在膠原蛋白基質上獲得網狀生物高聚物的方法，由此生物高聚物製做的植入物及其製作方法

2023-08-03 16:58:31

專利名稱：在膠原蛋白基質上獲得網狀生物高聚物的方法，由此生物高聚物製做的植入物及其製作方法
技術領域：
本發明屬於眼科學領域，確切地說屬於獲得網狀生物高聚物的方法，屬眼外傷情況下用這種生物高聚物製作的用來封閉角膜和鞏膜傷口的植入物，以及獲取它的方法。
按照所提供的方法獲得的網狀生物高聚物，廣泛用於生產各種形式的眼科手術用的隱形眼鏡、覆蓋層和植入物以及各種病因的角膜營養性疾患的非手術治療。所提供的這種植入物，應用於治療眼睛鞏膜及角膜的外傷性疾患。
對於眼科學領域而言，目前已研製出一系列以膠原蛋白-天然蛋白質為基質的、能與眼睛組織生物學相容且具有低抗原的生物高聚物。為製做這種生物高聚物，曾對膠原蛋白的輻射穩定性進行過仔細研究，從而確定輻照的影響取決於輻照的劑量及其作用條件。當膠原蛋白溶液受到輻照時，既可發生膠原蛋白微纖維的縫合過程，又可發生退化過程。這要取決於膠原蛋白的濃度以及所用縫合促進劑的特性。已知一種膠原蛋白凝膠是用劑量為33千戈瑞的電離輻射對膠原蛋白輻照而得。由電泳圖象的改變，以及在酸中溶解度的下降證明在輻照的影響下，膠原蛋白凝膠中已形成新的結構鍵。還曾發現，對於蛋白水解發作的素質有所提高，即可對這些膠原蛋白凝膠形成的傷口之癒合產生有利的影響。但是，這種方法不可能用來製做諸如Problemy techniki w medycynie，t，Ⅻ，No3，1981，Bartelik，Wplyw sterylizacji radiacyjues na niektore Wlasciwosci fizykochemiczne zelu kolagenowego所說的具有給定機械強度和膨脹程度，以及發酵穩定性的任意立體形狀的移植物，因為當空氣中存在氧時，在這種輻照劑量下會發生膠原蛋白微纖維的解體過程。
已知一種製做眼科用膠原蛋白覆蓋層的方法(參見SU，A，1321420)，它的實質是將農業牲畜眼睛的鞏膜做鹼-鹽處理，把所得到的生物組織用有機酸水溶液(如醋酸水溶液)使之均質化以形成膠原蛋白溶液，針對緩衝液進行滲析，使膠原蛋白溶液除去低分子摻雜物，從而將膠原蛋白的溶液的PH值調整到4.5～7.5，並將得到的膠原蛋白溶液進行乾燥，與此同時就用這種膠原蛋白溶液模製成能夠重複出人眼睛的前面一塊的曲率的球面覆蓋層。
所得到的這種膠原蛋白覆蓋層的特點在於，其機械強度差，膨脹度低，容易被吸收。按照這種方法無法製做任意立體形狀的植入物，因為要模製這樣形狀的植入物只能用乾燥的方法。
作為本發明的基礎所提出的任務是，要擬定一種製取眼科用網狀生物高聚物的方法，即通過在專門選擇的條件下，用電離輻射輻照膠原蛋白溶液，以保證所得到的生物高聚物具有足夠的機械強度，很高的膨脹度和發酵穩定性;而且還要用這種生物高聚物製得眼睛外傷時用來封閉角膜和鞏膜傷口用的植入物，以及通過優選工藝過程來製取這種植入物的方法。在保持上述植入物的生物高聚物具有最佳性能的前提下，這種方法能保證該植入物具有給定的形狀和規格，以對傷口作完全封閉。
