長效肽類似物的製作方法

2023-07-10 15:48:36 1

長效肽類似物的製作方法
【專利摘要】本文提供了CLR/RAMP受體的長效激動劑類似物，其具有延長的體內半衰期。
【專利說明】長效肽類似物
【背景技術】
[0001]生理學的許多方面，例如飢餓、應激反應和生殖都依賴於控制的激素平衡。這種平衡能夠響應於內部和外部刺激。例如，垂體前葉的激素分泌在很大程度上受到下丘腦的控制，下丘腦是恰位於垂體前葉上方的大腦區域。已知下丘腦神經元通過在腦垂體中產生特定激素的特定細胞組製造並釋放刺激或抑制該特定激素分泌的肽因子。
[0002]不同的下丘腦釋放肽在調節不同垂體前葉激素(例如GH、ACTH、TSH、LH和FSH)的分泌中是重要的。然而，垂體前葉釋放的催乳素(或催乳激素)的調節更加複雜，並且涉及來源於下丘腦和垂體中葉的刺激因子(參見Laudon等人(1990) Endocrinology 126:3185-319 2; Ben-Jonathan 和 Hnasko (2001) Endocr.Rev.22:724-763)。儘管已經很好地證明了垂體中葉在調節催乳素分泌中的作用，並且中葉和後葉對於由哺乳和雌二醇誘導催乳素釋放增加是必不可少的，但來自中葉的催乳素釋放因子的確認仍然有待表徵(Allen等人(1995) Endocrino1gyI36:3093-3099)。
[0003]垂體降鈣素受體樣受體(CRLR)與催乳素釋放有關(Meeran等人1997.J.Clin.Endocrinol.Metab.82:95-100)，但缺少與大腦中降鈣素基因相關肽(CGRP)結合位點重疊的降鈣素基因相關肽(CGRP)表達譜(Krugerl988.Brain Res.463:223-244)。最初作為鈣平衡必須的多肽激素分離的降鈣素屬於一組肽類激素，包括^ CGRP, ^ CGRP、腎上腺髓質素 (ADM)和胰澱素(Eto (2001)122:1693-1711)。這些組織特異性肽是用於在血管和呼吸系統中維持體內穩態的重要內分泌和神經分泌整合子(integrator )。
[0004]這些肽的生物學作用經由與兩種緊密相關的II型G蛋白偶合受體 (GPCR) (即，降鈣素受體和CRLR結合而介導(Christopoulos等人(1999)Mol.Pharmacol.56:235-242;Poyner 等人(2002)Pharmacol.Rev.54:233-246)。儘管降鈣素受: 體是降鈣素作用的主要調節子，但其也結合胰澱素。最近的克隆和功能性研究已經表明， CGRPs, ADM與CRLR和三種受體活性調節蛋白(RAMP)的不同組合發生相互作用，並且胰澱素以較小的程度與CRLR和三種受體活性調節蛋白(RAMP)的不同組合發生相互作用；參見 McLatchie 等人(1998) Nature393:333-339。
[0005]許多細胞表達多種RAMP。需要降鈣素受體樣受體(CRLR)和受體活性調節蛋白 (RAMP)的共表達以生成降鈣素基因相關肽(CGRP)和腎上腺髓質素(ADM)的功能性受體。 RAMP和CRLR之間的異質二聚體形成對於適當的細胞表面靶向以及CGRP和ADM受體的藥理學特性是必不可少的。RAMP家族包含三個成員(RAMP-l、RAMP-2和RAMP-3)，其共有少於 30%的序列同一性,但卻是常見的拓撲組織(common topological organization)。它們是小的固有膜蛋白(預期大小:Mrl4，000-17，000)，具有大的細胞外N末端(~100個胺基酸)、 單個跨膜結構域和非常短的細胞內結構域(10個胺基酸)。RAMPl與CRLR的共表達導致形成CGRP受體，而RAMP2和RAMP3促進ADM受體的表達。當降鈣素受體與RAMPl共表達時， 其提供CGRP/胰澱素受體，而當降鈣素受體與RAMP3共表時，其提供胰澱素受體。
[0006]利用a CGRP、ADM或胰澱素缺陷的突變小鼠進行的研究表明，在不同的系統中， CRLR對於心血管形態發生、感覺神經傳遞、炎症反應、疼痛行為和葡萄糖穩態是很重要的。因此，通過受體結合特異性和個別配體的組織表達譜來確定該家族中肽的生理功能。
[0007]肽類激素是臨床應用和治療開發中很感興趣的，包括高血壓的治療和心血管內穩態的維持。除了這些作用之外，催乳素釋放因子的識別也是人們感興趣的。儘管催乳素在哺乳動物妊娠期和哺乳期內十分重要並且與乳腺發育和促進乳汁合成有關，但迄今為止特異性催乳素釋放激素仍然是未知的。
[0008]相關出版物
