一種生產γ-幹擾素的純化方法
2023-07-10 09:43:36 1
專利名稱：一種生產γ-幹擾素的純化方法
技術領域：
本發明涉及生物製劑領域，更具體地說，是涉及一種用於生產豬Y-幹擾素的純化方法。
背景技術：
幹擾素(IFN)是一類具有廣泛生物學活性的蛋白質，具有調節機體免疫功能、抗病毒、抗腫瘤等多種作用，是機體防禦系統的重要組成部分。IFN的抗病毒活性是通過宿主細胞而間接完成的，並具有嚴格的種屬特異性及選擇性。根據其來源和結構，IFN可分為a 、 13 、 Y三種類型，近年來，還發現了 "、 t等類型的幹擾素。IFN-a主要由單核細胞產生；IFN-P主要由纖維母細胞產生，血管內皮細胞也可產生；IFN-Y由抗原及PHA等有絲分裂原剌激T細胞後產生，此外，NK細胞也可產生。IFN-t是反芻動物孕體附植時滋養層細胞分泌的特有的妊娠識別信號因子，在妊娠識別中發揮著重要的作用。
其中，IFN-Y是具有促炎作用的細胞因子，由Thl細胞和NK細胞分泌，可誘導機體非特異性的免疫，保護機體免受病毒感染；IFN-Y與機體內細胞因子網絡相互作用顯著，可誘導細胞分泌IL-1、 IL-6、 TNF-a 、 IL_8、 MCP-1等細胞因子，並可上調TNF、淋巴毒素和IL-1等細胞因子的受體，從而增強了其促炎作用；IFN-y可使巨噬細胞和中性粒細胞上Fc受體表達增加，使多種組織細胞II類MHC表達增加，從而增強這些細胞的吞噬活性和抗原遞呈能力；IFN-Y可剌激巨嗜細胞內活性氧和活性氮的產生，增強細胞內殺菌和殺寄生蟲活性；IFN-Y能抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞株的分化，同時能直接抑制病毒的複製，調節細胞免疫和抗細胞增殖的功能，所以又稱免疫幹擾素。由此可見，IFN-Y是一類非常有前途的生物類藥物。 豬幹擾素是被研究最早的動物幹擾素之一，20世紀80年代就有豬幹擾素的相關報導。近年來，對豬幹擾素的誘導條件和理化活性有了進一步的研究，同時對豬白細胞幹擾素進行了大量的臨床試驗。研究表明，它對豬的許多病毒性傳染病，如流行性腹瀉、豬瘟、傳染性胃腸炎等，以及對牛病毒性腹瀉、小鵝瘟，羔羊腹瀉等都具有不錯的療效，試驗證實豬幹擾素與牛羊等動物之間存在交叉活性。最近幾年，豬幹擾素a 、 13 、 Y基因的分子克隆與序列分析獲得成功。謝海燕等採用PCR技術克隆得到的IFN-a基因由501個核苷酸組成，共編碼166個胺基酸；夏春等克隆得到的豬13幹擾素IFN-P基因片段有668個核苷酸，編碼186個胺基酸。曹瑞兵等從經ConA誘導培養的豬外周血白細胞中擴增出豬IFN-Y基因，經改造後插入原核表達載體PRLG，並實現了在大腸桿菌中的高效表達，表達產物以包涵體形式存在，經變性、復性、脫鹽、凝膠層析純化處理，重組豬IFN-y具有較高的幹擾素活性。同時，萬建青、陳濤等分別成功地在畢赤酵母表達系統和大腸桿菌表達系統中表達出重組幹擾素基因，表達產物佔菌體總蛋白的比率在20% 35%之間，表達產物具有的抗病毒活性，為基因工程幹擾素的規模化生產和應用提供了可能。 目前，生產動物用的幹擾素(如豬幹擾素)的常見方法有在動物體內提取、構建基因工程菌株表達生產。其中利用重組菌株表達生產幹擾素，具有表達量高、抗病毒活性強的
3優點。因此，成為了幹擾素批量生產的趨勢。 但是，利用重組菌株表達生產幹擾素，在後期的分離純化過程中一般都要使用價值昂貴的單抗柱，純度才能達到95 %以上；而目前國產的單抗柱，無論在產量和質量上，都不能滿足廠家的需要，而只能高價進口，增加生產成本。因此，目前需要一種經濟、快速、高效地的純化方法，以用於生產幹擾素。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中存在的不足，提供一種經濟、快速、高效的Y-幹擾素純化方法。
因此，本發明目的在於提供一種Y _幹擾素純化方法，步驟包括
(1)重組菌株進行發酵； (2)離心發酵液(6500rpm，離心15min)取上清，通過微濾除雜、超濾濃縮；[(Km] (3)濃縮液過陽離子層析柱(CM S印harose柱層析)，以A液(20mM NH4Ac，pH8)和B液(20mM NH4Ac，0. 7M NaCl， pH8)組成的離子強度遞增溶液洗脫，收集第四個峰；
(4)加入硫酸銨30% (v/v)至稍混濁，離心取上清(7000rpm，離心10min);
