生物礦化用天然多肽材料及其製備方法
2023-08-03 15:15:16
專利名稱：生物礦化用天然多肽材料及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物礦化用天然多肽材料及其製備方法，特別是涉及一種可用於礦化制 備具有良好生物相容性晶體結構的天然多肽材料，屬於生物醫用材料領域。
背景技術：
大多數蜘蛛和鱗翅目昆蟲如家蠶、柞蠶等都能夠產生大量的絲蛋白。這些絲蛋白除了可 以用於紡織原料外，還在醫藥、日用化工、航空航天等許多領域中得到了開發和利用。近年 來隨著分子生物學的快速發展，人們已經能夠通過基因改性的方法獲得高性能、高產量的天 然絲蛋白。這些研究成功為今後實現高效的液晶紡絲以及新型生物醫用材料的開發打下了基 礎。目前，對於生物礦化用多肽的研究取得了初步的進展，已經發現一些人工合成的短鏈多 肽和膠原可成為合成多級結構礦化材料的實用模型(Jeffrey D. Hartgerink等，2001， 294， p1684)，這些研究涉及到分子生物學和材料科學及醫學等多領域的科學知識。
蠶絲蛋白主要由絲素和絲膠構成。絲膠蛋白因較差的生物相容性及生物致敏性，而必需 去除掉。常採用低濃度鹼溶液(如碳酸鈉溶液、氫氧化納溶液等)進行水煮的方法將其與絲 素蛋白分離去除。由於蠶絲素蛋白同時具有優良的生物相容性、生物可降解性及易加工性， 使其己經廣泛應用在生物醫用材料領域中，如藥物釋放載體、人工皮膚、固定酶的載體、人 工骨組織及人工關節等，其中一些研究成果(如人工皮膚)已經進入臨床應用階段。在本發 明中所用的絲蛋白為脫絲膠後得到的昆蟲絲素蛋白或者蜘蛛絲蛋白。
傳統認為，ZnO微粒具有無毒和生物安全性而被用於日用化妝品、藥物載體以及醫用填 充材料(M. Ito， Biomaterials， 1991， 12， p41;以及D. Orstavik， J. K. Hongslo'. Biomaterials, 1985， 6， p129)。但是，已有的研究表明納米或微米ZnO顆粒對許多人體組織或器官具有毒 性。這些毒性是由於ZnO顆粒表面的生物不相容性成分引起的(Y. Osamu， International Journal of Inorganic Materials, 2001， 3,p643;以及P. K. Stoimenov, R. L. Klinger, Ci L. Marchin， K.丄Klabunde, Langmuir， 2002， 18， p6679)，從而限制了 ZnO微粒材料在臨床和日用化妝 品領域的應用。最近，人們採用人工多肽室溫礦化以及製備了納米ZnO複合顆粒。但由於這 種人工多肽製備工藝複雜、威本高，並且人工多肽鏈比較短而難以使得ZnO顆粒具有良好的 生物相容性。
本發明通過生物相容性優良的昆蟲絲素蛋白和蜘蛛絲蛋白的酸化降解而獲得的多肽產物 作為室溫下生物礦化的模板，以獲得生物相容性良好的多肽複合產物。
發明內容
本發明的目的是提出一種用於製備生物礦化晶體的多肽材料及其製備方法，用具有良好 生物相容性的天然絲多肽材料替代價格昂貴的人工合成的多肽材料，以降低生物礦化晶體的 製備成本，利於這些生物礦化晶體材料在生物醫學工程領域的應用。
本發明提出的用於製備生物礦化晶體的多肽材料，其特徵在於該材料中含有天然絲蛋 白的多肽分子，所述天然絲蛋白為脫膠絲蛋白或無膠絲蛋白。
在上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述材料中的絲蛋白來自昆蟲絲、蜘蛛絲。
在上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述昆蟲絲為家蠶絲、野蠶絲、柞蠶絲、天蠶絲、 蓖麻蠶絲、樟蠶絲、樗蠶絲、袋蛾絲、飛蛾絲。