[0009]Hay 和 Smith (2001) Trends Pharmacol.ScL 22:57-59;以及 Shindo 等人(2001) Circulationl04:1964-197討論了腎h腺髓質素在血管中的重要件。Zhang等人(2001) Pain89:265-273; Salmon 等人(1999) NeuroreportlO: 849-854;以及 Salmon 等人(2001) Nat.Neurosc1.4:357-358 討論了 CGRP 的作用。Mulder 等人(2000) Am.1.Physiol.Endocrinol.Metab.278:E684_691 討論了胰澱素的作用。
[0010]GenBank 登錄 AF529213。

【發明內容】

[0011]本文提供了長效肽類似物，其具有垂體中葉素或腎上腺髓質素的生物活性，包括擔當降鈣素受體樣受體的配體，但與天然多肽相比，其具有實質上更長的體內半衰期。與天然肽相比，本發明的類似物具有持續至少2倍長的持續時間的體內效力，並且可以是5倍長、10倍長、20倍長或更長。可以通過確定多肽的穩定性、生理作用的時間長短等在體內或體外測量增加的體內活性。
[0012]在本發明的一些實施方式中，該類似物包含在N-末端被修飾的生物活性垂體中葉素或腎上腺髓質素多肽。所關注的N-末端修飾包括結合於脂肪酸，通常為C4至C30脂肪酸，其可以是不飽和的或飽和的。感興趣的脂肪酸包括，但不限於，棕櫚酸；硬脂酸；花生酸；月桂酸；肉豆蘧酸；肉豆蘧油酸；棕櫚油酸；十六碳烯酸(sapienic acid);油酸；亞油酸；a -亞麻酸；花生四烯酸；二十碳五烯酸；芥酸；二十二碳六烯酸 ；等。在其他的實施方式中，通過聚乙二醇化、糖基化來修飾、結合於大的蛋白(例如白蛋白)或結合於聚合物並結合胺基酸修飾(例如，利用D-胺基酸或P胺基酸)來修飾多肽，以增加生物半衰期。
[0013]本發明的類似物提供了 CLR/RAMP受體的長效激動劑類似物。該類似物可提供對心率的有限作用，而對血壓產生顯著作用。血清中長效肽的區室化(compartmentalization) 在給定的時間點有效減少了細胞刺激激動劑的可用部分，從而減輕了注射的肽的波峰和波谷效應並消除了不希望的副作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1A-1C是用長效垂體中葉素肽(棕櫚酸-修飾的MD，IMD-PA)處理後的SHR大鼠中的血壓測量值的實施例，A.30nmol/kg體重(BW) ；B/C, IOOnmoI/kg BW。
[0015]圖2A-2B是注射野生型垂體中葉素肽(MD，IOOnmoI/kg BW)後的SHR大鼠中的血壓測量值的實施例。頂D-PA肽的降壓作用在體內持續超過5小時，而未經修飾的MD肽則持續小於I小時。
[0016]圖3A-3B是在對照動物中注射PBS後的BP測量值。
[0017]圖4示出了表達三種不同受體(CLR/RAMP1、CLR/RAMP2和CLR/RAMP3)的293T細胞中MD和MD-PA的刺激效應。
[0018]圖5A-5C示出了在注射長效腎上腺髓質素肽(棕櫚酸-結合的ADM，ADM-PA, lOOnmol/kg BW)之後SHR大鼠的收縮壓測量值的實施例。該肽的降壓作用在體內持續超過 5小時。相對而言，未經修飾的ADM肽的降壓作用通常持續小於1.5小時。
[0019]圖6A-6B示出了在注射對照鹽水之後SHR大鼠的收縮壓測量值的實施例。
[0020]圖7示出了在表達重組腎上腺髓質素受體I (CLR/RAMP2)和2 (CLR/RAMP3)的 293T細胞中ADM和ADM-PA的刺激作用。儘管ADM-PA肽在體外的刺激作用低於野生型ADM， 但其在體內具有顯著更長的有效期(effective life)。
[0021]圖8示出了在腹腔內注射後12小時，與ADM肽相比，在體內保留顯著較高水平的免疫反應性ADM-PA。
【具體實施方式】
[0022]本發明提供了作為降鈣素肽激素家族成員的垂體中葉素或腎上腺髓質素的新型多肽類似物。
[0023]垂體中葉素是降鈣素受體樣受體的配體。人垂體中葉素基因編碼148個胺基酸的開放閱讀框，具有用於在N-末端分泌的24個胺基酸信號肽和成熟的醯胺化肽(在SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2中示出)。成人垂體中葉素肽包括但不限於40胺基酸肽(垂體中葉素-短或頂DS)，如SEQ ID NO:3所示，其對應於成熟蛋白的殘基8-47 ;和47-胺基酸成熟肽(垂體中葉素-長或頂DL) （在SEQ ID N0:4所示。該垂體中葉素肽可用末端賴氨酸殘基取代以易於修飾。例如，感興趣的垂體中葉素肽示於SEQ ID NO: 7:K(mod)GCVLGTCQVQNLSH RLWQLMGPAGRQDSAPVDPSSPHSY，其中末端賴氨酸被修飾，例如通過連接脂質或其他基團。
