耐熱性生物素結合蛋白的利用方法、以及結合有該蛋白的固體載體的製作方法

2023-08-04 02:15:36

專利名稱：：耐熱性生物素結合蛋白的利用方法、以及結合有該蛋白的固體載體的製作方法
技術領域：
：本發明涉及連接有耐熱性生物素結合蛋白的固體栽體。本發明還涉及本發明的固體載體的應用。本發明進一步涉及使用耐熱性生物素結合蛋白進行的與生物素連接的物質的純化、濃縮、檢測、捕捉等
技術領域：
。
背景技術：
：抗生物素蛋白與生物素、或者鏈黴菌抗生物素蛋白與生物素之間的親和性非常高(Kd40-"10-"M),就生物體二分子之間的相互作用而言，這是最強的相互作用之一。現在，抗生物素蛋白/鏈黴菌抗生物素蛋白-生物素相互作用廣泛應用於生物化學、分子生物學或者醫學領域(Green，(1975)，Adv.ProteinChem.,29:85-133;Green，(19卯)，MethodsEnzymol.,184:51-67),,抗生物素蛋白是來源於卵清的鹼性糖蛋白，其等電點大於10。抗生物素蛋白因其高鹼性、或者糖鏈的影響而出現與DNA等非特異性結合的問題，這是限制抗生物素蛋白應用的主要因素。另一方面，鏈黴菌抗生物素蛋白來源於放線菌(Streptomycesavidinii),其等電點在中性附近，並且沒有糖鏈,、這兩種蛋白均形成4聚體，1個亞基結合1分子生物素。分子量為60kDa左右。tamavidin(tamavidin1:序列號2)是作為顯示對稻痘病菌M.grisea的抗菌性的蛋白而被從食用蘑菇白黃側耳(p/ewrafz"cowwco//ae)中純化出來的第3種生物素結合蛋白，其基因結構也已經闡明(W002/072817)。此外，還從同一種蘑菇中鑑定出其同源物(tamavidin2:序列號4),而且重組蛋白的生產也已取得成功(WO02/072817)。tamavidin同源物可以通過大腸桿菌表達和使用亞胺基生物素柱的純化而容易地生產，這與抗生物素蛋白或鏈黴菌抗生物素蛋白的生產系統相比具有很大的優勢。當在大腸桿菌中表達抗生物素蛋白時，可溶性蛋白的收量少，為50嗎/50ml左右(Airenneetal.，1994，Gene,144:75-80)。因而，現在泉用J吏用杆狀病毒(Baculovirus)的昆蟲細月包系統(Airenneetal.,1997，Proteinexp.Purif.，9:100-108)。此外，當在大腸桿菌中表達鏈黴菌抗生物素蛋白時，重組蛋白形成不溶性的包涵體。將該包涵體溶解在高濃度鹽酸胍中之後，通過透析逐步除去鹽酸胍，從而使蛋白重摺疊，得到可溶性的有活性的重組鏈黴菌抗生物素蛋白(SanoandCantor,1990,Pro"Natl.Acad.Sci.USA,87:142-146)。這樣一來，抗生物素蛋白或鏈黴菌抗生物素蛋白的生產需要大量的勞力和時間。另一方面，當在大腸桿菌中表達tamavidin同源物時，每50ml的培養物可以獲得lmg的重組蛋白。就生物素結合蛋白的生產效率而言，這是一個很高的值，顯示了tamavidin同源物蛋白的潛在的有用性。目前為止，在試劑或診斷試劑領域，結合有抗生物素蛋白或鏈黴菌抗生物素蛋白的固體載體例如磁珠、微量板或傳感器晶片等已經被開發出來，但是，尚未報導非特異性結合低、且在高溫下具有穩定性的產品。專利文獻1:國際公開第WO02/072817號小冊子非專利文獻1:Green,1975,Adv.ProteinChem.,29:85-133非專利文獻2:Green,1990，MethodsEnzymol.，184:51-67非專利文獻3:Airenneetal.，1994,Gene，144:75-80非專利文獻4:Airenneetal.,1997，Proteinexp.Purif.，9:100-108非專利文獻5:SanoandCantor,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:142-14
發明內容本發明所要解決的問題本發明的目的在於提供連接有耐熱性生物素結合蛋白的固體載體。本發明的另一目的在於提供與生物素連接的物質的純化、濃縮、檢測、捕捉等方法，這些方法中使用了耐熱性生物素結合蛋白。這種情況下，提供本發明的固體載體的應用。此外，本發明的目的在於提供一種連接有生物素結合蛋白的固體栽體，該固體載體可用於存在暴露於70。C以上高溫的情況的測定系統。解決問題的方法"tamavidin"是來源於擔子菌白黃側耳的生物素結合蛋白，其包括tamavidin1以及tamavidin2這兩種(參照WO02/072817)。本發明人等經過深入研究，結果發現tamavidin2與現有的抗生物素蛋白、鏈黴菌抗生物素蛋白一樣對於生物素具有非常高的親和性。即，明確了tamavidin2與生物素之間具有強度為大多抗原抗體反應的約1000倍的親和性。此外，還證實了基本上不存在現有抗生物素蛋白中存在的非特異結合性(對DNA)的問題。而且，還發現tamavidin2的耐熱性比鏈黴菌抗生物素蛋白高iO。C以上，並且該性質在將tamavidin2結合在固體載體後仍可以保持。本發明人等進一步深入研究的結果發現tamavidin1強烈地與生物素結合，且其耐熱性比鏈黴菌抗生物素蛋白高5°C。通過這些研究結果，本發明人等發現可以提供即使在高溫條件下也能夠保持生物素結合活性的、連接有耐熱性生物素結合蛋白的固體載體，從而想到了本發明。因此，本發明提供連接有耐熱性生物素結合蛋白的固體載體及其應用，以及使用耐熱性生物素結合蛋白的、與生物素連接的物質的純化、濃縮、檢測和捕捉方法,，以下，對本發明進^於詳細的i兌明。連接有耐熱性生物素結合蛋白的固體載體本發明提供連接有耐熱性生物素結合蛋白的固體栽體。