在異養型微生物中製備特製油的製作方法

2023-08-03 18:49:46 2

專利名稱：在異養型微生物中製備特製油的製作方法
技術領域：
本發明涉及從微生物中生產油類、燃料和油脂化學品。特別地，本文公開的內容涉及產油微藻、對其進行培養用以生產有用化合物(包括脂類、脂肪酸酯、脂肪酸、醛、醇和烷烴)的方法，以及對其進行遺傳學改造用以提高生產效率和改變由其生產之油類類型和組分的方法和試劑。
背景技術：
化石燃料是埋葬之有機材料的可燃地質沉積物的通用術語，其由腐爛的動植物形成，所述動植物通過數億年間暴露於地殼中的熱和壓力已經轉化成為原油、煤、天然氣或者重油。化石燃料是有限的、不可再生的資源。全球經濟帶來的能源需求增加還使得碳氫化合物的成本壓力逐漸增加。除了能源之外，很多工業，包括塑料業和化學品生產商，主要依賴於獲得碳氫化合物作為其生產過程的給料。對目前供給來源的具有成本效益的替代品可以幫助減輕能源和這些原材料成本的不斷增加的壓力。PCT公開No. 2008/151149描述了為了生產油類而培養藻類的方法和材料，並且特別地舉例說明從由微藻原殼小球藻(Chlorella protothecoides)生產的油類中生產柴油。仍然需要提供在微藻中生產油類的改進型方法，特別是以較高產率和效率生產鏈長度較短、飽和度較高並且沒有色素的油類的方法。本發明符合這種需求。發明概述本發明提供了原藻(Prototheca)屬的細胞，其包含外源基因，在一些實施方案中，細 Ifi : Prototheca moriformis> Prototheca krugani> Prototheca stagnora 5 ^ Prototheca zopfii菌種的細胞株，在其他實施方案中，細胞具有與SEQ ID NO :11-19中一種或者多種序列具有至少70、75、80、85或者95%核苷酸一致性的23S rRNA序列。在一些細胞中，外源基因是編碼序列並且與啟動子處於可操作連接，在一些實施方案中，啟動子來源於原藻屬菌種的內源性基因。在進一步的實施方案中，編碼序列編碼選自由蔗糖轉化酶、 脂肪醯基-ACP硫酯酶、脂肪醯基-CoA/醛還原酶、脂肪醯基-CoA還原酶、脂肪醛還原酶、脂肪醛脫羰基酶、醯基載體蛋白和賦予抗生素抗性的蛋白組成的組中的蛋白。對鏈長度為C8、C10、C12或者C14的一種或者多種脂肪醯基-ACP底物具有水解活性之脂肪醯基-ACP硫酯酶的一些實施方案包括與SEQ ID NO :59、61、63和138-140中一種或者多種序列具有至少 50、60、70、80或者90%胺基酸一致性的醯基-ACP硫酯酶。在進一步的實施方案中，編碼序列包含微藻質體靶向序列，在一些實施方案中，微藻是原藻屬或者小球藻屬或者小球藻科其他屬的菌種。在一些實施方案中，質體靶向序列與SEQ ID NO :127-133中一種或者多種序列具有至少20、25、35、45或者55%的胺基酸序列一致性，並且能夠靶向由沒有定位於質體基因組的外源基因所編碼的蛋白。在其他實施方案中，啟動子響應於細胞培養基中氮氣的減少或者消失而上調，例如上調至少3倍，其通過測定當胞外環境從含有至少IOmM或者 5mM氮氣變成不含氮氣時原藻屬細胞中轉錄子豐度而得到。在進一步的實施方案中，啟動子包含SEQID NO :91-102中一種序列的50個或者更多核苷酸片段。在其他實施方案中，細胞具有與SEQ ID NO 11-19中一種或者多種序列具有至少70、75、80、85或者95%核苷酸一致性的23S rRNA序列。在其他實施方案中，外源基因整合到細胞染色體中。在本發明細胞的附加實施方案中，細胞是原藻屬的細胞，並且包含外源脂肪醯基-ACP硫酯酶基因和C8-C14含量為細胞總脂量之至少4%的脂類特性，其中C8含量是細胞總脂量的至少0.3%，ClO含量是細胞總脂量的至少2%，C12含量是細胞總脂量的至少 2%, C14含量是細胞總脂量的至少4%，C8-C14含量是細胞總脂量的10-30%、20-30%或者至少10、20或30%。在一些實施方案中，細胞是Prototheca moriformis、Prototheca krugani、Prototheca stagnora或者Prototheca zopfii菌禾中的細胞株，在其他實施方案中，細胞具有與SEQ ID NO :11-19中一種或者多種序列具有至少70、75、80、85或者95%核苷酸一致性的23S rRNA序列。在其他實施方案中，外源脂肪醯基-ACP硫酯酶基因整合到細胞染色體中。本發明的其他實施方案包括製備甘油三酯組合物的方法，所述甘油三酯組合物具有C8-C14含量為甘油三酯組合物之至少4% w/w或者面積百分比的脂類特性，其中 C8含量是至少0. 3% w/w或者面積百分比，ClO含量是至少2% w/w或者面積百分比，C12 含量是至少2% w/w或者面積百分比，C14含量是至少4% w/w或者面積百分比，C8-C14含量是10-30%、20-30%或者至少10、20或30% w/w或者面積百分比。本發明還包括製備甘油三酯的方法，其包括培養上述細胞，其中所述細胞還包含編碼蔗糖轉化酶的外源基因，並且蔗糖作為碳源供給。在一些實施方案中，蔗糖轉化酶與SEQ ID NO :3,20- 和90中一種或者多種序列具有至少50、60、70、80或者90%的胺基酸一致性。本發明的實施方案包括甘油三酯組合物以及含有甘油三酯組合物的細胞，所述組合物具有C8-C14含量為至少4%的脂類特性和一種或者多種下列屬性0. 1-0. 