在上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述蜘蛛絲為圓蛛絲、金蛛絲、狼蛛絲、虎蛛絲、 跳蛛絲、原蛛絲、中突蛛絲、長腳蛛絲。
,上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述絲蛋白為水溶性蛋白多肽。
'在上述礦化用天然絲蛋白多肽材料中，所述多肽材料能夠用於室溫礦化晶體，包括氧化 鋅，氧化鐵、氧化鎵、氧化鈷、氧化鈦、羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣。
本發明提出一種礦化用絲蛋白多肽的方法，其特徵在於所述方法依次包括下列步驟
(1) 把絲蛋白放入15。/。一15^的Na2C03溶液中，在燒杯中煮沸10—30分鐘，直到溶液 中有溶膠狀物質絲膠生成；當釆用蜘蛛絲蛋白製備多肽材料時，該步驟可以不操作。
(2) 將步驟(1)中脫膠後的絲素或未經過步驟(1)的蜘蛛絲用去離子水洗淨，加入濃 度為1 10摩爾/升的鹽酸，在80'C 130'C溫度下酸化水解反應5 36小時；
(3) 調節步驟(2)中水解溶液的pH值為7，再把這種水解後的多肽溶液置於透析袋內， 置於4。C冰箱內，每天換水一次到三次；
(4) 把步驟(3)中透析後獲得的透明溶液即是絲蛋白多肽材料，經過離心濃縮後在4'C 冰箱內放置備用。
本發明提出一種礦化用絲蛋白多肽的方法，其特徵在於所述步驟(2)中的鹽酸可以改
變為用0.1 1摩爾/升的NaOH溶液，在80'C下水解1 20小時。
本發明所製備的絲蛋白多肽材料能夠用於生物礦化複合材料的製備，並使得製備的複合 材料具有良好的生物相容性和生物活性。
具體實施例方式
下面結合3個實施例對本發明做進一步說明，但本發明的實施方案不限於此。 本發明中所用的絲蛋白可以為昆蟲絲或蜘蛛絲，昆蟲絲可以為家蠶、野蠶、柞蠶、天蠶、 蓖麻蠶、樟蠶、樗蠶、袋蛾、飛蛾昆蟲絲等，使用前要將昆蟲絲中的絲膠蛋白脫除，發明中優選家蠶絲。將脫膠的家蠶絲素蛋白溶於濃度為1 10摩爾/升的鹽酸中，在溫度80 120。C 下酸化水解5 36小時，然後將水解的蛋白多肽經過脫鹽、濃縮處理。本發明製備的礦化用 絲蛋白多肽即經酸化水解處理後的蛋白多肽材料。
本發明提出的礦化用絲蛋白多肽材料的製備方法主要包括下列步驟
(1) 把絲蛋白放入10。/o—25y。的Na2C03溶液中，在燒杯中煮沸10 30分鐘，直到溶液 中有溶膠狀物質絲膠生成；當採用蜘蛛絲蛋白製備多肽材料時，該步驟可以不操作。
(2) 將步驟(1)中脫膠後的絲素或未經過步驟(1)的蜘蛛絲用去離子水洗淨，加入濃 度為l摩爾/升 10摩爾/升的鹽酸，在80'C溫度下酸化水解反應5 24小時
(3) 調節步驟(2)中水解溶液的pH值為7，再把這種水解後的多肽溶液置於透析袋內， 置於4'C冰箱內，每天換水一次 三次；
(4) 把步驟(3)中透析後得到透明溶液即是礦化用絲蛋白多肽材料，經過離心濃縮後
放入4t:冰箱內備用。
實施例l
在調製好的濃度為2wt^的50ml脫膠家蠶絲蛋白溶液中，滴加50ml濃度為7摩爾/升的 鹽酸溶液後，倒入安瓿瓶中，抽真空後用氮氣保護並將瓶密封，放入80。C水中保溫8小時。 水解後的絲素蛋白多肽溶液被調節pH值至7，置入透析袋、在去離子水中透析一天。透析後 的絲素蛋白多肽溶液在5000 rpm離心15分鐘除去少量沉澱，取上清液即為礦化用絲蛋白多 肽材料，置於4。C冰箱中保存備用。所製備的絲素蛋白多肽溶液的濃度為0.1 0.2mg/mL。 實施例2
在調製好的濃度為3wtW的60ml脫膠家蠶絲蛋白溶液中，滴加60ml濃度為5摩爾/升的 鹽酸溶液後，倒入安瓿瓶中，抽真空後用氮氣保護並將瓶密封，放入90。C水中保溫6小時。 水解後的絲素蛋白多肽溶液被調節pH值至7，置入透析袋、在去離子水中透析兩天。透析後 的絲素蛋白多肽溶液在5000 rpm離心15分鐘除去少量沉澱，取上清液即為礦化用絲蛋白多 肽材料，置於4。C冰箱中保存備用。所製備的絲素蛋白多肽溶液的濃度為0.2^0.4mg/mL。 實施例3