本說明書中，耐熱性生物素結合蛋白是指tamavidin1、tamavidin2或它們的變體。具體地，連接在本發明的固體載體上的耐熱性生物素結合蛋白可以是包含序列號2或序列號4的胺基酸序列的蛋白，或者可以是包含序列號1或序列號3的鹼基序列的核酸所編碼的蛋白。或者，連接在本發明的固體載體上的耐熱性生物素結合蛋白可以是包含序列號2或序列號4的胺基酸序列的蛋白的變體、或者是包含序列號1或序列號3的鹼基序列的核酸所編碼的蛋白的變體，並且該蛋白具有與tamavidinl或2等同的生物素結合活性和耐熱性。在本說明書中，tamavidin1、tamavidin2以及它們的變體統稱為tamavidin。tamavidin1或2的變體可以是包含在序列號2或4的胺基酸序列中包舍1個或多個胺基酸的缺失、取代、插入和/或添加的胺基酸序列的蛋白，並且具有與tamavidin1或2等同的生物素結合活性和耐熱性。取代可以是保守取代，即將特定的胺基酸殘基替換為具有相似物理化學特徵的殘基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基團的胺基酸殘基之間的取代(例如lie>Val、Leu或Ala間的相互取代)、極性殘基之間的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gin和Asn之間的相互取代)等。胺基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的變體可以通過對編碼野生型蛋白質的DNA實施例如作為公知技術的定點誘變(例如參見NucleicAcidResearch,VoUO,No.20,p.6487-6500,1982，通過引用將其全文引入到本說明書中)而產生。在本說明書中，"一個或多個胺基酸"是指通過定點誘變方法能夠缺失、取代、插入和/或添加的程度的胺基酸。此外，在本說明書中，"一個或多個胺基酸"根據情況指1個或數個胺基酸。就定點誘變方法而言，例如，除希望的變異即特定的不一致之外，還可以使用與要突變的單鏈噬菌體DNA互補的合成寡核苷酸引物按如下方式進行。即，使用上述合成寡核苷酸作為引物合成與噬菌體互補的鏈，用得到的雙鏈DNA轉化宿主細胞。將轉化後的細菌的培養物鋪在瓊脂上，由含噬菌體的單個細胞形成噬菌斑。這樣，理論上有50%的新菌落含有單鏈形式的具有突變的噬菌體，其餘的50%攜帶原序列。在合適的溫度下，使獲得的噬菌斑與通過激酶處理而標記的合成探針雜交，所述合適的溫度指該溫度下所述探針與和帶有目的突變的DNA完全一致的噬菌斑雜交，而不與攜帶原有鏈的噬菌斑雜交。然後，收集與該探針雜交的噬菌斑，進行培養，回收DNA。另外，在保持其活性的同時對生物活性肽的胺基酸序列施加一個或多個胺基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定點突變外，還有用誘變物處理基因的方法，以及選擇性地斷開基因，然後刪除、取代、插入或添加選定的核苦酸，再進行連接的方法。tamavidin1或2的變體還可以是包含與序列號2或4的胺基酸序列具有至少60%以上、優選65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、卯％以上、95%以上、98%以上或99%以上、更優選99.3%以上的胺基酸同一性的胺基酸序列的蛋白，並且該蛋白具有與tamavidinl或2等同的生物素結合活性和耐熱性。兩個胺基酸序列的同一性％可通過目測和數學計算來確定。或者兩個蛋白質序列的同一性百分比可以通過使用以Needleman，S.B.及Wunsch，C.D.(J.Mol.Bol.,48:443-453，1970)的算法為基礎的、可從威斯康星州大學遺傳學計算機組(UWGCG)獲得的GAP電腦程式進行序列信息比較來確定。GAP程序優選的默認參數包括(l)Henikoff,S.以及Henikoff，J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919，1992)所記載的得分/矩陣(x〕-ry>夕、、^卜U;y.夕x)、blosum62;(2)—個空位扣12分；(3)連續空位加扣4分；以及(4)末端空位不扣分。性百分比，例如Altschul等(Nucl.Acids.Res.,25，p.3389-3402,1997)中記載的可用BLAST程序對序列信息進行比較和確定。該程序可於網絡上在NantionalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)或DNADataBankofJapan(DDBJ)網站使用。在相同站點，對利用BLAST程序進行同一性檢索的各種條件(參數)進行了詳細記載，可對部分設定進行適當變更，但檢索通常使用默認值來進行。此外，兩個胺基酸序列的同一性％也可用遺傳信息處理軟體GENETYXVer.7(GENETYX制)等程序或FASTA算法等來確定。此時，也可用默認值;險索。兩個核酸序列的同一性。/。可通過目測和數學計算來確定，此外，該比較更優選使用電腦程式對序列信息進行比較。具有代表性的優選電腦程式為遺傳學計算機組(GCG;威斯康星州Madison)的成斯康星'軟體包、1.O版"GAP"程序(Devereux等，1984,Nucl.AcidsRes.,12:387)使用該"GAP"程序，不僅可對兩個核酸序列進行比較，還可比較兩個胺基酸序列，並可對核酸序列和胺基酸序列進行比較。