4微克/ ml的總類胡卜素、少於0.4微克/ml的總類胡卜素、少於0. 001微克/ml的番茄紅素；少於0.02微克/ml的β-胡蘿蔔素、每千克油中少於0.02毫克的葉綠素；每100克油中 0.40-0. 60毫克的Y-生育酚；每克油中0.2-0. 5毫克的總生育三烯酚、每克油中少於0.4 毫克的總生育三烯酚、每100克油中4-8mg的菜油甾醇，每100克油中40_60mg的豆甾醇。在本發明的一些實施方案中，甘油三酯油類組合物具有C8-C14含量為甘油三酯組合物之至少4% w/w或者面積百分比的脂類特性，其中C8含量是至少0. 3% w/w或者面積百分比，ClO含量是至少2% w/w或者面積百分比，C12含量是至少2% w/w或者面積百分比， C14含量是至少4% w/w或者面積百分比，C8-C14含量是10-30%、20_30%或者至少10、20 或30% w/w或者面積百分比。在其他實施方案中，甘油三酯油類組合物與至少另外一種組
6合物混合，所述另外一種組合物選自由下列物質組成的組大豆、油菜籽、加拿大油菜、棕櫚葉、棕仁、椰子、玉米、廢植物、烏桕油、橄欖、向日葵、棉花籽、雞脂肪、牛脂、微藻、大型藻類、 萼距花(Cuphea)、亞麻、花生、精選白色動物油脂、豬油、亞麻芥油(Camelina sativa)、芥菜籽、腰果、燕麥、羽扇豆、洋麻、金盞花、大麻、咖啡豆、亞麻仁(亞麻籽)、榛子、大戟屬、南瓜籽、香菜、山茶、芝麻、紅花、稻米、油桐樹、可可、幹椰子肉、罌粟花、蓖麻籽、碧根果、加州希蒙得木、麻風樹、夏威夷果、巴西堅果、鱷梨、石油或者上述任意一種油類的餾分。本發明的方法還包括通過進行一個或者多個化學反應來對前面涉及的油類進行加工，用以產生游離脂肪酸和進行皂化作用，所述化學反應選自以下反應轉酯基作用、氫化作用、加氫裂解作用、脫氧作用、異構化作用、酯交換作用、羥基化作用、水解作用。本發明還包括從前面涉及之油類的氫化作用製備的碳氫化合物燃料。在一些實施方案中，從分離自原藻屬細胞的甘油三酯中製備碳氫化合物燃料，其中ASTM D86 T10-T90蒸餾範圍是至少 25°C°C。在其他實施方案中，從分離自原藻屬細胞的甘油三酯中製備脂肪酸烷基酯，其中組合物具有少於120秒的ASTM D6751 Al低溫適應時間。本發明還包括一種組合物，其包含(a)包含一種或者多種單糖的多糖，所述單糖由20-30摩爾百分比的半乳糖、55-65摩爾百分比的葡萄糖和5_15摩爾百分比的甘露糖組成；(b)蛋白質；和(c)包含與SEQ ID NO :11-19中一種或者多種序列具有至少70、75、80、 85或者95%核苷酸一致性之23S rRNA序列的DNA ；和(d)外源基因。在一些實施方案中， 所述外源基因選自蔗糖轉化酶和脂肪醯基-ACP硫酯酶，在進一步的實施方案中，組合物進一步包含脂類，所述脂類具有C8-C14含量為至少4%的脂類特性。在其他實施方案中，組合物以用作動物飼料而製備。本發明包括編碼啟動子的重組核苷酸，所述啟動子響應於原藻屬細胞培養基中氮氣的減少或者消失而上調，例如上調至少3倍，其通過測定當胞外環境從含有至少IOmM或者5mM氮氣變成不含氮氣時原藻屬細胞中的轉錄子豐度而得到。在一些實施方案中，重組核苷酸包含SEQ ID NO :91-102中一種序列的50個或者更多核苷酸片段。本發明還包括包含表達盒的核苷酸載體，所述表達盒包含(a)在原藻屬細胞中具有活性的啟動子；和(b)與啟動子處於可操作連接的編碼序列，其中所述編碼序列含有表1中最優選或者第二最優選的密碼子，其佔編碼序列中密碼子的至少20、30、40、50、60或者80%。在一些載體中，編碼序列包含與脂肪醯基-ACP硫酯酶讀碼框相同的質體靶向序列，所述脂肪醯基-ACP硫酯酶包括對鏈長度為C8、C10、C12或C14的一種或者多種脂肪醯基-ACP底物具有水解活性的硫酯酶。一些載體包含編碼能夠使蛋白靶向原藻屬細胞質體之多肽的質體靶向序列，包括微藻質體靶向序列和與SEQ ID Nos. 127-133中一種或者多種序列具有至少20、30、35、45或者陽％胺基酸序列一致性並且能夠使蛋白靶向原藻屬細胞質體的質體靶向序列。本發明額外的載體包含原藻屬細胞核基因組外源性核酸序列，其中所述序列的長度是至少200個核苷酸，一些載體包含原藻屬細胞核基因組外源性第一和第二核酸序列，其中所述第一和第二序列(a)長度均是至少200個核苷酸；(b)處於表達盒側翼；和(c)位於相同的原藻染色體上，其間隔不大於5、10、15、20和50kB。本發明還包括與SEQ ID NO :1；34-135中一種或者兩種序列具有至少80、90、95或者98%核苷酸一致性的重組核酸和編碼與SEQ ID NO :136-137中一種或者兩種序列具有至少80、90、95或者98%胺基酸一致性之蛋白的重組核酸。