上述任務是這樣解決的。所提出的以膠原蛋白為基質製取眼科用網狀生物高聚物的方法，是通過將牲畜眼睛的鞏膜進行鹼-鹽處理，把得到的生物組織用有機酸的水溶液使之均質化，以形成膠原蛋白溶液，隨後從中除去低分子摻雜物。按照本發明，將清除過摻雜物的膠原蛋白溶液用一氧化二氮使其飽和，並將其濃度調整到不高於80(質量)%，之後將所得到的膠原蛋白溶液用劑量為0.5～15千戈瑞的電離輻射進行輻照，直至形成網狀生物高聚物。
由予先選好的輻照劑量、膠原蛋白溶液濃度，一氧化二氮作為縫合促進劑，可保證所得到的網狀生物高聚物在膠原蛋白的整個體積範圍內的縫合均勻性。縫合均勻性及縫合可調整度能夠保持生物高聚物的延展性，使其機械強度和膨脹度增高兩倍，同時也使發酵穩定性增加。由於該生物高聚物中不存在有害摻雜物，而且又是膠原蛋白基質，因而就能保證它與人眼組織具有良好的生物相容性。
為提高網狀生物高聚物的質量，以避免其中形成空洞結構，建議在輻照前用離心方法對膠原蛋白溶液進行部分地除氣，轉速為3～40×103轉/分，時間持續10～30分鐘。
所提出的眼睛外傷時用來封閉角膜及鞏膜傷口用的植入物，根據本發明是以膠原蛋白為基質由網狀生物高聚物製做的。由於這種植入物的生物高聚物具有很高的膨脹度，同時又可調節，還有足夠的強度，故可以保證完全封閉眼睛外傷時的傷口，而不必採用會使眼睛受到損傷的工具。
為了解決前面提出來的任務，同時提出一種製取上述植入物的方法，它包括對牲畜眼睛鞏膜做鹼-鹽處理，把得到的生物組織用有機酸水溶液使之均質化，以形成膠原蛋白溶液，隨之從中除去低分子摻雜物。按照本發明，將清除過摻雜物的膠原蛋白溶液的濃度調整到0.2～1.3(質量)%，用一氧化二氮使其飽和，然後將其裝進模子裡並用劑量為0.5～15千戈瑞的電離輻射照射，將這種以膠原蛋白為基質的由網狀生物高聚物作成的當作植入物用的毛坯用水透析24～48小時，將其乾燥至網狀生物高聚物中的水氣含量為30～50(質量)%，爾後使毛坯具有植入物的形狀及規格，藉以在眼睛外傷時對角膜及鞏膜傷口完全封閉。
以上的方法保證了植入物中生物高聚物的特性參數能加以調節，同時也可保證植入物的形狀及規格，而這就是植入物使用時的必要條件。
為了優化植入物的性能參數，將膠原蛋白溶液放入模子以前，最好依次採用冷凍並在20～25℃溫度下化凍和離心(轉速為1～2×103轉/分，持續時間10～60分鐘)的方法將其進行部分地除氣。
為了便於將植入物放在眼睛的傷口處，最好使它具有圓柱形，尖端長為3～5毫米，底徑為0.5～4.0毫米。
以膠原蛋白為基質獲得網狀生物高聚物的方法，按照本發明是依以下方式實現的。
將農業牲畜的眼睛鞏膜進行鹼-鹽處理。把牲畜眼睛鞏膜仔細地除去眼睛內膜、剩餘的結膜和肌肉，將基質分出來並將其切成小塊。將生物組織的稱樣在蒸餾水中清洗，直至完全去除機械雜質和血液，再將其移入燒瓶並將10%的苛性鈉溶液注入飽和的硫酸鈉溶液中(按每10克生物組織500毫升計算)，在18～20℃下放置48小時。將溶液倒出並使生物組織中和到PH值為6.0～7.0，使其與2%的硼酸溶液混合，不斷更新溶液。用蒸餾水清洗生物組織，直到從清洗液中完全除去硫酸鈉離子。把所得到的生物組織放入有機酸(如醋酸、檸檬酸、抗壞血酸)的肌肉注射(IM)液中，使其均質化，估計量須使溶液中蛋白質的濃度為1(質量)%。攪拌上述物質並置入低溫冰箱1～3晝夜。使均質物質離心並低溫靜置若干晝夜。對所得到的膠原蛋白溶液進行過濾。為除去低分子摻雜物，需要把膠原蛋白的醋酸溶液用醋酸稀釋，直到蛋白質的濃度為0.7～0.8(質量)%，並在18～20℃溫度下針對磷酸或檸檬酸鹽緩衝劑進行透析，調整PH值到4.5～7.5。
