一種中藥組合物在製備保護內皮細胞屏障功能完整性藥物中的應用的製作方法

2023-08-01 05:58:56 2

專利名稱：：一種中藥組合物在製備保護內皮細胞屏障功能完整性藥物中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種中藥組合物的新用途，具體地，涉及一種中藥組合物在製備保護內皮細胞屏障功能完整性藥物中的應用，屬中藥應用領域。
背景技術：
：內皮細胞是血液與血管壁之間的結構和功能屏障，內皮細胞受損是動脈粥樣硬化形成的始發因素，粘附分子在內皮細胞受損過程中起了重要作用，因此如何控制內皮細胞粘附分子的表達在防止脈粥樣硬化發生中是至關重要的。急性心肌梗死(Acutemyocardialinfarction,AMI)再灌注後的短暫時間內，即可在心肌損傷區內觀察到多形核中性粒細胞的聚集，活化的中性粒細胞不僅釋放出大量活性氧自由基(Reactiveoxygenspecies,R0S)、蛋白水解酶和促炎症介質，增加血管通透性，還能堵塞微血管引起二次缺血，並滲出至周圍組織引起炎症反應和組織損傷，從而引起內皮細胞屏障功能障礙。[EnglerRL，Schmid-SchonbeinGW，PavelecRS.狗心肌缺血再灌注白細胞毛細血管填塞.AmJPathol.1983Apr;111(1):98-111;SaeedSA,WaqarMA，ZubairiAJ，etal.心肌缺血再灌注損傷:活性氧與中性粒細胞的角色.JCollPhysiciansSurgPak.2005Aug.15(8):507-14.]冠脈內皮細胞是心臟抵禦炎症損傷的第一道防線，它不僅發揮著屏障功能，同時也通過調節NO和腺苷的水平阻止中性粒細胞的聚集和粘附。研究發現，再灌注損傷過程中，R0S可以上調粘附分子的表達，如P-選擇素和ICAM-1，促進細胞因子和補體的釋放，進而活化中性粒細胞，後者通過粘附分子依賴機制，如P-選擇素，可以直接損傷內皮細胞，抑制NO的合成，誘發血管收縮。缺血再灌注過程中，中性粒細胞和內皮細胞間的相互作用主要是由細胞表面粘附分子所介導。在炎症部位，中性粒細胞的貼壁和滾動主要依賴於細胞表面P-選擇素糖蛋白配體1和內皮表面的P-選擇素之間的識另IJ，這是炎症反應和白細胞滲出過程的重要始動因素。工CAM-l和VCAM-l同屬於免疫球蛋白超家族成員，定位於血管內皮細胞表面，兩者分別與相應的配體CDll/CD18複合物和VLA-4相結合介導白細胞的聚集和穩定粘附，促進白細胞的活化和炎性滲出。缺血再灌注過程能夠激活R0S敏感信號通路，促使核轉錄因子AP-l和kappaB活化，粘附分子ICAM-1,VCAM-1，P-選擇素和E-選擇素的轉錄增加，導致內皮細胞粘附性增強和白細胞滲出增加。因此，細胞表面粘附分子表達水平反映了血管內皮細胞損傷及炎症浸潤的程度。內皮細胞間連接蛋白在維持內皮細胞功能和結構完整性中發揮至關重要的作用。血管內皮鈣粘素表達於內皮細胞表面，它能介導鈣離子依賴的同型細胞間粘附，不僅參與內皮細胞的生長、存活和遷移等過程，並且還在調節內皮細胞完整性方面發揮非常重要的作用。研究顯示，用特異性抗體阻斷血管內皮鈣粘素介導的細胞間相互作用，將會破壞內皮細胞完整性，同時增加中性粒細胞的滲出。與其它鈣粘素一樣，血管內皮鈣粘素的胞漿部分與犰狳蛋白家族成員P-連環蛋白和Y-連環蛋白相結合，後兩者藉助a-連環蛋白連接到肌動蛋白細胞骨架上，血管內皮鈣粘素的功能主要受細胞骨架變化和細胞內蛋白磷酸化的調節。研究顯示，在氧化應激過程中，ROS能增加肌球蛋白輕鏈磷酸化，促進細胞收縮，同時伴隨有連接蛋白的解離和再分布，導致內皮細胞屏障功能障礙，毛細血管通透性增加和炎症細胞滲出增多。本發明是在第01131203.3號中國專利和第200410048292.2號專利的基礎上進行的改進發明，在此全文引用該兩專利文件記載的內容。本發明提供了一種中藥組合物在製備保護內皮細胞屏障功能完整性藥物中的應用。