本發明還包括製備甘油三酯組合物的方法，其包括(a)在固定碳源存在下培養原藻屬細胞群，其中(i)所述細胞含有外源基因；(ii)所述細胞積累至少10、20、30、40、60 或者70%細胞乾重的脂類；和(iii)所述固定碳源選自由高粱和經解聚的纖維素類物質組成的組；和(b)從培養的微生物中分離脂類組分。在一些實施方案中，固定碳源是經解聚的纖維素類物質，其選自由玉米秸稈、芒草(Miscanthus)、飼用高粱、甜菜渣和甘庶渣組成的組，可選地在培養步驟前用水對這些材料進行清洗。在一些方法中，固定碳源是經解聚的纖維素類物質，並且在培養步驟前使經解聚的纖維素類物質中的葡萄糖水平濃縮至至少 300g/升、至少400g/升、至少500g/升或者至少600g/升，並隨著細胞生長和積累脂質的時間供給到培養基中。在一些方法中，外源基因編碼對鏈長度為C8、C10、C12或C14的一種或者多種脂肪醯基-ACP底物具有水解活性的脂肪醯基-ACP硫酯酶，在一些方法中甘油三酯具有C8-C14含量為至少4%的脂類特性和一種或者多種下列屬性0. 1-0. 4微克/ml的總類胡卜素、每千克油中少於0. 02毫克的葉綠素；每100克油中0. 40-0. 60毫克的Y -生育酚；每克油中0. 2-0. 5毫克的總生育三烯酚、每100克油中4-8mg的菜油甾醇和每100克油中40-60mg的豆甾醇。本發明中進一步的方法包括製備甘油三酯組合物，其包括(a)在經解聚的纖維素類物質存在下培養微生物群；其中(i)在培養步驟前用水對經解聚的纖維素類物質進行清洗；(ii)細胞積累至少10、20、30、40、60或者70%細胞乾重的脂類；和(iii)在培養步驟前使經解聚的纖維素類物質中的葡萄糖水平濃縮至至少300、400、500或者600g/升；(iv) 以分批補料反應方式培養微生物，其中用葡萄糖水平為至少300、400、500或者600g/升的經解聚的纖維素類物質供給微生物；和(b)從培養的微生物中分離脂類組分。在一些實施方案中，固定碳源是經解聚的纖維素類物質，其選自由玉米秸稈、芒草、飼用高粱、甜菜漿和甘蔗渣組成的組。在進一步的實施方案中，微生物是原藻屬的菌種並且含有一種外源基因， 所述外源基因包括對鏈長度為C8、C10、C12或C14的一種或者多種脂肪醯基-ACP底物具有水解活性的脂肪醯基-ACP硫酯酶。本發明中進一步的方法包括生產甘油三酯油類，其包括在蔗糖作為碳源存在下培養具有與SEQ ID NO :30具有至少90或者96%核苷酸一致性之 23S rRNA序列的細胞。本發明還包括製備化學品的方法，其包括對甘油三酯油類進行一種或者多種化學反應和皂化作用，所述化學反應選自以下反應轉酯基作用、氫化作用、加氫裂解作用、脫氧作用、異構化作用、酯交換作用、羥基化作用、水解作用，其中所述油類具有C8-C14含量為至少4%的脂類特性和一種或者多種下列屬性0. 1-0. 4微克/ml的總類胡卜素、每千克油中少於0. 02毫克的葉綠素；每100克油中0. 10-0. 60毫克的Y-生育酚；每克油中0. 1-0.5 毫克的總生育三烯酸、每克油中少於0. 4毫克的總生育三烯酸、每100克油中I-Smg的菜油甾醇，每100克油中10-60mg的豆留醇。一些方法通過培養包含外源脂肪醯基-ACP硫酯酶基因的原藻屬細胞來生產油類而進行，所述基因編碼對鏈長度為C8、C10、C12或C14的一種或者多種脂肪醯基-ACP底物具有水解活性的脂肪醯基-ACP硫酯酶。在一些方法中，水解反應選自由皂化作用、酸水解、鹼水解、酶促水解、催化水解和熱壓水水解組成的組，其包括將油類分解為甘油和脂肪酸的催化水解反應。在進一步的方法中，使脂肪酸發生氨基化反應，以產生脂肪族含氮化合物，或者發生臭氧分解反應，以產生一元和二元酸。在一些實施方案中，對油類使用甘油三酯分解方法，所述方法選自由酶促分解和壓力分解組成的組。在
8一些方法中，水解反應之後進行縮合反應。其他方法包括對油類進行氫化處理反應，可選地其中在氫化處理反應之前或者同時使氫化處理反應的產物進行脫氧反應或者縮合反應。一些方法額外地包括氣體脫除反應。額外的方法包括通過進行脫氧反應對前面涉及的油類進行加工，所述反應選自由氫解反應、氫化作用、連續性氫化-氫解反應、連續性氫解-氫化反應和氫化-氫解聯合反應組成的組。在一些方法中，脫氧反應之後進行縮合反應。其他方法包括對前面涉及的油類進行酯化反應，可選地進行酯交換反應或者轉酯基反應。其他方法包括對前面涉及的油類進行羥基化反應，可選地其中在羥基化反應之後進行縮合反應。


圖1和圖2顯示以高粱作為碳源生長之原藻菌種和Cholorella Iuteoviridis菌株SAG 2214的生長曲線。圖3顯示SAG 2214在葡萄糖和蔗糖中生長的時間進程。圖4顯示如實施例3中所描述在原藻轉化中使用的表達盒。圖5顯示如實施例3中所描述UTEX菌株14353個轉化子的Southern印跡分析結^ ο圖6顯示經密碼子優化和未經密碼子優化之suc2 (酵母蔗糖轉化酶(yhv))轉基因質粒的圖解。示出相關限制性克隆位點，箭頭表示轉錄方向。圖7a顯示在纖維素來源的糖類(玉米秸稈、甜菜漿、高粱蔗、芒草和葡萄糖對照) 中生長之ftOtotheca moriformis的結果。以光學密度測定(A750讀值)表示生長。圖7b顯示與葡萄糖/木糖對照相比，利用不同水平的玉米秸稈來源之纖維素糖類進行Prototheca moriformis生長實驗的結果。圖7c顯示木糖對在原藻培養物中生產脂類的影響。圖7d顯示鹽濃度(Nii2SO4)和防沫劑對原藻生長(以細胞乾重(DCW)表示)的影響。圖8顯示對多種纖維素類物質(甘蔗渣、高粱蔗、芒草和甜菜漿)進行熱水處理和得到的糖蒸汽對原藻生長的影響。圖9顯示重複循環進行熱水處理後纖維素類生物質(甘蔗渣、高粱蔗、芒草和甜菜漿)中羥甲基糠醛(HMF)和糠醛水平不斷減少。圖10顯示纖維素類物質糖化過程的圖解，其產生適用於在發酵罐中進行異養型油類生產的糖蒸汽。圖11顯示重複循環進行熱水處理後在經汽爆的甘蔗渣中HMF和糠醛水平不斷減少。圖12顯示原藻轉化中使用之硫酯酶質粒的圖解。異源β-微管蛋白(驅動NeoR) 和穀氨酸脫氫酶啟動子分別來源於萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和Chlorella Sorokiniana0硝酸鹽還原酶3』UTR來源於普通小球藻(Chlorella vulgaris)。示出相關限制性克隆位點，箭頭顯示轉錄方向。圖13顯示由原藻甘油三酯油類生產之可再生柴油的色譜圖。發明詳述本發明起因於發現原藻和某些相關微生物出乎意料地具有能夠經濟並且大量地