此處，"GAP"程序的優選默認參數包括(l)實行關於核苷酸的(包括相同物質為1，不同物質為0的值)一元(unary)比較矩陣的GCG時，如Schwartz和Dayhoff主編的"多肽序列及結構圖譜(AtlasofPolypeptideSequenceandStructure)"(國立生物醫學研究財團，353-358頁,1979年)所記載的Gribskov及Burgess(Nucl.AcidsRes.，14:6745，1986)的加權胺基酸比對矩陣；或其它可比對的比對矩陣；(2)胺基酸的各空位罰分30，各空位中的各記號追加1罰分；此外，核苷酸序列的各空位罰分50，各空位中的各記號追加3罰分；(3)末端空位不罰分；以及(4)長空位沒有最大罰分。技術人員使用的其它序列比較程序中，可使用例如美國國立醫學圖書館的網站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html才是供的版本2.2.7的BLASTN程序、或UW-BLAST2.0算法。關於UW-BLAST2.0標準默認參數的設定，以下網站http:〃blast.wustl.edu中有記載。而且，BLAST算法使用BLOSUM62胺基酸得分矩陣，可使用的選擇參數如下(A)包含具有低組成複雜性的提問序列片斷(由Wootton及Federhen的SEG程序(ComputersandChemistry,1993)確定；參考Wootton及Federhen,1996"序列資料庫中組成偏移區域的分析(Analysisofcompositionallybiasedregionsinsequencedatabases)"MethodsEnzymol.,266:544-71),或用於掩蔽短周期性內部重複形成的片4爻(由Claverie及States(ComputersandChemistry,1993)的XNU程序確定)的濾器，以及(B)用於報告資料庫序列匹配的有統計學意義的閾值，或根據E-得分(Karlin和Altschul,1990)統計學模型得到的單純偶然發現匹配的期待機率；某種匹配引起的有統計學意義的差值大於E-得分閾值時，不能報告該匹配；優選的E-得分閾值的數值為0.5,此外按照優選度增大的順序依次為0.25、0.1、0.05、0.0、0.001、0.0001、le-5、le-lO、le隱15、le-20、le-25、le陽30、le-40、le-50、le-75、le-亂tamavidin1或2的變體還可以是由包含與序列號1或3的鹼基序列的互補鏈在嚴格條件下雜交的鹼基序列的核酸編碼的蛋白，並且該蛋白具有與tamavidin1或2等同的生物素結合活性和耐熱性。此處，所說的"嚴格條件下"是指在中度或高度的嚴格條件下進行雜交。具體來說，中度嚴格條件的具體例為根據DNA長度，掌握常規技術的該領域技術人員能夠容易地確定。基本條件如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，第6-7章，ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001所示，而且關於硝基纖維素濾膜，其可使用的情況包括5xSSC、0.5%SDS、l.OmMEDTA(pH8.0)的預洗滌溶液、約40-50°C的約50%的曱醯胺、2xSSC-6xSSC(或約42°C、約50%曱醯胺中的Stark's溶液等其它類似的雜交液)的雜交條件，以及例如在約40°C-60°C，0.5-6xSSC,0.1%SDS的洗滌條件下使用。優選中度嚴格條件包括約50°C，6xSSC的雜交條件(以及洗滌條件)。關於高度嚴格條件，例如根據DNA長度，本領域技術人員能夠容易地確定。通常，這樣的條件包括較中度嚴格條件更高溫度和/或更低鹽濃度的雜交(例如約65。C，6xSSC至0.2xSSC，優選6xSSC,更優選2xSSC，最優選0.2xSSC的雜交)和/或洗滌，例如可定義為上述雜交條件以及伴隨大約65°C-68°C、0.2xSSC、0.1%SDS的洗滌。關於雜交及洗滌的緩沖液，可以使用SSPE(lxSSPE為0.15MNaCl、10mMNaH2P04以及1.25mMED丁A，pH7.4)代替SSC(lxSSC為0.15MNaCl以及15mM檸檬酸鈉)，在雜交結束後15分鐘進4於洗滌。此外，也可使用探針中不使用放射性物質的市售雜交試劑盒。具體可以歹'J舉，使用ECLdirectlabeling&detectionsystem(Amersham公司制)的雜交等。嚴格雜交條件的例子為，向試劑盒的雜交緩沖液中加入5。/。(w/v)的封閉試劑，使NaCl達到0.5M,在42°C進行4小時雜交，關於洗滌，在0.4%SDS、0.5xSSC中，55。C條件下每次20分鐘，洗滌兩次，在2xSSC中，室溫條件下，每次5分鐘，洗滌一次。方法來測定。例如，可以像Kada等(Biochim.Biophys.Acta.，1427:44-48(1999))所描述的那樣，採用使用了螢光生物素的方法來測定。該方法是利用以下性質的測定系統在生物素結合蛋白的生物素結合位點上結合螢光生物素時，螢光生物素的螢光強度消失。或者，可以使用基於表面等離子體共振原理的生物傳感器等能夠測定蛋白與生物素間的結合的傳感器，來評價變體蛋白的生物素結合活性。耐熱性可以通過在評價上述生物素結合活性時，改變測定溫度進行測定來評價。與本發明的固體載體連接的耐熱性生物素結合蛋白對生物素具有高親和性，其解離常數Kd為10-SM數量級以下、優選0力M數量級以下、0""M數量級以下、10"'M數量級以下、10"M數量級以下、10"M數量級以下。代表性地，其解離常數Kd可以為1(T1310—9\1數量級。與公知的來源於卵清的抗生物素蛋白或鏈黴菌抗生物素蛋白相比，與熱性是指高溫下(高溫域)的蛋白穩定性和高溫下的生物素結合活性這兩者。