(5)過S印hacryl S-200凝膠層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰；
(6)過S印hadex G_75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液；
(7)得到純度高於97. 5%的幹擾素原液，置於4t:冰箱保存。
在一個具體實施方案中，在實施步驟5之前，先去熱原，用50mmol/L， pH5. 5的醋酸緩衝液平衡，上樣。其中，去熱源的方法包括高溫法、吸附法、超濾法、蒸餾法、酸鹼法、其它方法等。其中，優選是吸附法。 在另一具體實施方案中，在實施步驟6之前，將充分浸泡後的S印hadex G_75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、 pH7. 0的PBS緩衝液平衡，上樣。其中，去熱源的方法優選吸附法。 應當指出，本發明目的不在於提供一種具體的重組菌株來生產Y幹擾素，而是提供對重組菌株的產物進行純化，以獲得高純度的Y幹擾素產品。因此所述的重組菌株可包括各種常規的重組菌株，例如大腸桿菌工程菌、酵母(如畢赤酵母)工程菌、重組病毒。本發明優選酵母工程菌。 應當指出，本發明目的不在於提供一種特定Y幹擾素的純化方法，而是提供常規Y幹擾素類型進行純化，以獲得高純度的Y幹擾素產品。因此所述的Y幹擾素可包括各種動物用Y幹擾素，例如畜用Y幹擾素、禽類Y幹擾素、魚類Y幹擾素。本發明優選豬Y幹擾素。
術語"熱原"係指由微生物產生的能引起恆溫動物體溫異常升高的致熱物質。它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。這裡所指的"熱原"，主要是指細菌性熱原，是某些細菌的代謝產物、細菌屍體及內毒素。致熱能力最強的是革蘭氏陰性桿菌的產物，其次是革蘭陽性桿菌類，革蘭陽性球菌則較弱，黴菌、酵母菌、甚至病毒也能產生熱原。熱原通常是磷脂多醇與蛋白質結合而成的複合物。磷脂多醇是複合物的活性中心，致熱作用最強。其化學組成因菌種不同而有所差異。分子量為5乂104 5乂105，分子量越大致熱作用也越強。
去熱原的方法包括 1.高溫法熱原的耐熱性能良好，6(TC加熱lh不被分解破壞，10(TC不降解，但
180°C 3 4h、200。C 60min或250°C 30 45min可使熱原徹底破壞。因此耐熱物品如玻璃
製品、金屬製品、生產過程中所用的容器和其它用具以及注射時使用的注射器等，均可採用
此法破壞熱原。但在通常使用的注射劑熱壓滅菌條件下不足以破壞熱原。 2.吸附法熱原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由於活性炭
性質穩定、吸附性強兼具助濾和脫色作用，故廣泛用於注射劑生產，但應注意吸附藥液所造
成的主藥的損失。 3.超濾法熱原分子量為1Xl(f左右，體積較小，約1 5nm，可以通過一般濾器和微孔濾膜，但採用超濾法如用3. 0 15nm超濾膜可將其除去。 4.蒸餾法熱原能溶於水但不揮發，但可隨水蒸氣的霧滴進入注射用水中，因此製備注射用水時，原水中的熱原可經蒸餾除去，但需多次蒸餾，，並加有隔沫裝置，單次蒸餾往往效果不理想。
5.酸鹼法熱原能被強酸、強鹼、強氧化劑破壞。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、輸液瓶等可用重鉻酸鉀硫酸清潔液或稀氫氧化鈉處理，破壞熱原。
6.其它包括離子交換法、凝膠濾過法、反滲透法等。
有益效果 本發明提供的重組菌株表達幹擾素的後續純化方法，無需使用價格昂貴的單抗柱，避免了單抗脫落造成的汙染，縮短了純化時間，降低了生產成本，最終可得到純度高於97.5%的幹擾素原液，在工業生產中應用將會帶來良好的經濟效益。
具體實施方案 下面結合實施例對本發明做進一步的描述。
實施例1 :重組畢赤酵母表達豬Y _幹擾素的純化
(1)重組菌株進行發酵； (2)離心發酵液(6500rpm，離心15min)取上清，通過微濾除雜、超濾濃縮；
(3)濃縮液過陽離子層析柱(CM S印harose柱層析)，以A液(20mM NH4Ac， pH8)和B液(20mM NH4Ac，0. 7M NaCl，pH8)組成的離子強度遞增溶液洗脫，收集第四個峰；
(4)加入硫酸銨30% (v/v)至稍混濁一離心取上清(7000rpm，離心10min);