1) 在調製好的濃度為3wt^的60ml狼蛛絲蛋白液中，滴加60ml濃度為6摩爾/升的鹽酸 溶液後，倒入安瓿瓶中，抽真空後用氮氣保護並將瓶密封，放入90。C水中保溫6小時。
2) 將上述體系溶液調節pH值至7，置入透析袋、在去離子水中兩天。透析後的溶液經 過除去少量沉澱，取上清液即為礦化用絲蛋白多肽材料，置於4。C冰箱中保存備用。所製備 的絲素蛋白多肽溶液的濃度為0.2~0.4 mg/mL。
權利要求
1、一種礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特徵在於這種材料中含有天然絲蛋白的多肽材料，所述天然絲蛋白為脫膠絲蛋白。
2、 根據權利要求l所述的礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特徵在於所述材料中的絲蛋白來自昆蟲絲、蜘蛛絲。
3、 根據權利要求2所述的礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特徵在於所述昆蟲絲為家蠶絲、野蠶絲、柞蠶絲、天蠶絲、蓖麻蠶絲、樟蠶絲、樗蠶絲、袋蛾絲、飛蛾絲。
4、 根據權利要求2所述的礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特徵在於所述蜘蛛絲為圓蛛絲、金蛛絲、狼蛛絲、虎蛛絲、跳蛛絲、原蛛絲、中突蛛絲、長腳蛛絲。
5、 根據權利要求1和2所述的礦化用天然絲蛋白多肽材料，其特徵在於所述天然絲蛋白多肽為水溶性蛋白多肽。
6、 根據權利要求1所述的礦化用天然絲蛋白材料，其特徵在於這種多肽材料能夠用於室溫礦化晶體，包括氧化鋅，氧化鐵、氧化鎵、氧化鈷、氧化鈦、羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣。
7、 一種製備如權利要求1所述的礦化用絲蛋白多肽的方法，其特徵在於所述方法依次包括下列步驟(1) 把絲蛋白放入10—25。/。的Na2CO3溶液中，在燒杯中煮沸10—30分鐘，直到溶液中有溶膠狀物質絲膠生成；當採用蜘蛛絲蛋白製備多肽材料時，該步驟可以不操作；(2) 將步驟(1)中脫膠後的絲素蛋白或未經過步驟(1)的蜘蛛絲用去離子水洗淨，加入濃度為1 10摩爾/升的鹽酸，在80 130'C溫度下酸化水解反應5—36小時；(3) 調節步驟(2)中水解溶液的pH值為7，再把這種水醉後的多肽溶液置於透析袋內，置於4'C冰箱內，每天換水一次 三次；(4) 把步驟(3)中透析後得的透明溶液即是絲蛋白多肽，經過離心濃縮後在fC冰箱內放置備用。
8、 根據權利要求7所述的礦化用絲蛋白多肽材料的製備方法，其特徵在於所述步驟(2)中的鹽酸可以改變為用0.1— l摩爾/升的NaOH溶液，在8(TC下水解l一5小時。
全文摘要
本發明涉及一種生物礦化用天然多肽材料及其製備方法，特別是涉及一種可用於礦化製備具有良好生物相容性晶體結構的天然多肽材料，屬於生物醫用材料領域。含有天然絲蛋白的多肽材料是來自昆蟲絲的脫膠絲蛋白和蜘蛛絲蛋白，這種多肽材料能夠用於室溫礦化的晶體包括氧化鋅，氧化鐵、氧化鎵、氧化鈷、氧化鈦、羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣。脫膠後的絲素蛋白溶液在水洗以及加酸水解後；再經過透析、離心濃縮後獲得礦化用天然多肽材料。它能夠用於礦化製備具有良好生物相容性的複合材料。
文檔編號A61L27/00GK101628126SQ200910060369
公開日2010年1月20日 申請日期2009年8月18日 優先權日2009年8月18日
發明者嚴丹紅, 姚亞東, 尹光福, 康雲清, 廖曉明, 黃忠兵 申請人:四川大學