把膠原蛋白溶液裝入燒杯並放進真空室中，以便除去隨後可成為輻照過程抑制劑的空氣中的氧，爾後進行離心。用化學純的一氧化二氮使所得到的膠原蛋白溶液飽和，而一氧化二氮就是不會氧化的膠原蛋白縫合促進劑。然後將此溶液調整到濃度不高於80(質量)%，而這便是極限濃度，因為接下去得到的網狀生物高聚物在膨脹之後會變得疏鬆。為了提高網狀生物高聚物的質量，即為了避免其中形成空洞以及使機械強度降低，建議採用離心的方法進行部分地除氣，轉速為3～40×103轉/分，持續時間10～30分鐘。在這種工作狀態下，能保障全部除去過量的一氧化二氮，以與膠原蛋白溶液的濃度相適應。在室溫下以0.5～15千戈瑞劑量的電離輻射輻照膠原蛋白溶液，直至形成網狀生物高聚物。當輻照劑量低於0.5千戈瑞時，得到的生物高聚物具有很低的機械強度及發酵穩定性;當輻照劑量超過15千戈瑞時，得到的生物高聚物將失去延展性而變得很脆。使所得到的網狀生物高聚物在蒸餾水中透析1～3晝夜，以便除掉醋酸。清洗用水的PH值應低於6.3。將清洗過的網狀生物高聚物放入蒸餾水，進行封閉及消毒。
按照本發明，由網狀生物高聚物製取眼外傷時封閉角膜及鞏膜傷口用的植入物的方法是按下述方式實現的。
如上所述，要對農業牲畜眼睛的鞏膜進行鹼-鹽處理，用有機酸水溶液使所得到的生物組織均質化，從所形成的膠原蛋白溶液中除去低分子摻雜物。將製得的膠原蛋白溶液稀釋或濃縮，從而調整濃度到0.2～1.3(質量)%，以便保證隨後構成植入物的生物高聚物具有最佳的機械強度和快速膨脹特性及良好的延展性。把膠原蛋白溶液移入燒杯，進行真空及離心處理，以便最大限度地除去空氣中的氧。將化學純的一氧化二氮於不斷攪拌中噴進所得到的溶液中，直到它對一氧化二氮完全飽和。為對膠原蛋白溶液進行部分地除氣，最好將它在冰箱中冷凍，再在20～25℃的室溫下緩慢解凍，之後再以1～2×103轉/分的速度離心作用10～60分鐘。在這樣一些條件下，可保障完全除掉在植入物的網狀生物高聚物結構中可能形成的空洞中的過量一氧化二氮。然後把膠原蛋白溶液裝入模子並用0.5～15千戈瑞的電離輻射照射。將所形成的以膠原蛋白為基質的網狀生物高聚物構成的毛坯在蒸餾水中透析24～48小時，使PH值達到6.5～7.0。再將所形成的毛坯乾燥，直到上述生物高聚物中的水氣含量為30～50(質量)%。這樣就能保證植入物用於封閉眼睛的傷口時，其膨脹度為7～10倍。將乾燥過的毛坯在液氮中迅速冷凍並冷凍乾燥48小時，然後使剛性毛坯具有植入物的形狀及規格，以便保證能完全封閉角膜及鞏膜傷口。最好使植入物具有圓柱形，尖端長為3～5毫米，底徑為0.5～4.0毫米。之所以選擇這種形狀，是為了保證把植入物送入眼睛手術切口時最方便;長度的選擇是為了外科醫生工作的方便;底徑的選擇是為了保持在將其固定到傷口時，傷口的邊緣與圓柱表面必要的接觸程度。
以下援引了實施本發明的一些具體實例。