(5)先去熱原，用50mmol/L， pH5. 5的醋酸緩衝液平衡，過S印hacryl S-200層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰，其中通過吸附法進行去熱原；
(6)將充分浸泡後的S印hadex G-75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、pH7. 0的PBS緩衝液，過S印hadex G-75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液，其中通過吸附法進行去熱原； (7)得到純度高於97. 5%的幹擾素原液，置於4。C冰箱保存。
實施例2 :豬Y -幹擾素的活性測試 對重組畢赤酵母表達豬Y _幹擾素的後續純化結果(取3批)進行檢測 (1)生物活性檢測採用半數細胞抑制病變法，應用VSV-MDBK系統。參照《中華人民共和國藥典》2005年版。 (2)SDS-PAGE測產品的純度分離膠15%，濃縮膠5%，上樣量10ii g，考馬斯亮藍250染色。 (3)HPLC分析產物純度採用C18柱，柱長250mmX4. 6mm，以0_70%乙腈-0. 1%
TFA做線性梯度洗脫。 實驗結果如下表1 : 表1
產品批號123
生物活性(IU/mL)6. 78X1066. 39X1064. 98X106
SDS-PAGE檢測純度(％ )97. 697. 897. 6
HPLC檢測純度(% )100100100 由表l數據可知，本發明所得到的三批豬Y-幹擾素的純度均高於97. 5%，且活性均達到106IU/mL以上。 通過上述實施例，我們發現所純化的Y幹擾素具有預期的活性，並且本發明的純化方法無需使用價格昂貴的單抗柱，避免了單抗脫落造成的汙染，縮短了純化時間，降低了生產成本，最終可得到純度高於97.5%的幹擾素，具有廣闊的應用市場。
權利要求
一種生產γ-幹擾素的純化方法，步驟包括(1)重組菌株進行發酵；(2)離心發酵液(6500rpm，離心15min)取上清，通過微濾除雜、超濾濃縮；(3)濃縮液過陽離子層析柱(CM Sepharose柱層析)，以A液(20mM NH4Ac，pH8)和B液(20mM NH4Ac，0.7M NaCl，pH8)組成的離子強度遞增溶液洗脫，收集第四個峰；(4)加入硫酸銨30％(v/v)至稍混濁，離心取上清(7000rpm，離心10min)；(5)過Sephacryl S-200凝膠層析柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫峰；(6)過Sephadex G-75色譜柱，通過SDS-PAGE檢測收集目標洗脫液；(7)得到純度高於97.5％的幹擾素原液，置於4℃保存。
2. 權利要求1所述的方法，其中在實施步驟5之前，先去熱原，用50mmol/L， pH5. 5的醋酸緩衝液平衡，上樣。
3. 權利要求2所述的方法，其中去熱原的方法包括高溫法、吸附法、超濾法、蒸餾法、酸鹼法、其它方法等，優選是吸附法。
4. 權利要求l所述的方法，其中在實施步驟6之前，將充分浸泡後的S印hadex G-75凝膠裝入色譜柱中，去熱原，用10mmol/L、pH7. 0的PBS緩衝液平衡，上樣。
5. 權利要求4所述的方法，其中去熱原的方法包括高溫法、吸附法、超濾法、蒸餾法、酸鹼法、其它方法等，優選是吸附法。
6. 權利要求l-5中任一項所述的方法，其中所述的重組菌株大腸桿菌工程菌、酵母(如畢赤酵母)工程菌、重組病毒，優選酵母工程菌。
7. 權利要求l-5中任一項所述的方法，其中所述的y幹擾素畜用y幹擾素、禽類y幹擾素、魚類y幹擾素，優選豬y幹擾素。
全文摘要
本發明公開了一種生產高純度γ-幹擾素的純化方法，生產步驟包括發酵、粗提發酵液、陽離子層析柱純化、硫酸銨純化、Sephacryl S-200層析柱純化、Sephadex G-75色譜柱純化等，其中在層析之前先去熱原。本發明方法無需要單克隆抗體層析柱，能經濟、快速、高效地獲得純度高於97.5％γ-幹擾素，在γ-幹擾素的生產和研究領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12P21/04GK101759768SQ20081015434
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月23日 優先權日2008年12月23日
發明者李旭東, 王麗娟, 蘇建東 申請人:天津瑞普生物技術股份有限公司