9生產油類、燃料和其他碳氫化合物或者脂類組合物的優勢特性，以及發現對這些微生物進行遺傳學改造用以促進這些特性的方法和試劑。除了其他應用之外，由這些微生物生產的油類可以用於運輸燃料、石油化學品和/或食品和化妝品工業中。脂類的轉酯基作用產生可用作生物柴油的長鏈脂肪酸酯。可以對其他酶促和化學過程進行調整，用以產生脂肪酸、 醛、醇、烷烴和烯烴。在一些應用中，可以生產可再生柴油、噴氣燃料或者其他碳氫化合物。 本發明還提供了培養微藻的方法，用以增加產量和脂類產率，和/或更具成本效率地生產本文中描述的組合物。為了便於閱讀，發明的詳細描述分為幾個章節。第1章提供了本文中使用之術語的定義。第2章描述了本發明方法中使用的培養條件。第3章描述了遺傳工程方法和材料。 第4章描述了使原藻能夠利用蔗糖的遺傳工程。第5章描述了使原藻調整脂類生物合成的遺傳工程。第6章描述了製備燃料和化學品的方法。第7章公開了本發明的實施例和實施方案。發明詳述後面是實施例，其闡述了發明的多個方面和實施方案。1.定義除非另有定義，本文中使用的所有技術性和學術性術語具有與本發明所屬領域技術人員通常理解的含義。下列參考文獻為技術人員提供本發明中使用之許多術語的一般定義Singleton 等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994) ；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed. ,1988)； The Glossary of Genetics, 5th Ed. , R. Rieger 等，(eds. ), Springer Verlag (1991)；禾口 Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另有說明，本文中使用的下列術語具有賦予其的含義。「在微藻中具有活性」是指在微藻中具有功能的核酸。例如，用於驅動抗生素抗性基因以賦予轉基因微藻抗生素抗性的啟動子在微藻中具有活性。「醯基載體蛋白」或者「ACP」是脂肪酸合成過程中作為硫酯在4』 -磷酸泛醯巰基乙胺基團的遠端硫醇基處與生長的醯基鏈結合的蛋白，其包含脂肪酸合成酶複合體組分。「醯基-CoA分子」或者「醯基-CoA」是包含醯基基團的一種分子，所述醯基基團在輔酶A4』 -磷酸泛醯巰基乙胺基團的遠端硫醇基處通過硫酯鍵連接與輔酶A共價連接。「面積百分比」是指利用FAME GC/FID檢測方法觀察到的峰面積，在所述檢測方法中，檢測前將樣品中的每個脂肪酸均轉化成為脂肪酸甲酯(FAME)。例如，與其他任何脂肪酸例如C14:l相比，對於14個碳原子的飽和脂肪酸(C14:0)可以觀察到單獨的峰。每種FAME 的峰面積與其在混合物中的百分含量是成比例的，其可以基於樣品中存在之所有峰的總和來計算(即[特異性峰的面積/所有被測峰的總面積]X 100)。當涉及本發明之油類和細胞的脂類特性時，「C8-C14含量為至少4% 」是指細胞中或者提取的甘油脂組合物中總脂肪酸的至少4%具有包括8、10、12或者14個碳原子的鏈長度。「無菌的」是無其他有生命的生物體汙染的生物體培養物。「生物柴油」是利用生物學方法產生的脂肪酸醯酯，其適於在柴油發動機中用作燃料。「生物質」是通過細胞生長和/或繁殖產生的物質。生物質可以包含細胞和/或胞內內含物以及胞外物質，其包括但不限於由細胞分泌的化合物。「生物反應器」是封閉或者半封閉腔體，細胞培養於其中，可選地以懸浮形式。
「催化劑」是一種試劑，例如分子或者大分子複合體，其能夠幫助或者促進反應物至產物的化學反應而不會成為產物的一部分。催化劑使反應速率增加，接著催化劑可以作用於另一個反應物，以生成產物。催化劑一般使反應所需的總活化能降低，以使反應更快地或者在較低溫度下進行。因此，可以更快地到達反應平衡。催化劑的示例包括酶，其是生物催化劑；熱，其是非生物催化劑；和在化石油類提煉過程中使用的金屬。「纖維素類物質」是纖維素的消化產物，其包括葡萄糖和木糖，以及可選地額外的化合物(例如二糖、寡糖、木質素、糠醛和其他化合物)。纖維素類物質來源的非限定性示例包括甘蔗渣、甜菜漿、玉米秸稈、木片、鋸末和柳枝稷。「共培養」和其變體例如「共培育」和「共發酵」是指在相同的生物反應器中存在兩種或者多種類型的細胞。兩種或者多種類型的細胞可以均是微生物，例如微藻，或者可以是微藻細胞與一種不同的細胞類型培養。培養條件可以是刺激兩種或者多種類型細胞生長和 /或繁殖的條件，或者是促進兩種或者多種細胞中的一種或者其子代生長和/或繁殖同時使剩餘細胞保持生長的條件。「輔助因子」是除底物之外的任何分子，是酶發揮其酶促活性所需的分子。「互補DNA」或者「 cDNA」是mRNA的DNA拷貝，一般通過信使RNA (mRNA)的逆轉錄或者擴增(例如通過聚合酶鏈式反應(「PCR」))獲得。「培育」或者其變體例如「培養」和「發酵」是指通過使用可選和/或可控條件有意地刺激一種或者多種細胞的生長(細胞大小、細胞內含物和/或細胞活性增加)和/或繁殖(通過有絲分裂使細胞數量增加)。生長和繁殖的組合可以稱作增殖。