發明內容本發明目的是提供一種中藥組合物在製備保護內皮細胞屏障功能完整性藥物中的應用。本發明中藥組合物能夠抑制細胞粘附分子的表達，減少炎症反應，增加血管內皮鈣粘素含量，保護內皮細胞屏障功能完整性。優選地，所述細胞粘附分子為P-選擇素和細胞間粘附分子1中之一或二者。本發明的另一個目的是提供該中藥組合物在製備保護內皮細胞屏障功能完整性藥物中的應用中的活性成分。本發明應用中，所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成人參3-10水蛭3-11土鱉蟲5-10乳香(制)1-5赤芍3-9降香l.檀香l-5全蠍3-9蟬蛻3-12蜈蚣l-3冰片l-7酸棗仁(炒)3-10;優選地，該中藥組合物由如下重量份的原料藥製成人參6水蛭10土鱉蟲7乳香(制)2蟬蛻7檀香2全蠍7或:或:人參10檀香2人參6檀香2水蛭8全蠍9水蛭11全蠍3蜈蚣l冰片:土鱉蟲7乳香(制)2蟬蛻7蜈蛇1冰片土鱉蟲7乳香(制)2蟬蛻7蜈松1冰片赤芍5降香2酸棗仁(炒)5;赤芍5降香2;酸棗仁(炒)5;赤芍降香2(炒)5;本發明中藥組合物中，原料藥材的拉丁名及其加工方法來自《中藥大辭典》(1977年7月，第一版，上海科學技術出版社)和《中國藥典》(2005年版，化學工業出版社)。本發明的應用中，所述中藥組合物各原料中的一種或幾種，可單獨或同時被相同藥性、功效的中藥原料藥替換，替換後，組合物製劑和作用不發生變化。本發明的應用中，該中藥組合物的活性成分由下列成分組成a平均粒徑小於100pm的全蠍、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲、蟬蛻及制乳香藥粉；b冰片藥粉；c由降香和檀香提取的揮髮油；d人參用乙醇提取後的醇提液經濃縮後的醇提浸膏；e提取成分c後的降香和檀香藥渣的水提液、赤芍和炒酸棗仁加水煎煮後的水提液以及提取成分d後的人參藥渣的水提液過濾、混勻後濃縮成的水本發明的應用中，所述中藥組合物劑型為膠囊劑、片劑、丸劑、口服液、軟膠囊或滴丸劑。本發明中藥組合物製劑還可以按常規的製劑工藝，例如，範碧亭《中藥藥劑學》(上海科學出版社1997年12月第1版)記載的製備工藝，製成藥劑學可接受的任意常規劑型，例如膠囊劑、片劑、丸劑、口服液、軟膠囊、滴丸等。本發明的應用中，所述中藥組合物為膠囊劑、片劑、丸劑、口服液、軟膠囊、滴丸製劑中的一種，為使上述劑型能夠實現，需在製備這些劑型時加入藥學可接受的輔料，例如填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質等。填充劑包括澱粉、預膠化澱粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括澱粉、預膠化澱粉、微晶纖維素、羧甲基澱粉鈉、交聯聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉等；潤滑劑包括硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化矽等；助懸劑包括聚乙烯吡咯垸酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，澱粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括甜味劑及各種香精；防腐劑包括尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質包括PEG6000，PEG4000，蟲蠟等。為使上述劑型能夠實現中藥藥劑學，需在製備這些劑型時加入藥學可接受的其它輔料(範碧亭《中藥藥劑學》，上海科學出版社1997年12月第1版中各劑型記載的輔料)。本發明膠囊劑優選通過以下製備方法製成將上述配比的水蛭、全蠍、蟬蛻、土鱉蟲、蜈蚣等五味藥洗淨，低溫烘乾，備用；檀香、降香提取揮髮油，藥渣及水溶液備用；人參用70%乙醇加熱回流提取二次，第一次3小時，第二次2小時，合併提取液，回收乙醇至無醇味；人參藥渣與檀香、降香的藥渣以水溶液合併，加入赤芍、酸棗仁(炒)，加水煎煮二次，第一次3小時，第二次2小時，合併煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.20-1.25(60°C)的清膏，加入上述人參醇提液，混勻，低溫乾燥，粉碎成細粉；乳香(制)與水蛭等五味共粉碎成細粉；冰片研細，分別與上述細粉配研，混勻，噴入揮髮油，混勻，裝入膠囊，即得。或者，本發明製劑優選通過以下製備方法製成a)原料藥的重量比為人參3-10份、水蛭3-ll份、土鱉蟲5-10份、制乳香l-5份、赤芍3-9份、降香l-5份、檀香l-5份、全蠍3-9份、蟬蛻3-12份、蜈蚣l-3份、冰片l-7份、炒酸棗仁3-10份；b)藥材粉碎工藝將全蠍、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經淨選、水洗處理後和淨7選炮製後的制乳香按處方配料，由粉碎機進行粉碎，藥粉細度達到80目以上;粗粉後的藥粉經各種超微粉碎技術進行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小於IOO待粉碎的藥材經清洗烘乾滅菌後，配料；C)提取濃縮和乾燥工藝降香和檀香先加水提取揮髮油後再用水提取，赤芍和酸棗仁加水煎煮，水提液過濾後，待濃縮成浸膏；人參用乙醇提取後，再用水提取，醇提液回收乙醇後，濃縮成醇提浸膏，水提液過濾與所有的水提液混勻後濃縮成水提浸膏；d)製劑工藝在沸騰制粒乾燥機中加入超微粉碎粉，再將步驟C)所得提取浸膏噴入制粒；將製成的顆粒經整粒，加入冰片細粉，噴入由降香和檀香提取的揮髮油，混勻後由膠囊充填機充填，製成膠囊。