一種豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法

2023-08-01 14:14:01

一種豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，以克服傳統製備胃蛋白酶方法易使胃蛋白酶變性、有機溶劑對操作人員的身體危害，成本較高等缺陷為目的，該方法包括使用鹽酸對豬胃基底部黏膜進行粗提，然後利用胃蛋白酶在弱酸性溶液中溶解度高、酶活穩定，而胃膜素遇弱酸即沉澱的性質，採用酸性水溶液代替丙酮提取分離胃蛋白酶和胃膜素，再通過離心、過濾、超濾、乾燥等步驟製備得到胃蛋白酶和胃膜素，通過該方法製備豬胃蛋白酶和胃膜素，不僅保護了胃蛋白酶活性，同時因不使用有機溶劑，提高了操作的安全係數，對工人身體無任何傷害，而且降低了成本，擴大了產能，具有廣闊的市場前景。
【專利說明】一種豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，特別涉及一種用豬胃黏膜製備胃蛋白酶和胃膜素的方法。

【背景技術】
[0002]胃蛋白酶是自豬胃黏膜中提取而得，是一種消化性蛋白酶，由胃部中的胃黏膜主細胞所分泌，功能是將食物中的蛋白質分解為小的肽片段，目前，藥用胃蛋白酶一般是從豬胃黏膜中提取而得，用於消化不良。胃膜素是豬胃黏膜消化提取製得的粘蛋白，有抗胃蛋白酶分解和弱抗酸作用，能在胃內形成膜，覆蓋潰瘍面，減少胃酸的刺激，有利於潰瘍面的癒合。胃蛋白酶的分離方法有分級鹽析分離、有機溶劑分離和底物親和分離等，而目前，國內外對豬胃蛋白酶的分離方法普遍是將酸法製備的粗提液通過有機溶劑，分離得到包括胃蛋白酶A、胃蛋白酶B、胃蛋白酶C、胃蛋白酶D、黏膜蛋白、胃膜素等的混合胃蛋白酶，有機溶劑法一般使用丙酮或乙醇等水溶性有機溶劑，有機溶劑沉澱蛋白質雖分辨力好，溶劑易除去，但缺點是容易使酶和具有活性的蛋白質變性，故操作時要求條件嚴格，同時，傳統工藝乾燥前物料性狀決定了只能採用熱風循環，所以產能也受到極大限制，此外，有機溶劑易燃易爆，使用量大，成本高，由於丙酮帶一定毒性，對生產工人身體也會造成一定危害。


【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，以克服傳統製備胃蛋白酶方法中的缺陷，使胃蛋白酶不易變性，同時提高操作的安全係數，減少有機溶劑對操作人員的身體危害，提高產量，節約成本。
[0004]本發明的技術方案是:
一種豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，包括以下步驟:
(1)粗提液的製備:取豬胃基底部黏膜，加入4%鹽酸水溶液，用量按Ikg豬胃基底部黏膜計算為270ml，攪拌均勻，升溫至44?46°C，30min後調節PH至2.2?2.4，恆溫酸化3小時，用40目尼龍網過濾，將濾出的酸化胃漿液降溫至O?:TC ；
(2)分離:向酸化胃漿液中加入PH2.0?5.0的酸性水溶液，攪拌均勻，靜置5?6h後，上層清液過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，下層沉澱離心，取離心清液過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，離心後的濾渣，加入PH2.0?5.0酸性水溶液，攪拌均勻，靜置20分鐘後離心，取離心清液過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，濾渣備用；
(3)胃膜素的製備:濾渣經脫水、乾燥得胃膜素；
(4)胃蛋白酶的製備:取收集的胃蛋白酶清液，濃縮、透析、乾燥得胃蛋白酶。
[0005]其中:
步驟(2)所述的向酸化胃漿液中加入的酸性水溶液用量優選4?12倍酸化胃漿液體積，更優為8倍酸化胃漿液體積。
[0006]步驟(2)所述的向濾渣中加入的酸性水溶液用量按Ig濾渣計算優選I?4ml，更優為2ml。
[0007]步驟(2)所述的酸性水溶液的PH值優選為3.0。
[0008]步驟(2)所述的酸性水溶液的溫度優選8?10°C，更優為9°C。
[0009]步驟(2)所述的酸性水溶液的酸優選:鹽酸、硫酸、醋酸、磷酸中的一種。
[0010]步驟(4)所述的胃蛋白酶清液的濃縮、透析、乾燥方法優選:將胃蛋白酶清液調節溫度至10?15°C，選用5?1kd分子量膜超濾濃縮至胃蛋白酶濃度為15%，超濾濃縮的進液壓力為0.2MPa,回流壓力為0.1?0.16MPa，向濃縮液中分批加入等體積8?10°C純化水進行透析，直至用硝酸銀檢測出液無氯離子，收集截留液，截留液用於噴霧乾燥，噴幹進風溫度110?125 °C，尾風溫度66?75°C。
[0011]本發明具有如下有益效果:
1、本工藝利用胃蛋白酶在弱酸性溶液中溶解度高、酶活穩定，而胃膜素遇弱酸即沉澱的性質，工藝採用酸性水溶液代替丙酮提取分離胃蛋白酶和胃膜素，減少了丙酮對酶活的影響，極大的保護了胃蛋白酶活性。
[0012]2、本工藝不使用有機溶劑，提高了操作的安全係數，對工人身體無任何傷害。
[0013]3、本工藝採用噴霧乾燥技術代替傳統的熱風循環乾燥技術，縮短了生產周期，實現了連續化生產，擴大了產能，此外，噴霧乾燥技術避免使用傳統有機溶劑法涉及的沉析、脫水、制粒等繁瑣的工序，簡化了生產工藝。
4、傳統工藝使用大量丙酮，而丙酮價格又在急劇上升，造成生產成本大幅升高，本工藝棄用丙酮，較傳統工藝成本顯著下降。

