基化的方法包括如下步驟I)、將所述重組載體轉入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組菌D ；2)、從所述重組菌D中提取質粒，得到去甲基化的重組載體。上述方法中，在所述步驟I)和步驟2)之間還包括將所述重組菌B經過傳代培養的步驟。在所述步驟2)後，還包括將所述重組菌C分別在僅含有所述抗性篩選標記物培養基和僅含有所述重組載體的抗性篩選標記物I的培養基中培養，選取在僅含有所述抗性篩選標記物培養基生長且在僅含有所述重組載體的抗性篩選標記物I的培養基上不生長的菌，得到重組菌A。上述方法中，所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ；所述抗性篩選標記物為壯觀黴素，其核苷酸序列為序列I自5』末端第934-2215位核苷酸；所述重組載體的抗性篩選標記物I為氯黴素。上述炭疽桿菌為炭疽桿菌A16。由上述的方法製備的重組菌A也是本發明保護的範圍。本發明的另一個目的是提供一種DNA分子。本發明提供的DNA分子，為如下⑴或⑵或(3):(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子；(3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。 本發明的第三個目的是一種重組載體。本發明提供的重組載體，為將上述的DNA分子插入溫度敏感型穿梭質粒中得到的載體；所述溫度敏感型穿梭質粒具體為PKSV7。本發明的實驗證明，本發明提供的方法構建了炭疽桿菌野生株A16的賴氨酸基因缺失株，其不能自身合成賴氨酸，只能從外源獲取。該缺失株的成功構建為進一步做定量蛋白質組學研究奠定了基礎。
圖I為序列I各序列組成的結構2為同源重組原理進行各片段連接示意3為重組質粒轉化DH5 a PCR鑑定4為重組質粒轉化DH5 a質粒酶切5為重組質粒轉化SCSllO菌落PCR圖6為重組質粒轉化SCSI 10PCR鑑定7為重組質粒轉化SCSllO質粒酶切8為重組質粒電轉A16鑑定圖9為目的菌株外部及內部引物PCR鑑定圖10為突變株表型鑑定
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、賴氨酸合成缺陷的炭疽桿菌株A16/ ALysA: : spc的獲得一、A16/去甲基化pKLysAUSD的獲得I、重組質粒pKLysAUSD的構建I)溫敏型質粒線性化骨架質粒溫度敏感型穿梭質粒pKSV7 :Smith K, Youngman P. Use of a newintegrational vector to investigate compartment-specific expression of theBacillus subtilis spoIIM gene [J] Biochimie，1992，74 :705-711.公眾可從中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所獲得，含氯黴素抗性基因cat。將溫度敏感型穿梭質粒pKSV7(6. 9Kb)用限制性內切酶HindIII和EcoRI酶切線性化，得到線性化PKSV7。從凝膠上切下目標條帶，用DNA凝膠回收試劑盒回收線性化載體片段，操作步驟按照說明書進行。2)目標基因(LysA)上下遊同源臂的獲取
使用Primer premier 5. 0軟體,根據炭疽桿菌Ames株染色體上賴氨酸合成基因LysA基因(NC003997的第1361225-1362541位)上下遊序列，設計LysA基因上下遊同源臂序列的引物(LysU_HindF和LysU_R擴增up片段,LysD_F和LysD_EcoR擴增down片段,如表I所示)。表I研究中使用的引物
權利要求
1.一種製備重組菌A的方法，包括如下步驟將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因，即得到重組菌A。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因通過同源重組實現。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於 所述同源重組包括如下步驟 1)將含有抗性篩選標記物基因的片段導入所述炭疽桿菌中，通過同源重組將所述抗性篩選標記物基因替換掉所述炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因，得到同源重組後重組菌B ;所述含有抗性篩選標記物基因的片段具體通過重組載體導入炭疽桿菌中； 所述含有抗性篩選標記物基因的片段的核苷酸序列為序列表中的序列I ; 2)將所述重組菌B在37°C-40°C培養，以去除所述重組載體，得到重組菌C。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特徵在於 所述重組載體為將序列表中的序列I所示DNA片段插入溫度敏感型穿梭質粒中得到的載體；所述溫度敏感型穿梭質粒具體為PKSV7。
5.根據權利要求1-4中任一所述的方法,其特徵在於 在所述步驟I)前，還包括將所述重組載體去甲基化的步驟。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法,其特徵在於 所述將所述重組載體去甲基化的方法包括如下步驟 1)、將所述重組載體轉入甲基化酶缺陷的大腸桿菌中，得到重組菌D； 2)、從所述重組菌D中提取質粒，得到去甲基化的重組載體。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法,其特徵在於 在所述步驟I)和步驟2)之間還包括將所述重組菌B經過傳代培養的步驟。
在所述步驟2)後，還包括將所述重組菌C分別在僅含有所述抗性篩選標記物培養基和僅含有所述重組載體的抗性篩選標記物I的培養基中培養，選取在僅含有所述抗性篩選標記物培養基生長且在僅含有所述重組載體的抗性篩選標記物I的培養基上不生長的菌，得到重組菌A。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特徵在於 所述甲基化酶缺陷的大腸桿菌為大腸桿菌SCSllO ； 所述抗性篩選標記物為壯觀黴素； 所述重組載體的抗性篩選標記物I為氯黴素。
9.由權利要求1-8中任一所述的方法製備的重組菌A。
10.一種DNA分子，為加下(I)或⑵或(3): (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子； (3)與(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
或一種重組載體，為將所述的DNA分子插入溫度敏感型穿梭質粒中得到的載體；所述溫度敏感型穿梭質粒具體為PKSV7。
全文摘要
本發明公開了一株賴氨酸合成缺陷的炭疽桿菌株及其構建方法。本發明提供方法，為將抗性篩選標記物基因替換掉炭疽桿菌基因組中的賴氨酸合成基因得到的重組菌。上述方法中，所述抗性篩選標記物基因為壯觀黴素抗性基因；所述壯觀黴素抗性基因的核苷酸序列具體為序列表中序列1自5』末端第1018-2147位核苷酸。本發明的實驗證明，本發明提供的方法構建了炭疽桿菌野生株A16的賴氨酸基因缺失株，其不能自身合成賴氨酸，只能從外源獲取。該缺失株的成功構建為進一步做定量蛋白質組學研究奠定了基礎。
文檔編號C12N15/80GK102628019SQ201210099920
公開日2012年8月8日 申請日期2012年4月6日 優先權日2012年4月6日
發明者馮爾玲, 劉先凱, 朱力, 王恆樑, 王雪芳, 高飛 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所