或者，本發明膠囊劑優選通過以下製備方法製成a)原料藥的重量比為人參3-10份、水蛭3-ll份、土鱉蟲5-10份、乳香(制)l-5份、赤芍3-9份、降香l-5份、檀香l-5份、全蠍3-9份、蟬蛻3-12份、蜈蚣l-3份、冰片l-7份、炒酸棗仁3-10份；b)藥材粉碎工藝將全蠍、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經淨選、水洗處理後和淨選炮製後的制乳香按處方配料，由粉碎機進行粉碎，藥粉細度達到80目以上;粗粉後的藥粉經各種超微粉碎技術進行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小於IOO待粉碎的藥材經清洗烘乾滅菌後，配料；c)提取濃縮和乾燥工藝降香和檀香先加水提取揮髮油後再用水提取，赤芍和酸棗仁加水煎煮，水提液過濾後，待濃縮成浸膏；人參用乙醇提取後，再用水提取，醇提液回收乙醇後，濃縮成醇提浸膏，水提液過濾與所有的水提液混勻後濃縮成水提浸膏，將浸膏直接噴霧乾燥成噴霧粉；d)製劑工藝將超微粉碎粉與步驟c)所得噴霧乾燥粉一起加到沸騰制粒乾燥機中，再噴溶媒製成顆粒；將製成的顆粒經整粒，加入冰片細粉，噴入由降香和檀香提取的揮髮油，混勻後由膠囊充填機充填，製成膠囊。本發明應用中，本發明組合物的用量，按原料藥總重量計，為每次0.8-3克，每日服用2-4次，優選為每次l.ll-2.22克，每日服用三次。為闡明本發明中藥組合物保護內皮細胞屏障功能完整性的活性，用按實施例l方法製得的膠囊內容物乾粉(以下稱本發明藥物)進行了下列動物試驗。一、材料和方法1、動物與分組選用中華小型豬30隻(購於北京農業大學)，雌雄匹配，體重30公斤左右，應用隨機排列表，隨機分成模型對照組，小[O.05g/(kg，d)]、中[O.2g/(kg*d)]、大劑量[O.5g/(kg*d)]本發明藥物治療組和假手術組，每組6隻。2、藥物與用法本發明藥物膠囊乾粉(1.43g生藥乾粉，由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供)混於飼料中，於AMI造模前3天開始，每天餵食給藥l次。小劑量0.05gkg—1d—1、中劑量O.2gkg—1d—、大劑量0.5gkg—'d—。3、急性心肌梗死再灌注模型於胸骨正中打開胸腔，縱行切開心包膜，暴露心臟，並將心包膜縫合於胸壁呈吊籃狀，於冠狀動脈左前降支(LAD)遠端1/31/2處，將結紮線穿入一長約34cm的矽膠管腔內結紮3小時，再松解1小時建立AMI再灌注模型。假手術組冠脈下只穿線，不結紮。實驗結束時，從左心室注入4%的硫磺素(thioflavin—S)lml/kg，使再灌注區著色，無再流區不著色；再於原位重新結紮前降支，從左心室再注入埃文氏(Evan'S)藍，使結紮區外著藍色，結紮區不著藍色。立即取出心臟，剪除左右心耳及殘餘大血管，於冰生理鹽水中蕩洗去除殘餘血液；取部分正常區、再灌注區和無再流區心肌以錫紙包被，標記後保存於液氮中，以備提取總RNA、蛋白和組織勻漿之用，另取部分組織置於4%多聚甲醛中固定，以備HE染色之用。4、心肌組織中細胞粘附分子蛋白含量測定取心肌組織約100mg，加入10倍體積冰預冷PBS緩衝液(PH7.4)，在冰上迅速勻漿18，OOOrpm，12min，4。C離心，2000rpm，15min，仔細收集上清，置於-70。C保存。採用ELISA方法測定心肌組織勻漿中P-選擇素、IC旭-1和VCAM-1的含量。具體操作按試劑盒說明書進行，試劑盒購自美國Rapidbio(RB)公司。