【具體實施方式】
[0014]實施例1:
(1)粗提液的製備:取豬胃基底部黏膜1kg，加入4%鹽酸水溶液270ml，攪拌均勻，於60?70°C水浴條件下升溫至44?46°C，30min後調節PH至2.2?2.4，恆溫酸化3小時，用40目尼龍網過濾，將濾出的酸化胃漿液在攪拌條件下降溫至O?:TC，得到粗提的酸化胃漿液 1200ml ；
(2)分離:向1.2L酸化胃漿液中加入溫度為8°C、PH2.0的磷酸水溶液4.8L，攪拌均勻，靜置5?6h後，上層清液用621濾布過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，下層沉澱以1500r/min的轉速離心，取離心清液用621濾布過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，離心後的濾渣34.6g，加入溫度為8°C、PH2.0磷酸水溶液34.6ml，攪拌均勻，靜置20分鐘後離心，取離心清液用621濾布過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，濾渣備用；
(3)胃膜素的製備:濾渣經丙酮脫水、乾燥得胃膜素20.Sg ；
(4)胃蛋白酶的製備:取收集的胃蛋白酶清液，將胃蛋白酶清液調節溫度至10°C，選用5kd分子量膜超濾濃縮至胃蛋白酶濃度為15%，超濾濃縮的進液壓力為0.2MPa，回流壓力為0.1MPa,向濃縮液中分批加入等體積8°C純化水進行透析，直至用硝酸銀檢測出液無氯離子，收集截留液，截留液用於噴霧乾燥，噴幹進風溫度110°C，尾風溫度66°C，得胃蛋白酶30.4g0
[0015]結論:每Ig中胃酶含胃蛋白酶活力為:10500U ；
胃膜素按乾燥品計算，含總氨(N) 7.1% ； 還原糖為23.5%。
[0016]實施例2:
在本實施例中，粗提液的製備方法與實施例1相同，其餘製備方法如下:
(1)分離:向1.2L酸化胃漿液中加入溫度為10°C、PH5.0的醋酸水溶液14.4L，攪拌均勻，靜置5?6h後，上層清液用621濾布過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，下層沉澱以1500r/min的轉速離心，取離心清液用621濾布過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，離心後的濾渣22.5g，加入溫度為10°C、PH5.0醋酸水溶液90ml，攪拌均勻，靜置20分鐘後離心，取離心清液用621濾布過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，濾渣備用；
(2)胃膜素的製備:濾渣經丙酮脫水、乾燥得胃膜素13.5g ；
(3)胃蛋白酶的製備:將胃蛋白酶清液調節溫度至15°C，選用1kd分子量膜超濾濃縮至胃蛋白酶濃度為15%，超濾濃縮的進液壓力為0.2MPa,回流壓力為0.16MPa，向濃縮液中分批加入等體積10°C純化水進行透析，直至用硝酸銀檢測出液無氯離子，收集截留液，截留液用於噴霧乾燥，噴幹進風溫度125°C,尾風溫度75°C,得胃蛋白酶20.lg。
[0017]結論:每Ig中胃酶含胃蛋白酶活力為:8600U ;
胃膜素按乾燥品計算，含總氨(N) 7.5% ；
還原糖為24%。
[0018]實施例3:
在本實施例中，粗提液的製備方法與實施例1相同，其餘製備方法如下:
(1)分離:向1.2L酸化胃漿液中加入溫度為9°C、PH3.0的鹽酸水溶液9.6L，攪拌均勻，靜置5?6h後，上層清液用621濾布過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，下層沉澱以1500r/min的轉速離心，取離心清液用621濾布過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，離心後的濾渣50.5g，加入溫度為9°C、PH3.0鹽酸水溶液101ml，攪拌均勻，靜置20分鐘後離心，取離心清液用621濾布過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，濾渣備用；
(2)胃膜素的製備:濾渣經丙酮脫水、乾燥得胃膜素30.3g ；
(3)胃蛋白酶的製備:取收集的胃蛋白酶清液，將胃蛋白酶清液調節溫度至13°C，選用8kd分子量膜超濾濃縮至胃蛋白酶濃度為15%，超濾濃縮的進液壓力為0.2MPa，回流壓力為0.13MPa，向濃縮液中分批加入等體積9°C純化水進行透析，直至用硝酸銀檢測出液無氯離子，收集截留液，截留液用於噴霧乾燥，噴幹進風溫度120°C，尾風溫度70°C，得胃蛋白酶55.8g0