[0024]腎上腺髓質素是降鈣素受體樣受體的配體。ADM基因編碼前激素原，其被翻譯後修飾以生成2種生物活性肽:腎上腺髓質素和前體腎上腺髓質素N-末端20肽(PAMP)。腎上腺髓質素由52個胺基酸構成，其具有I個分子內二硫鍵，並且顯示出與降鈣素基因相關肽少量同源。該前體被稱為前體腎上腺髓質素，長度為185個胺基酸。參見Genbank編號 NM_001124，其通過引用方式結合於本文。該前體多肽(SEQ ID NO:5)具有如下的胺基酸序列:
[0025]MKLVSVALMYLGSLAFLGADTARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTG LADVKAGPAQTLI RPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCR FGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQ GYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSK PQAHGAPAPPSGSAPHFL。
[0026]出於本發明的目的，除非另外具體說明，術語「腎上腺髓質素肽」可以是指衍生自腎上腺髓質素前體肽的任何活性肽。尤其感興趣的是降壓肽。該活性肽包括，但不限於，具有如下胺基酸序列(SEQ ID NO:6)的腎上腺髓質素肽:
[0027]K (mod) GCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY，其中位於殘基 I 處的賴氨酸被修飾，例如通過連接脂質或其他基團。
[0028]在本發明的一些實施方式中，通過本發明的方法修飾垂體中葉素和腎上腺髓質素中的一種或多種，以提供壽命長的類似物。
[0029]在本發明的一些實施方式中，該類似物包含在N-末端被修飾的生物活性多肽，如結構I所示。在其他的實施方式中，可通過聚乙二醇化、糖基化、連接於(conjugation to)大的蛋白(例如白蛋白)、或連接於聚合物並結合胺基酸修飾(例如，利用D-胺基酸或e氨
基酸)來修飾該多肽，以增加生物半衰期。
【權利要求】
1.一種生物活性垂體中葉素或腎上腺髓質素肽，其血清半衰期大於1.5小時。
2.根據權利要求1所述的肽，其中，所述肽通過將聚合物結合於所述肽的氨基末端而被修飾。
3.根據權利要求2所述的肽，其中，所述肽具有如下結構:
4.根據權利要求3所述的肽，其中，Rl選自棕櫚酸鹽；硬脂酸鹽；花生酸；月桂酸；肉豆蘧酸；肉豆蘧油酸；棕櫚油酸；十六碳烯酸；油酸；亞油酸；a -亞麻酸；花生四烯酸；十二碳五烯酸；芥酸；和二十二碳六烯酸。
5.根據權利要求1所述的肽，其中，所述肽包含如SEQID NO: 3; SEQ ID NO: 4;或SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列或由SEQ ID NO:3 ；SEQ ID NO:4 ;或SEQ ID N0:7所示的胺基酸序列組成。
6.根據權利要求1所述的肽，其中，所述肽包含如SEQID N0:6所示的胺基酸序列或由如SEQ ID N0:6所示的胺基酸序列組成。
7.—種藥物組合物，包含治療有效劑量的權利要求1-6中任一項所述的肽，以及可藥用衍生物。
8.一種向宿主動物長時間遞送CLR/RAMP受體活性的長效激動劑的方法，所述方法包括向所述動物給予權利要求7所述的藥物組合物。
9.一種降低個體中外周血壓同時增加心輸出量的方法，所述方法包括:向所述個體給予根據權利要求7所述的藥物組合物，其中，以大於每四小時一次的時間間隔遞送所述肽。
10.根據權利要求9所述的方法，其中，以大於每12小時一次的時間間隔遞送所述肽。
【文檔編號】A61K38/16GK103458916SQ201280016897
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年4月5日 優先權日:2011年4月7日
【發明者】許曉瑜, 張嘉琳 申請人:小利蘭·史丹福大學託管委員會