高溫下的蛋白穩定性可以採用SDS-PAGE分析中蛋白條帶的顯色與室溫時相比有50%消失的溫度來進行評價。對連接於本發明的固體載體上的耐熱性生物素結合蛋白而言，SDS-PAGE分析中蛋白條帶的顯色與室溫狀態相比有50%消失的溫度可以是高於71°C、優選為75。C以上、77.5。C以上、8(TC以上、82.5。C以上、85。C以上、87。C以上。高溫下的生物素結合活性可以採用生物素的結合與室溫狀態相比減少50%的溫度來進行評價。就連接於本發明的固體載體上的耐熱性蛋白而言，生物素的結合與室溫狀態相比減少50%的溫度可以高於73°C、優選為75°C以上、78。C以上、8(TC以上、82.5。C以上、85T以上。連接於本發明的固體載體上的耐熱性生物素結合蛋白可以通過對擔子菌來源的蛋白進行純化而獲得，或者以重組蛋白的形式獲得。在本發明中，對連接耐熱性生物素結合蛋白的固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料(例如，可以通過過濾、沉澱、磁性分離等從反應混合物中分離的材料)的載體即可。構成固體載體的材料包括但不限於纖維素、特氟隆TM、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚酯、聚碳酸酯、聚醯胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化矽、玻璃、玻璃纖維、金、鉑、銀、銅、鐵、不鏽鋼、鐵氧體、矽晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳或它們的組合等。固體載體的形狀包括但不要限於珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜(-7..Y少夕一)、板、微量板(7<夕口7°1/—卜)、碳納米管、傳感器晶片等。正如本
技術領域：
公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設置凹坑、溝槽、濾膜底部等。在本發明的一個實施方式中，磁珠可以具有約25nm約1mm範圍的球體直徑。在優選的實施方式中，磁珠具有約50nm約10|im範圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。數種細菌孢子具有約l(im數量在本發明的一個實施方式中，由Sepharose等高交聯球形瓊脂糖製成的珠子具有約24pm約165pm範圍的直徑。在優選的實施方式中，高交聯球形瓊脂糖珠具有約24(im約44iim範圍的直徑。高交聯球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences,Warrington,PA或Spherotech，Libervi.lle,IL購買的製品等聚苯乙烯膠乳珠。二氧化矽(Si02)-處理或二氧化矽(Si02)基的固體載體的例子包括可從Polysciences，Warrington,PA購買的超常磁性二氧化矽珠等，其可以用於捕捉核酸(例如DNA)。或者，還可以使用可從DynalBiotech購買的M-280等。具有親水性表面的磁珠可用於捕捉增殖期的細菌細胞、核酸以及其它成分。作為該磁J朱的例子，可以列舉出Polysciences,Warrington,PA銷售的珠子(名稱Biomag(註冊商標)欺基)、或者BangsLaboratory,Inc.,Fishers,IN的名稱為MC02N/2928的珠子。或者，可以使用DynalBiotech銷售的M-270等。知的蛋白與固體載體的偶聯方法來進行。例如，對固體載體表面進行修飾，使得羧基露出來，然後是該羧基與蛋白的氨基在交聯試劑l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)的存在下進行偶聯反應，從而將蛋白與固體載體連接起來。或者，例如，通過在不含伯氨基的pH6.5~9的緩衝液中混合固體載體表面的羧基被N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活性酯化後的固體載體與蛋白，可以將固體載體表面的羧基與蛋白的氨基連接起來。或者，可以使用交聯試劑BS3(雙[硫代琥珀醯亞胺基]辛二酸鹽)或DSS(二琥珀醯亞胺基辛二酸鹽)將固體載體表面的氨基與蛋白的氨基連接起來，或者使用交聯試劑SPDP(N-琥珀醯亞胺基3-[2-吡啶基或GMBS(N-(4-馬來醯亞胺丁醯氧基)琥珀醯亞胺)將固體載體表面的氨基與蛋白的巰基連接起來。連接於本發明的固體載體上的耐熱性生物素結合蛋白保持高溫下的蛋白穩定性和生物素結合性。因此，與傳統上最常使用的鏈黴菌抗生物素蛋白相比，可以在更高的溫度下、在保持生物素結合能力的情況下對本發明的固體載體進行處理。本發明的固體載體即使在暴露於7(TC至9(rC、優選75。C至90。C、8(TC至90。C、85。C至90。C、70。C至85。C、7(TC至80。C、75。C至80。C、75。C至85。C、75。C至87.5。C的加熱條件下進行處理時，仍可以以保持生物素結合能力狀態使用。這意味著可以例如在更.高的溫度進行核酸雜合子形成或其後的洗滌，即可以以更高的嚴格度進行雜交。通過使用本發明的固體載體，可以構建能夠儘可能抑制非特異性雜合子形成的測定系統。或者，例如，可以在將tamavidin連接到固體載體上時，選擇必須進行高溫處理的方法。而且，當在tamavidin上結合耐熱性蛋白、酶或'螢光染料等時，或者在結合後與生物素修飾物進行反應時，可以採用高溫來進行更加特異性的反應。此外，連接於本發明的固體載體上的耐熱性生物素結合蛋白基本上沒有對DNA的非特異結合，因此能夠避免該