5、心肌組織中細胞粘附分子mRNA含量測定取心肌組織約100mg提取總RNA，將提取的總RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行實時反轉錄聚合酶鏈反應(Real-timePCR)反應，引物分別為P-選擇素上遊5'-TCACCTGTGATGAAGGCTCG-3'，下遊5'-TTCAAGCCGAAGGTTCCCAG-3';ICAMl上遊5，-CCTGGATCAATGGAACCGAG-3'，下遊5'-TCGTTCAGTGTCACCACAGC-3';VCAMl上遊5'-AGTGATGGCTTTCCAGCTCC-3'，下遊5'-TCCTTGACGCTCTCAGAAGG-3';P-肌動蛋白(P-actin)上遊5，-AGGTCATCACCATCGGCAAC-3'，下遊5'-TCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3，，PCR反應的具體步驟是:95。C變性5min後，再以95。C30s、59°C30s兩歩法進行40個循環。每對引物，每種模板，各3個平行管反應。獲得同一個樣品目的基因的CT值與e-肌動蛋白的CT值，計算出'.ACT二CT目的基因一CTP-肌動蛋白，目的基因的平均相對含量=2—，AACT，(△ACT=ACT未知一ACT參照)。6、心肌組織HE染色觀察標本固定24小時以上，常規石蠟包埋，切片至34)Lim，貼片後脫蠟至水，常規HE染色，顯微鏡下觀察心肌組織形態。7、心肌組織中內皮細胞間連接蛋白含量測定10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品，轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉11.5小時，加入適量比例的一抗(山羊抗人血管內皮鈣粘素(VE-cadherin)，e-連環蛋白(P-catenin)，Y-連環蛋白(Y-catenin)多抗購自美國SantaCruz公司)，4"過夜。TBST洗膜3次，加入適量的鹼性磷酸酶標記的兔抗山羊IgG，室溫2小時，TBST洗膜3次，加入顯色底物(NBT/BCIP)避光顯色，待出現清晰條帶後終止反應。圖像以Alphalmager3400分析軟體對其進行灰度對比分析。將目的蛋白條帶的灰度與內參蛋白條帶的灰度相比，再乘以100%，以消除上樣量差異的影響，對比各組樣本蛋白表達水平的變化情況。8、統計學方法實驗數據以均數士標準差G士s)表示，採用SPSS11.5進行統計學處理，同組間的比較用配對t檢驗，多個樣本均數的比較用方差分析和q檢驗，多個樣本均數與同一對照組比較用Dimnett檢驗，以P〈0.05(雙尾)表示差異有統計學意義。二、結果1、心肌組織P-選擇素蛋白和m認A含量10正常區心肌組織中P-選擇素蛋白和mRNA含量在各組之間均無顯著性差異(P均〉0.05)。與正常區心肌組織比較，模型組和藥物治療組一樣，再灌注區和無再流區心肌組織中P-選擇素蛋白含量均顯著升高(P均<0.05)，且無再流區升高更明顯(P均〈0.01);再灌注區和無再流區心肌組織中P-選擇素mRNA水平也有顯著升高(P均〈0.05)，提示再灌注區和無再流區局部粘附分子表達上調，促進炎症細胞粘附和浸潤。與模型組相比較，小劑量組再灌注區和無再流區P-選擇素蛋白和mRNA含量無顯著變化(P〉0.05);中劑量和大劑量組的再灌注區和無再流區心肌組織中P-選擇素蛋白含量有顯著降低(P〈0.05);而且大劑量組再灌注區和無再流區P-選擇素mRNA含量也有顯著降低(P<0.05)，提示中劑量本發明藥物可以抑制受損心肌局部P-選擇素的蛋白表達，而大劑量本發明藥物可以同時抑制P-選擇素的轉錄和翻譯，減少局部炎症細胞粘附和浸潤，減輕炎症損傷(表l、2)。表l各組在各區心肌組織P-選擇素蛋白水平的變化(ng/mgprot，X±S)組別例數(n)正常區再灌注區無再流區假手術組636.18±3.24模型對照組638.20±3.7453.86±3.72糊61.86±3.39抑++小劑量組639.83±3.5951.40±3.89#s59.04±3.07,+中劑量組638.79±3.4648.96±3.79隱57.46±3.33,+"大劑量組637.22±4.1444.24±4.17s"53.44±4.09,+"與正常區相比駅0.05，,〈0.01;與再灌注區相比+P<0.05，++P<0.01;與對照組相比▲P<0.05，▲▲P〈0.01表2各組在各區心肌組織P-選擇素mRNA水平的變化(相對假手術組正常區含量，X±S)組別例數(n)正常區再灌注區無再流區假手術組61.02±0.57模型對照組61.18±0.624.81土1.99糾12,.03±5.85#s++小劑量組61.06±0.564.95±1.65s*11,,79士6.47抑"中劑量組61.04±0.664.12±2.28抑6.72±2.89#*大劑量組61.11±0.502.55±1.73抑血5.28±2.ll歸與正常區相比駅O.05，,〈0.01;與再灌注區相比+P〈0.05，++P〈0.01;與對照組相比▲P〈0.05，▲▲P〈0.012、心肌組織中細胞間粘附分子1(ICAM-1)蛋白和mRNA含量正常區心肌組織中ICAM-1蛋白和mRNA含量在各組之間均無顯著性差異(P均〉0.05)。