可選和/或可控條件的示例包括使用限定性培養基(具有已知特性，例如PH值、離子強度和碳源)、指定溫度、氧壓、二氧化碳水平和在生物反應器中生長。培育不是指自然界中微生物的生長或繁殖或者除此之外無人為幹涉；例如，最終變成化石以產生地質原油之生物體的自然生長不是培育。「細胞裂解」是低滲環境中細胞的裂解。細胞裂解是由過度滲透或者水向細胞內側運動(水分過多)引起。細胞不能承受內側水的滲透壓，因此發生爆炸。「脫脂粉(Delipidated meal) 」和「脫脂的微生物生物質」是油類被提取或者分離後的微生物生物質，其通過利用機械(即通過壓榨機實施)，或者溶劑萃取，或者二者同時使用。與從微生物生物質中提取或者分離油類/脂類之前相比，脫脂粉中油類/脂類含量減少，但是其含有一些殘留的油類/脂類。「表達載體」或者「表達構建體」或者「質粒」或者「重組DNA構建體」是指通過人為幹涉製備的核酸，包括利用使得宿主細胞中特定核酸進行轉錄和/或翻譯的一系列特定核酸元件通過重組方法或者直接的化學合成來製備。表達載體可以是質粒、病毒或者核酸片段的一部分。表達載體通常包含需要轉錄的核酸，其與啟動子可操作地連接。「外源基因」是編碼被引入(「轉化」)細胞中之RNA和/或蛋白表達的核酸。經轉化的細胞可以被稱為重組細胞，其中可以引入額外的外源基因。相對於被轉化的細胞，外源基因可以來源於不同物種(因而是異源的)，或者來源於相同物種(因而是同源的)。因此，外源基因可以包括相對於基因的內源拷貝在細胞基因組中佔據不同位置或者處於不同控制下的同源基因。外源基因可以在細胞中存在多於一個拷貝。外源基因可以通過插入基因組或者作為附加分子存在於細胞中。
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「外源提供」是指提供到細胞培養之培養基中的分子。「壓榨」是從原材料(例如大豆和油菜籽)中提取油類的一種機械方法。壓榨機是一種螺旋型機器，其擠壓材料使其通過封閉桶樣的腔。原材料進入壓榨機的一側，廢餅從另一側擠出，而油從箱體柱子之間滲出並被收集。該機器使用由螺杆轉動產生的摩擦力和持續壓力來移動並擠壓原材料。油通過不能使固體通過的小開口滲出。由於原材料被擠壓， 通常摩擦力使得其變熱。「脂肪醯基-ACP硫酯酶」是在脂類合成過程中催化從醯基載體蛋白中切割下脂肪酸的酶。「脂肪醯基-CoA/醛還原酶」是催化醯基-CoA還原成為伯醇的酶。「脂肪醯基-CoA還原酶」是催化醯基-CoA還原成為醛的酶。「脂肪醛脫羰基酶」是催化脂肪醛轉化成為烷烴的酶。「脂肪醛還原酶」是催化醛還原成為伯醇的酶。「固定碳源」是一種含碳分子，通常是有機分子，其在環境溫度和壓力下以固體或者液體形式存在於培養基中，可以被培養於培養基中的微生物使用。「勻漿物」是被物理破壞的生物質。「碳氫化合物」是僅含有氫原子和碳原子的分子，其中碳原子共價連接形成直鏈、 支化、環狀或者部分環狀的主鏈，氫原子連接到主鏈上。碳氫化合物的分子結構從最簡單的甲烷(CH4)(天然氣成分)形式到非常大並且非常複雜的結構(例如在原油中發現的浙青質、石油和浙青)之間變化。碳氫化合物可以是氣態、液態或者固態形式，或者這些形式的任意組合，並且主鏈中相鄰的碳原子之間具有一個或者多個雙鍵或三鍵。因此，該術語包括直鏈、支化、環狀或者部分環狀的烷烴、烯烴、脂類和石蠟。其示例包括丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷和鯊烯。「碳氫比」是分子中氫原子和碳原子的比率(基於原子對原子)。該比率可以用於指碳氫化合物分子中碳原子和氫原子的數量。例如，具有最高比率的碳氫化合物是甲烷 CH4 (4 1)。「疏水組分」是材料的一部分或者片段，其在疏水相中比在水相中可溶性更高。疏水組分在水中基本上是不可溶的並且一般是非極性的。「脂類產率增加」是指微生物培養物產量增加，例如通過增加每升培養物的細胞乾重、增加生產脂類之細胞的百分比或者增加單位時間內每升培養物體積的脂類總量。「誘導型啟動子」是響應於特定刺激物而介導可操作連接之基因進行轉錄的啟動子。「可操作連接」是兩個核酸序列之間的功能性連接，所述核酸序列例如控制序列 (通常是啟動子)和相連序列(通常是編碼蛋白的序列，也被稱為編碼序列)。如果啟動子可以介導外源基因轉錄，那麼啟動子與外源基因處於可操作連接。「原位」是指「在適當位置」或者「在其原始位置」。「營養物質的限制性濃度」是培養基中化合物的濃度，其限制培養之微生物的繁殖。「營養物質的非限制性濃度」是在特定培養期間提供最大繁殖的濃度。因此，在營養物質限定性濃度存在下，特定培養期間產生的細胞數低於當營養物質是非限定性時。當營養物質的濃度大於提供最大繁殖的濃度時，該營養物質在培養基中被稱為是「過量」的。
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「脂酶」是一種水溶性酶，其催化水不溶性脂類底物的酯鍵發生水解。脂酶催化脂類水解成為甘油和脂肪酸。「脂類修飾酶」是指一種改變脂類共價結構的酶。脂修飾酶的示例包括脂酶、脂肪醯基-ACP硫酯酶、脂肪醯基-CoA/醛還原酶、脂肪醯基-CoA還原酶、脂肪醛還原酶和脂肪醛脫羰基酶。「脂類途徑酶」是在脂類代謝(即脂類合成、修飾或者降解)中發揮作用的任何酶， 和對脂類進行化學修飾的任何蛋白以及載體蛋白。「脂類」是溶於非極性溶劑(例如醚和氯仿)並且相對或者完全不溶於水的一類分子。脂類分子具有這些特性，因為其大部分由天然疏水性長烴尾組成。