技術領域：
公知的來源於卵清的抗生物素蛋白中存在的DNA的非特異結合性的問題。使用了耐熱性生物素結合蛋白的、與生物素連接的物質的分離、濃縮、純化、檢測和/或捕捉方法
技術領域：
：本發明提供一種與生物素連接的物質的分離、濃縮、捕捉、純化、和/或檢測方法，所述方法包括以下步驟1)使與生物素連接的物質與本發明的連接有tamavidin的固體載體相接觸，並使與生物素連接的物質結合於該固體載體上；2)對未結合在該固體載體上的雜質進行洗滌；然後，3)通過回收與該固體載體結合的與生物素連接的物質，進行該物質的分離、濃縮、捕捉或純化，和/或進行該物質的4全測。在優選的實施方式中包括本發明的方法中的至少1個上述步驟在70。C至90。C的加熱條件下進行、更優選在75。C至卯。C、80。C至90°C、85。C至9CTC、70。C至85°C、70。C至80°C、75。C至80。C、75。C至85。C、75。C至87.5。C的加熱條件下進行。在本發明的方法中，與生物素連接的物質是指與生物素直接或間接連接的物質這兩者。生物素與物質的直接連接可以通過基於共價鍵的連接來鍵與生物素連接的配體，使物質通過共價鍵、離子鍵、氫鍵、或疏水相互作用與之連接。間接連接的具體例子可列舉在使用生物素化抗體時利用抗原抗體反應與抗原分子連接，在使用生物素化核酸探針時利用核酸的雜交與互補的核酸連接等。在優選的實施方式中，本發明的方法中的至少1個步驟在7(TC至卯。C的加熱條件下進行，因此，生物素與物質的間接連接優選在本發明的方法所使用的溫度條件下能夠保持連接。例如，當採用核酸的雜交作為生物素與物質的間接連接時，雜交的核苷酸的長度可以為至少20個核苷酸以上、優選至少25個核苷酸以上、30個核苷酸以上、35個核苷酸以上、40個核苷酸以上、50個核苷酸以上、IOO個核苷酸以上。構成本發明的方法中使用的連接有tamavidin的固體載體的材質及其形狀，可以根據需要分離、濃縮、純化、檢測和/或捕捉的物質的特性來進行選擇。此外，本發明方法的各步驟中採用的緩沖液組成、合適的溫度等，可以在考慮需要分離的物質的性質等的基礎上，由本領域技術人員適宜設定。採用本發明的方法分離、濃縮、捕捉、和/或純化得到的物質的檢測方法，可以根據該物質的性質由本領域技術人員適宜選擇。本發明的方法包括但不限於模仿下述方法的方法例如，核酸的檢測(日本特開2003-125800)，用於從樣品中分離核酸的裝置和方法(Bortolin等，WO2004/005553)，核酸擴增方法雜交信號擴增法(HSAM)(Zan等，WO1998/004745),或者病毒或病毒基因組的濃縮等(玉造，2004,BIOINDUSTRY,21(8):39-47)。或者，還可以用於細胞或微生物的檢測、捕捉、濃縮。例如，在濃縮體液中的病毒時，首先，在適當的緩沖液中將試樣與下述製品一起溫育，所述製品是對與病毒表層抗原特異性結合的抗體進行生物素化而得到的。抗體的生物素化可以使用例如Pierce等銷售的試劑盒來進行。然後，添加本發明的連接有tamavidin的固體載體例如磁珠，並進行混合。最後，使用磁鐵使病毒-抗體-生物素-tamavidin-磁珠的複合體聚集，除去上清，用適當的緩沖液洗滌數次，然後撤去磁鐵，懸浮於希望的緩沖液中，從而完成病毒的濃縮。或者，在濃縮體液中的病毒基因組DNA時，首先將試樣添加到破壞病毒粒子的適當溶液中，從病毒中提取出基因組DNA。然後，根據需要插入將該基因組單鏈化的步驟。然後，將其與下述製品一起進行溫育，從而使生物素化寡DNA與病毒基因組雜交，所述製品是對與病毒基因組的一部分互補的數十至數百鹼基的單鏈寡DNA進行生物素化而得到的，或者是對具有與病毒基因組的一部分互補的鏈的數十至數百鹼基的雙鏈DNA進行生物素化並熱變性而得到的。與使用傳統的連接有抗生物素蛋白或鏈黴菌抗生物素蛋白的固體載體的情況相比，當使用本發明的連接有tamavidin的固體載體時，可以採用高的溫度，例如70。C至90。C、優選75。C至卯。C、80°C至90。C、85。C至90。C、70。C至85。C、70。C至80。C、或75。C至80。C、75。C至85。C、75。C至87.5。C的溫度範圍。通過採用如上所述的高溫度作為雜交溫度，可以抑制非特異性DNA的結合，儘量不混入希望的病毒基因組以外的DNA,進行特異性更高的病毒基因組的濃縮。然後，將本發明的連接有tamavidin的固體載體例如磁珠添加到高溫狀態的樣品(生物素化寡DNA特異性捕捉病毒基因組的狀態)中，並進行混合。最後，使用磁鐵使病毒基因組-寡DNA-生物素-tamavidin-磁珠的複合體聚集，除去上清，用適當的緩沖液洗滌數次，然後撤去磁鐵，將其懸浮在希望的緩沖液中，從而完成病毒基因組的濃縮。此後，病毒基因組的4企測可以採用例如PCR,(Saikietal.(1985)Science230:1350-1354)等來進行。與傳統的抗生物素蛋白、鏈黴菌抗生物素蛋白相比，tamavidin在不存在生物素的情況下具有更高的耐熱性，而且基本上不存在對DNA的非特異性結合。因此，其適用於基於如上所述方法的DNA特異性濃縮。發明的效果與本發明的固體載體連接的tamavidin保持了高溫下的蛋白穩定性和生物素結合性。因此，與傳統上最常使用的鏈黴菌抗生物素蛋白相比，本發明的固體載體可以在更高的溫度下、在保持生物素結合能力的狀態下進行處理。通過使用本發明的固體載體，可以構建包含高溫下的處理的測定系統。〖圖1]圖1為照片(A)和圖表(B),其顯示了tamavidin2、鏈黴菌抗生物素蛋白以及抗生物素蛋白的針對DNA的非特異結合實驗的結果。圖2顯示了通過與鏈黴菌抗生物素蛋白進行比較來評價tamavidin2的耐熱性(蛋白穩定性)的結果。