與正常區心肌組織比較，模型組和藥物治療組一樣，再灌注區和無再流區心肌組織中ICAM-1蛋白和mRNA含量均顯著升高(P均〈O.Ol)，且無再流區升高更顯著(P均〈0.05)，提示再灌注區和無再流區局部粘附分子表達上調，促進炎症細胞浸潤。與模型組相比較，小劑量組再灌注區和無再流區心肌組織中ICAM-1蛋白和mRNA含量無顯著降低(P均〉0.05);中劑量和大劑量組的再灌注區和無再流區心肌組織中ICAM-1蛋白含量有顯著降低(P均〈0.05);而且大劑量組再灌注區ICAM-lmRNA含量也有顯著降低(P<0.05)，提示中劑量本發明藥物可以抑制受損心肌局部ICAM-1的表達，大劑量本發明藥物可以有效抑制ICAM-1的轉錄和翻譯，減輕局部炎症細胞浸潤(表3、4)。表3各組在各區心肌組織ICAM-1蛋白水平的變化(ng/mgprot,X±S)組別例數(n)正常區再灌注區無再流區假手術組61.62±0.19模型對照組61.77±0.212.88±0.22#*3,.99±0.24m+小劑量組61.74±0.212.79±0.21w3,.76±0.30,中劑量組61.74±0.222.56±0.3.68±0.18M"大劑量組61.78±0.222.26±0.25M"3.58±0.21,"與JK常區相比W<0.05，ttttP〈0.01;與再灌注區相比+P<0.05，++P<0.01;與對照組相比▲P<0.05，▲▲P<0.01表4各組在各區心肌組織ICAM-1mRNA水平的變化(相對假手術組JH常區含量，X±S)tableseeoriginaldocumentpage12與正常區相比#P<0.05，抑P〈0.01;與再灌注區相比十P〈0.05'++P<0.01;與對照組相比▲P<0.05，▲▲P<0.013、心肌組織中血管細胞粘附分子1(VCAM-1)蛋白和mRNA含量正常區心肌組織中VCAM-1蛋白和mRNA含量在各組之間均無顯著性差異(P均〉0.05)。與正常區心肌組織比較，模型組和藥物治療組一樣，再灌注區和無再流區心肌組織中VCAM-1蛋白和mRNA含量均顯著升高(P均<0.01)，且無再流區升高更顯著(P均〈0.05)，提示再灌注區和無再流區局部粘附分子表達上調，促進炎細胞浸潤和內皮損傷。與模型組相比較，不同劑量藥物治療組的再灌注區和無再流區心肌組織中VCAM-1蛋白和mRNA含量有所降低，但是沒有顯著性差異(P均〉0.05)，提示本發明藥物不能抑制受損心肌局部VCAM-1的轉錄和翻譯(表5、6)。表5各組在各區心肌組織VCAM-1蛋白水平的變化(ng/mgprot,X±S)組別例數(n)正常區再灌注區無再流區假手術組62.20±0.33模型對照組62,33士0.283.,54±0.29#*4.60±0.25ss++小劑量組62.28±0.303.,43±0.31抑4.42±0.23##++中劑量組62.29±0.343.,32±0.3(T4.28±0.30,頭叫叫歉62.27±0.323.,25±0.24ss4.26±0.與正常區相比ttP〈0.05，,〈0.01;與再灌注區相比+P<0.05，++P<0.01;與對照組相比▲P〈0.05，▲▲P〈0.01表6各組在各區心肌組織VCAM-1mRNA水平的變化(相對假手術組TF:常區含量，X±S)組別例數(n)正常區再灌注區無再流區假手術組61.02±0.45模型對照組61.04±0.434.05±1.88s#9.53±4.78抑+小劑量組60.89±0.384.17±2.338S10.29±4.55抑++中劑量組60.94±0.372.52±1.03Sft7.98±4.11,大劑量組61.08±0.452.26±1.24ss5.58±2.73,+與正常區相比ttP<0.05，,<0.01;與再灌注區相比+P<0.05，++P<0.01;與對照組相比▲P<0.05，▲▲P〈0.014、心肌組織炎症浸潤情況的觀察如圖l-4所示，光鏡下，假手術組、模型對照組及藥物治療組正常區心肌組織形態結構完整。模型對照組中，再灌注區和無再流區局部有大量的炎細胞浸潤，無再流區可見凝固性壞死，心肌纖維呈波浪狀，心肌細胞腫脹，胞眾嗜伊紅增高，胞漿內出現顆粒狀物。