[0019]結論:每Ig中胃酶含胃蛋白酶活力為:16000U ；
胃膜素按乾燥品計算，含總氨(N) 6.8% ；
還原糖為23%。
[0020]實施例4:
在本實施例中，除分離方法中的酸性水溶液選擇是PH3.0的硫酸水溶液，其餘製備方法均與實施例3相同:
結論:胃蛋白酶35.6g，胃膜素22.4g ；
每Ig中胃酶含胃蛋白酶活力為:11000U ；
胃膜素按乾燥品計算，含總氨(N) 7.3% ；
還原糖為23.2%。
【權利要求】
1.一種豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)粗提液的製備:取豬胃基底部黏膜，加入4%鹽酸水溶液，用量按1kg豬胃基底部黏膜計算為270ml，攪拌均勻，升溫至44?46°C，30min後調節PH至2.2?2.4，恆溫酸化3小時，用40目尼龍網過濾，將濾出的酸化胃漿液降溫至0?:TC ； (2)分離:向酸化胃漿液中加入PH2.0?5.0的酸性水溶液，攪拌均勻，靜置5?6h後，上層清液過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，下層沉澱離心，取離心清液過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，離心後的濾渣，加入PH2.0?5.0酸性水溶液，攪拌均勻，靜置20分鐘後離心，取離心清液過濾至澄清得胃蛋白酶清液，收集備用，濾渣備用； (3)胃膜素的製備:濾渣經脫水、乾燥得胃膜素； (4)胃蛋白酶的製備:取收集的胃蛋白酶清液，濃縮、透析、乾燥得胃蛋白酶。
2.根據權利要求1所述的豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於:步驟(2)所述的向酸化胃漿液中加入的酸性水溶液用量為4?12倍酸化胃漿液體積。
3.根據權利要求2所述的豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於:步驟(2)所述的向酸化胃漿液中加入的酸性水溶液用量為8倍酸化胃漿液體積。
4.根據權利要求1所述的豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於:步驟(2)所述的向濾渣中加入的酸性水溶液用量為按lg濾渣計算為1?4ml。
5.根據權利要求4所述的豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於:步驟(2)所述的向濾渣中加入的酸性水溶液用量為用量為按lg濾渣計算為2ml。
6.根據權利要求1所述的豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於:步驟(2)所述的酸性水溶液的PH值為3.0。
7.根據權利要求1所述的豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於:步驟(2)所述的酸性水溶液的溫度為8?10°C。
8.根據權利要求7所述的豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於:步驟(2)所述的酸性水溶液的溫度為9°C。
9.根據權利要求1所述的豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於:步驟(2)所述的酸性水溶液的酸為:鹽酸、硫酸、醋酸、磷酸中的一種。
10.根據權利要求1所述的豬胃蛋白酶和胃膜素的製備方法，其特徵在於:步驟(4)所述的胃蛋白酶清液的濃縮、透析、乾燥方法為:將胃蛋白酶清液調節溫度至10?15°C，選用5?10kd分子量膜超濾濃縮至胃蛋白酶濃度為15%，超濾濃縮的進液壓力為0.2MPa,回流壓力為0.1?0.16MPa，向濃縮液中分批加入等體積8?10°C純化水進行透析，直至用硝酸銀檢測出液無氯離子，收集截留液，截留液用於噴霧乾燥，噴幹進風溫度110?125°C，尾風溫度66?75°C。
【文檔編號】C12N9/64GK104480090SQ201410701027
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】張革, 唐章勇, 餘茂軍, 周后傑, 陳紅兵 申請人:四川德博爾製藥有限公司