脂類的示例包括脂肪酸(飽和的和不飽和的)、甘油酯或者甘油脂(例如甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯或者中性脂肪，和磷酸甘油酯或者甘油磷酸酯)、非甘油酯(鞘脂類、留醇脂(包括膽留醇和留類激素)、異戊烯醇脂(包括萜類)、脂肪醇、蠟和聚酮類)和複合脂類衍生物(連接糖的脂類， 或者糖脂，和連接蛋白的脂類)。「脂肪」是脂類的亞族，其被稱為「甘油三酯」。「裂解物」是含有已裂解細胞之內含物的溶液。「裂解」是生物體的質膜以及可選地細胞壁發生破裂，其足以釋放至少部分胞內內含物，通常通過機械、病毒或者滲透機制損傷其完整性。「溶解」是生物體或者細胞的細胞膜和可選的細胞壁被破壞，其足以釋放至少部分胞內內含物。「微藻」是含有葉綠體和或者質體並且可選地能夠進行光合作用的真核微生物，或者是能夠進行光合作用的原核微生物。微藻包括不能代謝固定碳源作為能量的專性光能自養生物以及完全依靠固定碳源生存的異養生物。微藻包括細胞分裂後即刻與姐妹細胞分離的單細胞生物(例如衣藻(Chlamydomonas))以及例如團藻(Volvox，兩種不同細胞類型簡單多細胞光合微生物)的微生物。微藻包括例如小球藻、杜氏藻(Dunaliella)和原藻細胞。 微藻還包括顯示細胞-細胞粘附的其他光合微生物，例如阿格門氏藻(Agmenellum)、魚腥藻(Anabaena)和桑椹藻(Pyrobotrys)。微藻還包括喪失進行光合作用的能力的專性異常微生物，例如某些雙鞭甲藻和原藻屬中的菌種。「微生物」是用顯微鏡可以看見的單細胞生物體。對於兩種蛋白或者基因的「天然共表達」是指蛋白或者其基因天然共表達於其來源的組織或者生物體中，例如由於編碼這兩種蛋白的基因處於共同調控序列的控制下，或者由於其響應於相同刺激物而表達。「滲透壓休克」是滲透壓突然減少後溶液中細胞的破裂。有時誘導發生滲透壓休克，以使這些細胞的細胞內含物釋放到溶液中。「多糖降解酶」是能夠催化多糖水解或者糖化的任意酶。例如，纖維素酶催化纖維素水解。「多糖」或者「聚糖」是由通過糖苷鍵連接到一起的單糖組成的碳水化合物。可以利用酶使纖維素解聚，以產生單糖(例如木糖和葡萄糖)以及較大的二糖和寡糖。「啟動子」是指導核酸轉錄的核酸控制序列。本文中使用的啟動子包括轉錄起始位點附近的必需核酸序列，例如對於II型聚合酶啟動子來說是TATA元件。可選地，啟動子還包括遠端的增強子或者抑制子元件，其可以位於離轉錄起始位點遠至數千鹼基對的位置。
「重組」是由於引入外源核酸或者改變天然核酸而被修飾細胞、核酸、蛋白或者載體。因此，例如重組細胞表達細胞天然形式中沒有的基因或者表達與由非重組細胞表達的那些基因不同的天然基因。「重組核酸」是一般通過對核酸進行處理(例如利用聚合酶和核酸內切酶)最初於體外形成的核酸，或者除此之外以通常天然不存在的形式。可以產生重組核酸，例如用以使兩種或者多種核酸處於可操作連接。因此，就本發明的目的而言，認為通過使通常天然不會連接的DNA分子相連接而於外體形成的分離的核酸或者表達載體是重組的。重組核酸一經製備並引入到宿主細胞或者生物體中，其可以利用宿主細胞體內的細胞體系進行複製；但是，這種核酸一經重組產生，儘管其隨後在胞內進行複製，就本發明的目的而言仍然認為其是重組的。類似地，「重組蛋白」是利用重組技術製備的蛋白，即通過重組核酸的表達。「可再生柴油」是烷烴(例如C10:0、C12:0、C14:0、C16:0和C18:0、)的混合物，其
通過脂類的加氧作用和脫氧作用產生。「糖化」是使生物質(通常是纖維素類生物質或者木質纖維素類生物質)轉化成為單糖(例如葡萄糖和木糖)的過程。「經糖化的」或者「經解聚的」是指通過糖化作用已經轉化成為單糖的纖維素類物質或者生物質。「聲波作用」是利用聲波能量破壞生物材料(例如細胞)的過程。「糠醛種類」是保持相同的基本結構特性的2-呋喃羧基醛或者其衍生物。「乾草」是收集穀粒後作物的經乾燥的莖和葉。「蔗糖利用基因」是當表達時幫助細胞能夠利用蔗糖作為能量來源的基因。本文中由蔗糖利用基因編碼的蛋白被稱為「蔗糖利用酶」，其包括蔗糖轉運蛋白、蔗糖轉化酶和己糖激酶(例如葡糖激酶和果糖激酶)。II.培養本發明總體涉及原藻菌株的培養，特別是重組原藻菌株的培養，用以生產脂類。為了便於閱讀，本章分為幾節。第1節描述了原藻菌種和菌株，以及如何通過基因組DNA的比較來鑑定新的原藻菌種和菌株以及相關微藻。第2節描述了用於培養的生物反應器。第3 節描述了培養基。第4節描述了依照本發明中闡述性培養方法生產油類。1.原藻菌種和菌株原藻是用於生產脂類的標誌性微生物，因為其可以產生大量脂類，特別是適用於生產燃料的脂類。與由其他微藻生產的脂類相比，由原藻生產的脂類具有較短長度和較高飽和度的碳氫鏈。此外，原藻脂類一般不含色素(葉綠素和某些類胡蘿蔔素低至不可檢出水平)，而且在任何情況下其色素含量遠遠少於來源於其他微藻的脂類。此外，相對於由其他微藻生產脂類，本發明中提供的重組原藻細胞可以以較高產率和效率以及較低成本生產脂類。本發明方法中使用的闡述性原藻菌株包括此外，這種微藻可以異養生長並且可以經遺傳工程改造成為 Prototheca wickerhamii、Prototheca stagnora (包括 UTEX 327)、 Prototheca portoricensis、Prototheca moriformis (包括 UTEX 菌株 1441,1435)禾口 Prototheca Zopfii0原藻屬的菌株是專性異養型。可以通過擴增基因組的特定靶區域來鑑定本發明中使用的原藻菌種。例如，可以通過利用引物和利用基因組任意區域的方法(例如利用mi等，Bot. Bu 11. Acad. Sin. (2001)42 :115-121 Identification of Chlorella spp 中描述的方法)對核和 / 或質體