與模型對照組相比，小劑量組再灌注區和無再流區心肌組織仍可見明顯的炎細胞浸潤；中劑量和大劑量組炎症細胞浸潤和心肌組織的損傷有明顯改善，表明中劑量和大劑量本發明藥物可以明顯抑制心肌局部炎症浸潤，減輕內皮細胞和心肌組織的損傷。5、心肌組織血管內皮鈣粘素(VE-cadherin)含量各組正常區心肌組織血管內皮鈣粘素蛋白含量無顯著性差異(P均〉0.05)。與正常區相比較，模型組和藥物治療組再灌注區和無再流區心肌組織中血管內皮鈣粘素均顯著減低(P均〈0.05)，且無再流區降低更顯著(P均<0.05)，提示再灌注區和無再流區血管內皮細胞完整性受損，無再流區更加明顯。與模型組相比較，小劑量和中劑量組再灌注區和無再流區血管內皮鈣粘素含量無顯著增加(P均〉0.05);大劑量組再灌注區和無再流區血管內皮鈣粘素含量有顯著增加(P均<0.05)，提示大劑量本發明藥物能夠抑制內皮細胞連接蛋白的降解，保護內皮細胞結構完整性(表7)。表7各組在各區心肌組織血管內皮鈣粘素含量的變化(相對灰度值％,X±S)組別例數(n)正常區再灌注區無再流區假手術組6模型對照組6小劑量組6中劑量組6大劑量組635.46±3.6038.69±3.4235.67±3.3437.99±3.7221.80±3.48*19.89±3.68s'28.91±3.24s13.04±3.57,11.58±3.58抑+17.42±2.11,38.85±3.5329.63±3.18"22.26±3.27s與正常區相比#P<0.05，糾P〈0.01;與再灌注區相比+P〈0.05，++P<0.01;與對照組相比▲P<0.05，▲▲P<0.016、心肌組織3-連環蛋白(P-catenin)含量各組正常區心肌組織P-連環蛋白含量無顯著性差異(P均〉0.05)。與正常區相比較，模型組和藥物治療組再灌注區e-連環蛋白含量降低，但無顯著性差異(P均〉0.05)，無再流區P-連環蛋白含量降低顯著(P均<0.01)，提示無再流區血管內皮細胞完整性受損顯著。與模型組相比較，藥物治療組再灌注區和無再流區P-連環蛋白含量增加，但無統計學差異(P均〉0.05)，提示本發明藥物不能夠增加P-連環蛋白的表達水平。(表8)表8各組在各區心肌組織e-連環蛋白含量的變化(相對灰度值％，x±s)組別l數(n)正常區再灌注區無再流區假手術組6模型對照組6小劑量組6中劑量組6大劑量組6與正常區相比#P<0.05，鮮<0.01:與再灌注區相比+P<0.05，++P<0.01;與對照組相比▲P<0.05,▲▲P<0.017、心肌組織Y連環蛋白(Y-catenin)含量各組正常區心肌組織Y連環蛋白含量無顯著性差異(P均〉0.05)。與正常區相比較，模型組和藥物治療組再灌注區和無再流區Y連環蛋白含量無顯著性差異(P均〉0.05)，提示心肌缺血再灌注過程中，Y連環蛋白含量無明顯變化。(表9)表9各組在各區心肌組織Y連環蛋白含量的變化(相對灰度值％,X±S)組別例數(n)正常區再灌注區無再流區假手術組616.78±2.12模型對照組616.73±3.5815.16±2.3114.68±2.83小劑量組613.69±2.3414.43±2.5812.74±2.40中劑量組619.02±3.5518.37±3.5218.03±3.06大劑量組617.65±2.8216.63±2.6517.84±2.02與正常區相比#P〈0.05，抑P〈0.01;與再灌注區相比+P<0.05，++P<0.01;與對照組相比▲P<0.05,▲▲P<0.01三、結論以上研究結果發現與正常心肌組織相比，模型組再灌注區和無再流區P-選擇素和ICAM-1蛋白及mRNA水平都有明顯升高，無再流區比再灌注區炎症損傷程度更加顯著。此外，心肌組織HE染色結果也顯示，模型對照組的再灌注區和無再流區局部有大量炎細胞浸潤，無再流區心肌細胞腫脹，胞漿嗜伊紅增高，胞漿內可見顆粒狀物。這些結果表明粘附分子表達上調所介導的內皮損傷和炎細胞浸潤，在保護內皮細胞屏障功能完整性中起著重要的作用。與模型對照組相比，中劑量和大劑量本發明藥物可以明顯降低再灌注區和無再流區P-選擇素和ICAM-l蛋白表達，而大劑量本發明藥物可以從mRNA的轉錄水平上抑制P-選擇素和ICAM-1的表達。病理形態學檢測結果表明，與模30.34±3.2931.14±4.6928.17±3.1934.42±3.4829.33±3.4725.35±3.2722.32±3.7527.19±3.6123.63±2.5714.08±3.3112.18±3.5718.37±3.8317.10±2.4715型對照組相比，中劑量和大劑量本發明藥物組炎症細胞浸潤程度也明顯降低，大劑量組的抑制效果更加明顯。