例1將1公升含10%苛性鈉的飽和硫酸鈉溶液倒入數量為20克的由牲畜眼睛切下並清洗過的基質中，在18～20℃溫度下靜置48小時。將溶液倒出，用必要量的蒸餾水清洗生物組織，倒進2%的硼酸溶液1公升並攪拌2小時，更換硼酸溶液兩次。在不停地攪拌的情況下，在5公升體積的蒸餾水中仔細地清洗該生物組織，直到從清洗液中完全除掉硫酸鈉離子為止。把所得到的250毫升量含水的生物組織中添加350毫升0.5(重量)克分子濃度的醋酸，使之均質化。對其漿液進行攪拌並在4℃溫度下靜置若干晝夜。在2×103轉/分速度下將此均勻漿液離心30分鐘，並在4℃溫度下靜置3晝夜。讓所得到的膠原蛋白溶液通過玻璃過濾器過濾。此溶液中蛋白質濃度為1(質量)%。為了取出低分子摻雜物，要用0.5(重量)克分子濃度的醋酸溶液將此膠原蛋白的醋酸溶液稀釋到蛋白質濃度為0.8(質量)%，並在18～20℃的溫度下對0.2(重量)克分子濃度的檸檬酸鹽緩衝液透析到PH值為4.5。在室溫下使該膠原蛋白溶液抽取真空至出現氣泡，並在2×103轉/分的速度下離心30分鐘。然後將所得的溶液倒入燒杯，通過將化學純的一氧化二氮氣體(消耗量為5毫升/秒)向20毫升溶液中噴露20分鐘的辦法，使該溶液飽和。飽和之後通過離心方法(轉速為3×103轉/分)使膠原蛋白溶液部分地除氣。再重複一次飽和及離心作用過程。將膠原蛋白溶液冷凍乾燥到1(質量)%的濃度，並用1千戈瑞劑量的電離輻射進行輻照。把所獲得的膠原蛋白基質的網狀生物高聚物從燒杯中取出，並在蒸餾水中透析1晝夜，直至透出的水PH值為6.4止。再將網狀生物高聚物放在盛有蒸餾水的長頸小瓶中，並將其密封。把長頸小瓶放在-196℃的液氮中，並用劑量為30千戈瑞的γ射線照射。將長頸小瓶放入盛有80℃水的容器中6～7秒鐘，以使該網狀生物高聚物化凍。按照上述方法加工出來的網狀生物高聚物，其特點是無菌、具有良好的機械強度和發酵穩定性。
例2將按照例1所述經一氧化二氮飽和所得的膠原蛋白溶液濃縮。為此，往其中添加6克幹的膠原蛋白膜，按20毫升的0.8(質量)%的膠原蛋白溶液計算，並在氮氣氛中通過攪拌使其均質化，以便獲得30%的膠原蛋白溶液。再將此溶液在2×103轉/分的轉速下離心20分鐘，然後倒入燒杯，用10千戈瑞劑量的電離輻射進行照射。將得到的膠原蛋白基質的網狀生物高聚物放進盛有10%福馬林水溶液的杯中，置2小時。這可提高生物高聚物的憎水性。將上述生物高聚物在蒸餾水中透析2晝夜，直到透出水的PH值為6.7止。隨後，如例1所述將其消毒，例外的是γ-射線照射的劑量為15千戈瑞。所製得的膠原蛋白基質網狀生物高聚物是無菌的，具有良好的機械強度和發酵穩定性。
例3將按照例1所述經一氧化二氮飽和所得到的膠原蛋白溶液濃縮。為此，將浸入處於一氧化二氮氣氛中的Sefadex G-10中模子裡的膠原蛋白溶液進行乾燥處理。根據模子的一半裡面的膠原蛋白溶液的重量變化實現對乾燥處理的控制，它的出發點在於使溶液重量每減少百分之一就再補充一份進去。重複這種操作過程，直到整個模子都被80%的膠原蛋白溶液充滿。然後把裝有溶液的模子移到離心容器上進行離心;轉速為40×103轉/分。蓋住模子的第二半，並用15千戈瑞的γ-射線進行照射。將得到的膠原蛋白基質的網狀生物高聚物在蒸餾水中透析3晝夜，直到透出水的PH值為6.8止。對此生物高聚物進行消毒，是按照例1那樣實現的，例外的是對它的照射用的是30千戈瑞劑量的γ-射線。這樣加工出來的網狀生物高聚物是無菌的，具有很好的機械強度和發酵穩定性。