14DNA進行擴增和測序，來鑑定特定的原藻菌種或者菌株。使用核糖體DNA序列分離。本領域技術人員使用公認的系統發生學分析方法(例如對核糖體內轉錄間隔區(ITS1和ITS2 rDNA)、23SrRNA、18S rRNA和其他保守的基因組區域進行擴增和測序)，不僅可以鑑定原藻菌種，還可以鑑定具有相似脂類特性和生產能力的生產碳氫化合物和脂類的其他生物體。 對藻類進行鑑定和分類的方法示例還可以見於例如Genetics，2005 Aug ； 170 (4) :1601-10 和 RNA，2005 Apr ； 11 (4) :361-4。因此，可以利用基因組DNA比較來鑑定本發明中使用的適宜微藻菌種。可以從微藻菌種中擴增基因組DNA的保守區域(例如但不限於編碼23S rRNA的DNA)，並比較共有序列，用以篩選與本發明中使用的優選微藻在分類學上相關的微藻菌種。對於原藻屬菌種的這種DNA序列比較的示例顯示於下面。基因組DNA比較還可以用於鑑定菌株保藏中錯誤鑑定的微藻菌種。菌株保藏通常基於表型特徵和形態特徵鑑定微藻菌種。使用這些特徵可能導致對微藻屬或者菌種進行錯誤分類。使用基因組DNA比較是基於系統發生學關係對微藻菌種進行分類的較好方法。本發明中使用的微藻通常具有編碼與SEQ ID NO :11-19具有至少99%、至少90% 或者至少85%核苷酸一致性之23S rRNA的基因組DNA序列。對於使用序列比較來確定核苷酸或者胺基酸一致性，通常以一種序列作為參照序列，測試序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將測試序列和參照序列輸入計算機中，指定子序列坐標(如果需要)，並且指定序列算法的程序參數。隨後基於指定的程序參數計算測試序列相對於參考序列的序列一致性百分比。可以例如通過局部同源性算法(Smith & Waterman，Adv. App 1. Math. 2 482(1981))、同源性比對算法(Needleman & Wunsch，J. Mol. Biol. 48 :443 (1970))、相似性搜索方法(Pearson & Lipman，Proc. Nat' 1. Acad. ki. USA85 :2444 (1988))、計算機實施的這些方法(GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.，Madison，WI)或者通過目檢(一般見於上文 Ausubel等)來進行比較序列的最佳比對。適於確定序列一致性和序列相似性百分比的另外一種算法示例是BLAST算法，其描述於Altschul等，J. Mol. Biol. 215 :403-410 (1990)中。進行BLAST分析的軟體可以在 National Centerfor Biotechnology Information _t (網址是 www. ncbi. nlm. nih. gov) 公開獲得。這種算法包括首先通過鑑定查詢序列中長度為W的短詞來鑑定高分數序列對 (HSR)，所述短詞在與資料庫序列中具有相同長度的詞比對時匹配或滿足某些正值的閾值分數Τ。T是指鄰域詞分數閾值(上文Ausubel等)。這些初始鄰域詞命中作為種子啟動搜索，用以尋找含有它們的較長HSI^s。接著該詞命中沿著每條序列在兩個方向延伸，遠至能夠提高累積比對分數。對於核苷酸序列，利用參數M(—對匹配殘基的獎勵分數，通常>0)和 N(非配對殘基的罰分，通常<0)計算累積分數。對於胺基酸序列，使用分數矩陣計算累積分數。每個方向上詞命中的延伸在下列情況時停止當累積比對分數由其達到的最大值降低數量X ；由於一個或者多個殘基比對負值的積累而使累積分數降至0或者以下；或者達到任一序列的末端。對於鑑定核酸或者多肽是否在本發明的範圍內，BLAST程序的默認參數是合適的。BLAST程序(對於核苷酸序列)使用的默認值是詞長(W)為11，期望值(E)為 10, M = 5, N = -4和進行兩條鏈的比較。對於胺基酸序列，BLAST程序使用的默認值是詞長(W)為3，期望值(E)為10和BL0SUM62分數矩陣。TBLATN程序(對於核苷酸序列，利用其蛋白序列)使用的默認值是詞長(W)為3，期望值(E)為10和BL0SUM62分數矩陣(參見 Henikoff& Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 10915 (1989))。除了計算序列一致性百分比之外，BLAST算法還可以進行兩個序列之間相似性的統計學分析(例如參見 Karlin & Altschul，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 90 5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一種相似性測定是最小總和概率(P(N))，其表示通過兩個核苷酸或者核酸序列之間偶然發生配對的概率。例如，如果測試核酸與參照核酸比較的最小總和概率小於大約0. 1，更優選小於大約0. 01，最優選小於大約0. 001，則認為該核酸與參照序列是相似的。除了生產合適的脂類或者碳氫化合物以生產油類、燃料和油脂化工產品之外，影響對本發明中使用的微生物進行選擇的其他考慮因素包括(1)脂類含量高(以細胞重量計算)；(2)易於生長；(3)易於進行遺傳工程化；(4)易於對生物質進行處理。