以上結果表明本發明藥物可以降低心肌損傷局部細胞粘附分子的表達，抑制中性粒細胞活化，減輕內皮細胞損傷和心肌局部炎症浸潤。與正常心肌組織相比，再灌注區血管內皮鈣粘素的表達明顯減少，無再流區內血管內皮鈣粘素和P-連環蛋白的含量顯著降低，而Y-連環蛋白含量在各區之間無明顯差異，表明再灌注區內皮細胞完整性已經受損，無再流區損傷程度更重，而且血管內皮鈣粘素和e-連環蛋白在維持內皮細胞屏障功能中有重要的作用，其表達水平下調促進了無再流的發生。與模型對照組相比，大劑量本發明藥物可以提高再灌注區和無再流區血管內皮鈣粘素表達水平，表明大劑量本發明藥物能夠抑制血管內皮鈣粘素的降解，改善和保護內皮細胞結構完整性，繼而維持血管內皮屏障功能。綜上所述，本發明藥物能夠抑制細胞粘附分子的表達，抑制炎症反應，增加血管內皮鈣粘素含量，保護內皮細胞屏障功能完整性。圖l光鏡觀察心肌組織服染色結果(高倍)A:假手術組；B:模型對照組再灌注區；C:模型對照組無再流區；圖2光鏡觀察心肌組織HE染色結果(高倍)D:小劑量組再灌注區；E:小劑量組無再流區；圖3光鏡觀察心肌組織HE染色結果(高倍)F:中劑量組再灌注區；G:中劑量組無再流區；圖4光鏡觀察心肌組織HE染色結果(高倍)H:大劑量組再灌注區；I:大劑量組無再流區具體實施例方式實施例l:膠囊劑的製備a)原料藥配方為人參39.6g水蛭赤芍33g蟬蛻46.2gb)藥材粉碎工藝蜈蚣72.6g土鱉蟲46.2g乳香(制)13.2g13.2g檀香13.2g全蠍19.8g6.6g冰片33g酸棗仁(炒)33g;將全蠍、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經淨選、水洗處理後和淨選炮製後的制乳香按處方配料，由粉碎機進行粉碎，藥粉細度達到80目以上;粗粉後的藥粉經各種超微粉碎技術進行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小於30-40pm;待粉碎的藥材經清洗烘乾滅菌後，配料；c)提取濃縮和乾燥工藝降香和檀香先加水提取揮髮油後再用水提取，赤芍和酸棗仁加適量水煎煮二次，每次3小時，合併水煎液，水提液過濾後，待濃縮成浸膏；人參用適量70%的乙醇提取二次，每次3小時，合併提取液，回收乙醇至無醇味，再用水提取，醇提液濃縮成相對密度為0.91.1(6(TC)醇提浸膏，水提液過濾與上述所有水提液混勻後濃縮至相對密度為0.91.1(6(TC)的清膏，備用；d)製劑工藝在沸騰制粒乾燥機中加入超微粉碎粉，再將步驟c)所得提取浸膏噴入制粒；將製成的顆粒經整粒，加入冰片細粉，噴入由降香和檀香提取的揮髮油，混勻後由膠囊充填機充填，製成1000粒膠囊。用法與用量口服。一次24粒，一日3次。實施例2:片劑的製備a)原料藥配方為人參66g水蛭52.8g土鱉蟲46.2g乳香(制)13.2g赤芍33g降香13.2g檀香13.2g全蠍59.4g蟬蛻46.2g蜈蚣6.6g冰片33g酸棗仁(炒)33gb)藥材粉碎工藝將全蠍、水蛭、蜈虼、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經淨選、水洗處理後和淨選炮製後的制乳香按處方配料，由粉碎機進行粉碎，藥粉細度達到80目以上;粗粉後的藥粉經各種超微粉碎技術進行超微粉碎，使藥粉平均粒徑小於70-90pm;待粉碎的藥材經清洗烘乾滅菌後，配料；c)提取濃縮和乾燥工藝降香和檀香先加水提取揮髮油後再用水提取，赤芍和酸棗仁加適量水煎煮二次，每次3小時，合併水提液，過濾後，待濃縮成浸膏；人參用適量70%的乙醇提取二次，每次3小時，合併提取液，回收乙醇至無醇味，再用水提取，醇提液濃縮成相對密度在6(TC測定為1.01.05醇提浸膏，水提液過濾與上述所有水提液混勻後濃縮至相對密度為1.01.1(6(TC)的清膏，備用；d)製劑工藝在沸騰制粒乾燥機中加入超微粉碎粉，再將步驟C)所得提取浸膏噴入制粒；將製成的顆粒經整粒，加入冰片細粉，噴入由降香和檀香提取的揮髮油，按常規製劑工藝壓製成1000片。本發明藥物的用量，為每次2-4片，每日服用三次。