圖2A.顯示SDS-PAGE的結果，圖2B為顯示該蛋白條帶的定量結果的圖表。圖3為顯示tamavidin2(A)、鏈黴菌抗生物素蛋白(B)以及抗生物素蛋白(C)的耐熱性(螢光生物素結合活性)的圖表。圖4顯示tamavidin2磁珠(A)、市售的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠(B)、鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠(C)以及抗生物素蛋白磁珠(D)的耐熱性(螢光生物素結合活性)的圖表。圖5為顯示tamavidin2磁珠(A和C)、市售的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠(B和D)的耐熱性(螢光生物素結合活性)的圖表。圖6為顯示tamavidin2Sepharose珠的耐熱性(焚光生物素結合活性)的圖表。圖7為顯示tamavidin1的螢光生物素結合活性的圖表。實施例實施例1:tamavidin2(TM2)1-1.tamavidin2的表4正tamavidin2的大腸桿菌表達與純化將編碼tamavidin2(TM2)的DNA(序列號3)重組在表達載體pTrc99A上，並使之在大腸桿菌中表達，此時，表達的TM2基本上積累在可溶性級分中，且表達量大(WO02/072817)。採用Hofmann等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4666-4668,1980)的方法，使用填充有亞氨基生物素瓊脂糖(Sigma)的柱子，從重組大腸桿菌中純化出TM2蛋白。具體地，對於WO02/072817中記載的大腸桿菌，用lmMIPTG、在37。C誘導表達5小時，然後收集菌體，將沉澱懸浮在50mMCapspHl1.0,50mMNaCl中,超聲波破碎菌體將離心後的上清上樣(77°，.Y)在用50mMCapspHl1.0，50mMNaCl平衡的自製亞氨基生物素柱(高度3cm，體積0.5ml)上。用5mi的50mMCapspHl1.0,500mMNaCl進行洗滌後，用1.5-2ml的50mMNH4OAcpH4.0進行洗脫。純化蛋白的收量為從50mL的培養液中收穫約lmg。質譜分析將tamavidin2以10mg/ml的濃度溶解在0.1%TFA、50。/oMeCN飽和溶液中，對該樣品溶液使用ZipTipC4(Millipore)進行純化，直接上樣到MALDI板上。風乾後，添加一層基體溶液(芥子酸)。再風乾後，將其上樣於雷射離子化飛行時間型質譜分析裝置(MALDI-TOFMS)AXIMA-CFR(島津製作所)，進行質譜分析(引出電壓20kV,飛行模式Linear,檢測離子Positive),,其結果，觀察到m/z屍15146.3(相當於單體)、30335.0(相當於二聚體)、60932.0(相當於四聚體)。而且，對於生物素結合型的tamavidin2,相當於四聚體的峰變大。由該結果可以判斷tamavidin2為4聚體，其質量為60932。對蛋白的N末端序列進行了分析，判明翻譯起始的甲硫氨酸下遊的絲氨酸為N末端。使用遺傳信息處理軟體GENETYXVer.7(Genetechs公司製造)計算了tamavidin2的除起始曱硫氨酸之外的由140個胺基酸組成的多肽的等電點，結果為7.36。分子吸光係數tamavidin2的分子吸光係數的理論值為A280=41750M"cm"亞基(subunit)_1(0.25mg/mL時為0.68)。實際上，對tamavidin2進行純化，並在乙酸銨中進行了透析，對所得樣品進行冷凍乾燥(乙酸銨完全升華)，稱量其重量為3mg。將該樣品溶解於20m.MKPi(pH6.5)中，將其濃度調整為0.25mg/mL,測定A，，得到0.67的實測值。這相當於理論值的98%。由此，通過測定A28f)，可以簡便地測定tamavidin濃度。利用焚光生物素進行的活性測定利用螢光生物素的tamavidin2的生物素結合活性的測定按Kada等(Biochim.Biophys.Acta.，1427:44-48,(1999))的方法進行。進行調整使得200jiL測定緩衝液(50mMNaH2PO4、100mMNaCl、lmMEDTA(pH7.5))中在0pmol486pmo1範圍內梯度性地含有純化的TM2。在該溶液中混合20pmol/(iL螢光生物素溶液(biotin隱4-fluorescein:MolecularProbe)50fiL(lni加l)，室溫放置IO分鐘後，使用Las-3000(FUJIFILM)測定焚光強度。其結果，lnmol的螢光生物素與0.274nmo1的TM2結合。即，lmol的tamavidin上結合了3.6mol的螢光生物素。這表明1分子的tamavidin上結合4分子的焚光生物素(每個亞基1個分子)。同樣地，lmol鏈黴菌抗生物素蛋白結合了3.4mol螢光生物素。1-2.tamavidin2(TM2)的非特異結合性兔抗TM2抗體的純化將大腸桿菌表達的tamavidin2(TM2)蛋白用亞氨基生物素柱進行純化，將得到的產品、以及將其進一步進行凝膠純化而得到的產品用作抗原，製成兩種抗體。在使用石成性磷酸酶標記抗IgG抗體進行的Western方法中，對純化重組tamavidin2標準品的檢測靈壽文度為約0.5ng。由以上結果可以得出以下結論獲得了特異性和滴度均高的抗體。而且，抗tamavidin2抗體-tamavidin1的交叉反應能夠檢測到但水平很低(相當於原抗原的1/20左右)。對於抗TM2抗體(用僅進行了亞氨基生物素柱純化的抗原製作的抗體)，TM2進行分離，並將蛋白轉印到2張硝基纖維素膜(BIO-RAD)上。