在特定的實施方案中，野生型或者經遺傳工程化的微生物生產具有至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55%、至少60%、至少65%或者至少70%或者更多的脂類。優選生物體是異養生長型 (不存在光下生長於糖類中)。2.牛物反應器以進行遺傳學操作和生產碳氫化合物(例如脂類、脂肪酸、醛、醇和烷烴)為目的培養微生物。前面一種類型的培養以小規模並且最初至少在起始微生物可以生長的條件下進行。以生產碳氫化合物為目的的培養通常以大規模(例如10，000L.40, 000LU00, 000L 或者更大的生物反應器)在生物反應器中進行。通常利用本發明的方法在生物反應器內的液體培養基中對原藻進行培養。生物反應器通常不允許光進入。使用生物反應器或者發酵罐來培養微藻細胞，至其生理周期的多個階段。在異養生長和繁殖方法中使用生物反應器提供很多優勢。為了生產用於食品中的生物質，優選在液體中(例如在懸浮培養基中)大量發酵微藻。生物反應器(例如不鏽鋼發酵罐)可以容納非常大的培養體積(本發明的多個實施方案中使用具有40，000升和更大能力的生物反應器)。生物反應器通常還使得可以控制培養條件，例如溫度、PH值、氧壓和二氧化碳水平。 例如，生物反應器通常是可配置的，例如利用與管道連接的接口，以允許氣體組分(例如氧氣或者氮氣)通過液體培養物起泡。利用生物反應器還可以更容易地對其他培養參數(例如培養基的PH值、微量元素的類型和濃度以及其他培養基組分)進行控制。生物反應器可以配置成使培養基在微藻複製和數量增加期間流過生物反應器。例如在一些實施方案中，可以在接種後但是在細胞達到期望密度之前將培養基注入生物反應器中。在其他情況下，培養初始即將培養基充滿生物反應器，並且在接種培養物後不再注入培養基。換言之，使微藻生物質在液體培養基中培養一段時間，其間微藻複製並且數量增加；但是，在這期間沒有大量的液體培養基流過生物反應器。因此在一些實施方案中，接種後沒有液體培養基流過生物反應器。可以利用裝配有例如旋轉刀和旋槳、振蕩器、攪拌棒、用於將氣體增壓注入的裝置等設備的生物反應器使微藻培養物混合。混合可以是連續性的或者周期性的。例如，在一些實施方案中，沒有維持氣體進入和培養基進入的紊流條件以使微藻複製，直至所述微藻數量的增加達到期望水平。
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可以使用生物反應器接口引入或者提取氣體、固體、半固體和液體至含有微藻的生物反應室中。由於很多生物反應器具有多於一個接口(例如一個用於培養基進入，另一個用於取樣)，僅使一種物質進入或者保留一個接口是沒有必要的。例如，可以使用一個接口使培養基流入生物反應器中並且隨後用於取樣、進氣、排氣或者其他目的。優選可以重複使用取樣口，不會改變妥協培養物的無菌性質。取樣口可以配置成具有閥門或者具有使樣品停止和開始流動或者提供連續取樣裝置的其他設備。通常生物反應器具有能夠接種培養物的至少一個接口，其還可以用於其他目的，例如培養基進入或者氣體進入。生物反應器接口使得可以控制微藻培養物的氣體含量。例如，生物反應器的部分體積可以是氣體而非液體，並且生物反應器的氣體入口允許將氣體泵入生物反應器中。可以有益地泵入生物反應器中的氣體包括空氣、空氣/(X)2混合物、隋性氣體(例如氬氣)和其他氣體。通常生物反應器裝配成使得使用者能夠控制氣體進入生物反應器的速率。如上面提到，可以通過增加流入生物反應器的氣體來促進培養物混合。氣體流動增加還影響培養物的濁度。通過在液體培養基層下放置一個進氣口以使進入生物反應器的氣體在培養物表面起泡，可以產生紊流。一個或者多個排氣口使氣體可以洩漏，因此防止生物反應器中壓力累積。優選排氣口通向防止雜質微生物進入生物反應器的止回管道。3.培養基微藻培養基通常含有例如固定氮源、固定碳源、微量元素、可選地維持pH值的緩衝液和磷酸類物質(通常以磷酸鹽提供)等組分。其他組分可以包括鹽(例如氯化鈉)，特別是對於海水微藻。氮源包括有機和無機氮源，其例如包括但不限於分子氮、硝酸、硝酸鹽、 氨(純氨水或者鹽形式，例如(NH4)2S04*NH40H)、蛋白、大豆粉、玉米漿和酵母提取物。微量元素的示例包括鋅、硼、鈷、銅、錳和鉬，例如分別以SiCl2、H3BO3、CoCl2 · 6H20、CuCl2 · 2H20、 MnCl2 · 4H20 和(NH4)6Mo7O24 · 4H20 的形式提供。根據本發明的方法使用的微生物可以在全世界多個地點和環境中發現。由於其與其他菌種分離和其發生的進化趨異，因此難以預測提供最佳生長以及生產脂類和/或碳氫化合物成分的特定生長培養基。在某些情況下，特定的微生物菌株可能不能生長於特定的生長培養基中，因為存在某些抑制組分或者缺少該特定微生物菌株需要的某些關鍵性營養需求。一般可以從多種來源獲得固體和液體生長培養基，而且可以例如在線適用於多種微生物菌株之特定培養基的製備方法可以在http://VWW. utex. org/(University of Texas at Austin, 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183 ^^ )巾白勺藻類培養物保藏中心在線找到。例如，多種淡水和鹽水培養基包括描述於PCT
發明者A·索曼奇, G·魯登科, K·埃斯皮納, P·蔡, S·富蘭克林 申請人:索拉茲米公司