例4將1公升含10%苛性鈉的飽和硫酸鈉溶液倒入數量為20克的，由農業牲畜眼睛切下並清洗過的鞏膜基質中，在19～20℃溫度下靜置48小時。將溶液倒出，倒入1公升2%的硼酸溶液並攪拌2小時，更換硼酸溶液兩次。在不停攪拌的情況下，在5公升體積的蒸餾水中仔細地清洗該生物組織，直到從清洗液中完全除掉硫酸鈉離子為止。將所得到的250毫升量含水的生物組織中添加0.5(重量)克分子濃度的醋酸使之均質化，對其進行攪拌並在4℃溫度下靜置1晝夜。在2×103轉/分的轉速下將此均勻的漿液離心，並在4℃溫度下靜置3晝夜。讓所得到的膠原蛋白溶液經玻璃過濾器過濾，所含的膠原蛋白濃度為1(質量)%。將此溶液用0.5(重量)克分子濃度的醋酸稀釋到濃度為0.8(質量)%，並在18～20℃溫度下對0.5(重量)克分子濃度的檸檬酸鹽緩衝液透析到PH值為7.0。以四倍的0.25(重量)克分子濃度的醋酸將0.8(質量)%的膠原蛋白溶液稀釋到0.2(質量)%的濃度，在室溫下使膠原蛋白溶液抽真空至出現氣泡，並在1×103轉/分的轉速下離心60分鐘。用化學純的一氧化二氮使所得到的膠原蛋白溶液完全飽和，而為了除去不溶性氣體，要在1×103轉/分的轉速下離心60分鐘。通過把該溶液放入冰箱1晝夜使其冷凍，然後在室溫下化凍，再在1×103轉/分的轉速下離心。藉助超靜力學泵(перестатический насос)將所得到的膠原蛋白溶液送入直徑0.5毫米的毛細管，並在室溫下以15千戈瑞劑量的電離輻射進行照射。將所得到的圓柱形膠原蛋白基質的網狀生物高聚物在室溫下透析24小時，直到透出水的PH值為6.4止。然後將圓柱形毛坯掛在無塵的櫃櫥內，在室溫下使其乾燥到此生物高聚物的含水量為30(質量)%。使該毛坯在液氮中迅速地冷凍，並進行親液性脫水。乾燥處理7個小時。從所加工出來的毛坯中，用刀片切成帶有3毫米長尖端的圓柱體。把這裡得到的封閉角膜及鞏膜傷口用的植入物裝入密封的長頸小瓶，並用25千戈瑞劑量的γ-射線進行滅菌。這種植入物的網狀生物高聚物是無菌的，具有良好的機械強度和發酵穩定性，而且是光學透明的。
例5按例4所述製備0.8(質量)%的膠原蛋白溶液。隨後在12×103轉/分的轉速下將此膠原蛋白溶液離心30分鐘，並用一氧化二氮使其飽和，爾後再用2×103轉/分的轉速使其離心。為了對這個膠原蛋白溶液部分地除氣，將它放在冰箱中冷凍若干晝夜，並在室溫下化凍，然後在2×103轉/分的轉速下離心30分鐘。把所得到的溶液倒入直徑4毫米的圓柱形模子裡，並以5千戈瑞劑量的電離輻射進行照射。將此膠原蛋白基質的網狀生物高聚物毛坯放在蒸餾水中(透析)48小時，並且要換水，一直到透出水的PH值相應為6.8時為止。將毛坯以其一端懸掛在無塵的櫃櫥中，並在室溫下使其乾燥至生物高聚物中的水份含量為50(質量)%。將毛坯放在液氮中冷凍，並進行親液性脫水7個小時。由此毛坯中切出尖端長度為4毫米的圓柱體。把這樣得到的封閉角膜及鞏膜傷口用的植入物裝入密封的長頸小瓶，並用25千戈瑞劑量的γ-射線進行滅菌。最後得到的植入物的網狀生物高聚物是無菌的，具有良好的機械強度和發酵穩定性。