將膜在含3%BSA的TBS緩沖液中於室溫下振蕩1小時，以進行封閉。然後，在室溫下與抗TM2抗體(用僅進行了亞氨基生物素柱純化的抗原製作的抗體，稀釋1000倍)反應一夜，然後切取轉印有TM2的部位，在洗脫緩沖液(0.2M甘氨酸、1mMEDTApH2.8)中於室溫下振蕩20分鐘。用洗脫緩衝液的1/10容量的1MTris溶液進行中和後，加入等量的10xTBS緩衝液，在4。C保存。對DNA的非特異結合性tamavidin2(TM2)對DNA的非特異結合試驗分析TM2對DNA的非特異結合性。在2xSSC緩沖液中對1(Vg0.3(ig梯度稀釋的鮭魚精子DNA進行鹼變性，使用Bio-DotSF(BIO-RAD)使其吸附於HybondN+月莫(AmershamBiosceinces)上。用5xDenhardt，s液(0.1。/oBSA、0.1%聚蔗糖、0.1%聚乙烯基吡咯烷酮)對膜進行封閉後，在25嗎/mL的TM2、鏈黴菌抗生物素蛋白、以及抗生物素蛋白溶液中於室溫浸泡90分鐘。然後，將膜用TTBS緩衝液(含0.05%Tween20的TBS緩衝液)於室溫洗滌3次，每次5分鐘。用含0.5%脫脂牛乳、0.01%Tween20的TBS緩沖液對膜進行1小時的封閉。作為第1抗體，對於TM2使用採用前述方法純化的兔抗TM2抗體，對鏈黴菌抗生物素蛋白使用兔抗鏈黴菌抗生物素蛋白抗體(SIGMA),對抗生物素蛋白使用兔抗抗生物素蛋白抗體(Abcam),對它們進行稀釋使得抗體效價相等。與第1抗體的抗原抗體反應在室溫下進行1夜。將膜用TTBS緩沖液於室溫洗滌3次，每次5分鐘，然後，作為2次抗體，使用鹼性磷酸酶標記抗兔IgG抗體(BIO-RAD)(稀釋10000倍)，在室溫下反應1小時。將膜用TTBS緩衝液於室溫洗滌3次，每次5分鐘，然後，用AlkalinePhosphatasesubstratekitII、vectorBlack(船越)進4亍顯色，用Las-3000(FUJinLM)進行定量。其結果，抗生物素蛋白的染色強度DNA濃度依賴性地增加，而TM2、鏈黴菌抗生物素蛋白的染色強度未受DNA濃度的強烈影響(圖1A、B)。該結果表明tamavidin2基本上沒有對DNA的非特異活性，其與鏈黴菌抗生物素蛋白等同。這顯示了tamavidin2相對於抗生物素蛋白的優越性。1-3.tamavidin2與生物素之間的相互作用分析使用Biacore生物傳感器進行的tamavidin2(TM2)與生物素的相互作用的動力學分析將2mg高純度BSA(Sigma)和mgNHS-生物素(Pierce)溶解在lml的50n]M硼酸鈉pH8.0中，4。C溫育2小時。將NHS-生物素(E:Z-LinkNHS-LC-LC-Biotin)預先溶解在少量的DMSO中，然後進行添加。將其裝入透析管(MWCO6-8,000),在50mM碳酸鈉pH6.7中於4。C透析一夜。將這樣製作的生物素-BSA結合物(MW67kDa，3(VM)作為Biacoi'e(註冊商標)生物傳感器的配體(貼付在傳感器晶片的物質)。另一方面，製備重組tamavidin2作為分析物(流入流路系統的物質)，利用Biacore(註冊商標)3000(利用表面等離子體共振原理的生物傳感器，BiacoreInc.)進行了分子間相互作用的分析。將生物素-BSA、以及作為陰性對照的BSA採用胺偶聯法固定化在CM5傳感器晶片上。調節固定化量，使其為200RU左右。將固定化有BSA的晶片配置在流動池(flowcell)l和3中，將固體化有生物素-BSA的晶片配置在流動池2和4中。將tamavidin2加載在流動池1和2中，將鏈黴菌抗生物素蛋白加載在流動池3和4中，以流速20|iil/min加載2分鐘，加載到工作緩衝液[10mMHEPESpH7.4,150mMNaCl，3mMEDTA,0.005%Surfactantat20(BiacoreInc.)]中。然後，監測樣品的解離60分鐘。需要說明的是，發生結合的tamavidin2以及鏈黴菌抗生物素蛋白不可能解離，因此，在測定中不進行再生操作，而是從低濃度起進行7個梯度的測定(3.125、6.25、12.5、25、50、100、以及200nM)。以BSA的數據作為參照，從BSA-生物素的數據中將其減去。測定在25。C下進行。由所得傳感圖譜，使用分析軟體BIAevaluationver.4丄釆用1:1結合模型，進行反應速度論解析，計算出結合速度常數(ka)和解離速度常數(kd)。解離常數(Kd)由kd/k"求出。而且，在不進行再生操作時，Rnmx(分析物的最大結合量)隨各濃度測定的進行而減少，但在分析時，對Rmax進行局部擬合，並按濃度進行計算。此外，只採用能夠近似為l:1結合模型的分析物濃度的數據。利用Biacore(註冊商標)3000(利用表面等離子體共振原理的生物傳感器)如表1所示。[表1]表1tamavidin2與生物素之間的相互作用的動力學tableseeoriginaldocumentpage19所得tamavidin2的解離常數為10"M數量級，與我們此次測定的鏈黴菌抗生物素蛋白的解離常數在同一數量級。該結果表明，tamavidin2是繼抗生物素蛋白、鏈黴菌抗生物素蛋白之後的又一種對生物素具有非常高的親和性的蛋白。可以認為tamavidin2能夠應用於目前廣泛應用的抗生物素蛋白-生物素技術之中。1-4.tamavidin2的,耐熱l生通過與鏈黴菌抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的比較，分析了tamavidin2(TM:2)的耐熱性。