實施例3:丸劑的製備a)原料藥配方為人參39.6g水蛭66g土鱉蟲46.2g乳香(制)13.2g赤芍33g降香13.2g檀香13.2g全蠍46.2g蟬蛻46.2g蜈蚣6.6g冰片33g酸棗仁(炒)33gb)藥材粉碎工藝將全蠍、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五種蟲藥經淨選、水洗處理後和淨選炮製後的制乳香按處方配料，由粉碎機進行粉碎，藥粉細度達到80目以上;粗粉後的藥粉經各種超微粉碎技術進行超微粉碎，使藥粉平均粒徑10-20待粉碎的藥材經清洗烘乾滅菌後，配料；c)提取濃縮和乾燥工藝降香和檀香先加水提取揮髮油後再用水提取，赤芍和酸棗仁加適量水煎煮二次，每次3小時，合併水提液，過濾後，待濃縮成浸膏；人參用適量70%的乙醇提取二次，每次3小時，合併提取液，回收乙醇至無醇味，再用水提取，醇提液濃縮成相對密度為0.91.0(6(TC)醇提浸膏，水提液過濾與上述所有水提液混勻後濃縮至相對密度為1.01.1(6(TC)的清膏，備用；d)製劑工藝在沸騰制粒乾燥機中加入超微粉碎粉，再將步驟C)所得提取浸膏噴入制粒；將製成的顆粒經整粒，加入冰片細粉，噴入由降香和檀香提取的揮髮油，按常規製劑工藝，製成1000粒丸劑。本發明藥物的用量，為每次2-4粒，每日服用三次。權利要求1.一種中藥組合物在製備保護內皮細胞屏障功能完整性藥物中的應用，其特徵在於所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成人參3-10水蛭3-11土鱉蟲5-10乳香(制)1-5赤芍3-9降香1-5檀香1-5全蠍3-9蟬蛻3-12蜈蚣1-3冰片1-7酸棗仁(炒)3-10。2.如權利要求l所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成人參6水蛭10土鱉蟲7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蠍7蟬蛻7蜈蚣1冰片5酸麥仁(炒)5。3.如權利要求l所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成人參10水蛭8土鱉蟲7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蠍9蟬蛻7蜈蚣1冰片5酸棗仁(炒)5。4.權利要求l所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物由如下重量份的原料藥製成人參6水蛭11土鱉蟲7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蠍3蟬蛻7蜈蚣1冰片5酸棗仁(炒)5。5.如權利要求l-4中任一項所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物的活性成分由下列成分組成a平均粒徑小於100inm的全蠍、水蛭、蜈蛇、土鱉蟲、蟬蛻及制乳香藥粉；b冰片藥粉；c由降香和檀香提取的揮髮油；d人參用乙醇提取後的醇提液經濃縮後的醇提浸膏；e提取成分c後的降香和檀香藥渣的水提液、赤芍和炒酸冬仁加水煎煮後的水提液以及提取成分d後的人參藥渣的水提液過濾、混勻後濃縮成的水提浸膏。6.如權利要求l-4中任一項及權利要求5所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物的製劑劑型為膠囊劑、片劑、丸劑、口服液、軟膠囊劑或滴丸劑。7.如權利要求1-4中任一項所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物在製備抑制細胞粘附分子的表達藥物中的應用。8.如權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述的細胞粘附分子為P-選擇素和細胞間粘附分子1中之一或二者。9.如權利要求l-4中任一項所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物在製備減少炎症反應的藥物中的應用。10.如權利要求卜4任一項所述的應用，其特徵在於所述中藥組合物在製備增加血管內皮鈣粘素含量的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種中藥組合物在製備保護內皮細胞屏障功能完整性藥物中的應用，本發明中藥組合物能夠抑制細胞粘附分子的表達，減少炎症反應，增加血管內皮鈣粘素含量，保護內皮細胞屏障功能完整性。文檔編號A61P29/00GK101590121SQ200810055149公開日2009年12月2日申請日期2008年5月27日優先權日2008年5月27日發明者安軍永,李向軍,超王,鄭立發申請人:河北以嶺醫藥研究院有限公司