例6按照例4所述製備0.8(質量)%的膠原蛋白溶液。在AMICON過濾器XM50設備上實現該溶液的濃縮。根據該設備的容器裡的溶液高度的下降監控其濃縮。將得到的1.3(質量)%的膠原蛋白溶液抽真空至出現氣泡，再以2×103轉/分的轉速離心30分鐘。將此膠原蛋白溶液在冰箱中緩慢冷凍1晝夜並在室溫下化凍，再以2×103轉/分的轉速再離心30分鐘。把所形成的溶液倒入直徑2毫米的圓柱形模子裡，並以0.5千戈瑞劑量的電離輻射進行照射。將圓柱形毛坯模子裡得到的網狀生物高聚物在蒸餾水中透析48小時，直至透出的水PH值為6.8止。將毛坯以其一端懸掛在無塵的乾燥用櫃櫥裡，並在室溫下使其濃縮，達到生物高聚物中的水份含量為50(質量)%。將毛坯在液氮中冷凍，並進行8小時的親液性脫水。將毛坯切成帶有5毫米長尖端的圓柱形。將得到的封閉角膜及鞏膜傷口用的植入物裝入密封的長頸小瓶，並以30千戈瑞劑量的γ-射線進行滅菌。最後得到的植入物的生物高聚物是無菌的，具有良好的機械強度和發酵穩定性。
權利要求
1.一種在膠原蛋白基質上獲得眼科用網狀生物高聚物的方法，是通過對牲畜眼睛鞏膜進行鹼--鹽處理，再用有機酸水溶液使所得到的生物組織均質化，以形成膠原蛋白溶液，隨後從中取去低分子摻雜物，其特徵在於將清除過摻雜物的膠原蛋白溶液用一氧化二氮使之飽和，並將其濃度調整到80(質量)%以下，然後將所得到的膠原蛋白溶液用0.5～15千戈瑞的電離輻射進行照射，以形成網狀生物高聚物。
2.一種按照權利要求1所述的方法，其特徵在於對膠原蛋白溶液進行照射之前，要以3～40×103轉/分的轉速使其離心10～30分鐘，以便進行部分地除氣。
3.一種用於眼外傷時封閉角膜及鞏膜傷口的植入物，是由按權利要求1、2所述方法獲得的膠原蛋白基質的網狀生物高聚物製成的。
4.一種獲得權利要求3所述植入物的方法，包括對牲畜眼睛鞏膜進行鹼-鹽處理，以有機酸水溶液使所得到的生物組織均質化，以形成膠原蛋白溶液，隨後從中取去低分子摻雜物，其特徵在於將清除過摻雜物的膠原蛋白溶液濃度調整到0.2～1.3(質量)%，以一氧化二氮使其飽和，然後將其裝在模子裡用0.5～15千戈瑞劑量的電離輻射照射，將所形成的膠原蛋白基質網狀生物高聚物的植入物毛坯用水透析24～48小時，再將其乾燥至網狀生物高聚物中的水份含量為30～50(質量)%，最後再使毛坯具有植入物的形狀和規格，以保證眼外傷時能完全封閉角膜及鞏膜傷口。
5.一種如權利要求4所述的方法，其特徵在於將膠原蛋白溶液放入模子之前，要按順序使其冷凍、在20～25℃溫度下化凍和以1～2×103轉/分的轉速離心10～60分鐘，以對其進行部分地除氣。
6.一種如權利要求5所述的方法，其特徵在於該植入物具有圓柱形，尖端長3～5毫米，底徑為0.5～4.0毫米。
全文摘要
本發明屬於醫學領域。
文檔編號A61L27/36GK1048326SQ89106409
公開日1991年1月9日 申請日期1989年6月30日 優先權日1989年6月7日
發明者斯威阿託斯拉夫·尼可拉維奇·費道羅夫, 塞爾蓋·尼可拉維奇·巴格羅夫, 符拉狄斯拉夫·伊凡洛維奇·特洛費莫夫, 塔吉安娜·斯捷潘諾夫娜·安姆斯季斯拉夫斯卡婭, 亞歷克塞·瓦倫季諾維奇·奧西波夫 申請人:夢茲諾特拉斯列夫科技聯合體「眼科顯微技術」