蛋白的穩定性將每份10〖iL(2嗎)的0.2jig小LTM2、以及每份10pL(2嗎)的0.2|ag/pL鏈黴菌抗生物素蛋白於室溫下、50、60、70、80、90、99。C加熱20分鐘。然後，以15000卬m離心10分鐘，將上清中的可溶性蛋白懸浮在等量的2xSDS樣品緩衝液(100mMTris-HClpH6.8,12%2-兢基乙醇，2%SDS,20%甘油.)中，在95。C加熱10分鐘後，進行SDS-PAGE。蛋白條帶通過CBB染色進行檢測。使用Las-3000(FUJIFILM),以定量標誌(LMWELECTROPHORESISCALIBRATIONKIT;PharmaciaBiotech)為基準製作標準曲線，對蛋白條帶進行定量化。SDS-PAGE的結果示於圖2A，蛋白條帶的定量結果示於圖2B。50%的蛋白消失的溫度對鏈黴菌抗生物素蛋白而言為71°C，而對於tamavidin2而言為87°C。該結果表明tamavidin2的耐熱性比鏈黴菌抗生物素蛋白高15°C以上。此外，如果加入生物素，則tamavidin2的耐熱性變得極強，即使在95t:處理後，4聚體也不解離。生物素結合活性生物素結合蛋白的生物素結合位點上如果結合螢光生物素，則焚光生物素的螢光強度消失。利用該性質，將tamavidin2在高溫條件下的生物素結合能力與鏈黴菌抗生物素蛋白、抗生物素蛋白進行了比較。將約0.25嗎/一L的TM2和鏈黴菌抗生物素蛋白在室溫下、50、60、70、80、90。C加熱20分鐘後，製備在150jiL的測定緩衝液(50mMNaH2P04、1OOmMNaCl、1mMEDTA(pH7.5))中包含0fiL27pL梯度的經過加熱處理的TM2、或鏈黴菌抗生物素蛋白的溶液。在該溶液中混合50(iL(250pmol)的5pmol/|iL螢光生物素溶液(生物素-4-焚光素MolecularProbe),室溫下放置20分鐘後，使用Las-3000(FUJIFILM)測定螢光強度。生物素結合蛋白的耐熱性試驗如下進行。將約0.25jLig/jiL的生物素結合蛋白在室溫下、50、60、70、80、90。C加熱20分鐘後，製備在150(aL的測定緩衝液中包含0pL12nL梯度的經加熱的生物素結合蛋白的溶液。在該溶液中混合50[iL(100pmol)的2pmol/ML螢光生物素溶液，室溫放置20分鐘後，使用InfiniteM200(TECAN)測定螢光強度，其中Ex=460nm、Em:525隱結果示於圖3。該結果為與室溫相比，在70。C以下時TM2中與菱光生物素的結合未見變化，而在8(TC時保持了82%的活性。另一方面，鏈黴菌抗生物素蛋白與焚光生物素的結合活性在7(TC時減少了40%，在8(TC時減少了80%。此外，抗生物素蛋白與焚光生物素的結合活性在70。C時減少了10%,在80。C時減少了70%。當螢光強度的減少比例為減少至未加熱的樣品的50%時的溫度對TM2而言為85°C，而對鏈黴菌抗生物素蛋白而言為73°C，對抗生物素蛋白而言為78°C。1-5.tamavidi.n2固定化載體的耐熱性tamavidin2箱^朱的制4乍將300)jl表面包覆有羧基的磁珠(DynabeadsM-270CarboxylicAcid,Dynal公司)用0.01N氬氧化鈉300|il洗滌10分鐘後，再用300jil超純水洗滌3次，每次10分鐘。在洗滌完畢的磁珠上加入用冷超純水溶解的l-乙基—3-(3-二曱基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸(EDC)(PIERCE公司)使得最終濃度為0.2M,室溫下振蕩30分鐘。然後，先用300|il冷超純水，再用300(al的50mMMES緩衝液(pH5.0)洗滌磁珠，在其中混合300(^1(180昭)置換為50mMMES緩沖液(pH5.0)的0.6mg/miTM2。室溫下振蕩30分鐘，從而使TM2與磁珠以共價鍵結合。用箱玄鐵回收磁珠，除去上清。然後，用300(il的50mMTris緩衝液(pH7.0)除去珠子的未反應羧基後，用含0.5%BSA、0.1%Tween20的PBS緩衝液300(il封閉磁珠。用PBS緩沖液300^1懸浮磁珠，從而完成磁珠的製備。對於鏈黴菌抗生物素蛋白以及抗生物素蛋白同樣地製作^^朱。tamavidin2》茲J朱的力。熱f式-驗(i)耐熱性使用螢光生物素，將TM2磁珠的耐熱性與上述製作的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠以及抗生物素蛋白》茲珠、以及市售的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠(DynabeadsM-270Streptavidin、Dynal)進4亍比4交。將各》茲珠用PBS緩衝液洗滌後，在室溫下、70、75、80、85、90。C加熱20分鐘。製備在150pL的測定緩衝液中包含0pL16(xL梯度的經加熱的各磁珠的溶液。在該溶液中混合lpmol/nL生物素-4-焚光素溶液50jiL(50pmo1),室溫放置20分鐘後，使用InfiniteM200測定上清的焚光強度，其中Ex=460nm，Em=525nm。結果示於圖4。該結果為與室溫相比，在TM2磁珠中，與螢光生物素的結合在75。C以下時未見變化，在80。C為73%、在85。C為64%的活性。鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠在8(TC時有70%失活，市售的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠(Dynal)在80。C時有90%失活。此外，抗生物素蛋白磁珠在8(TC時有35%失活、在85t:時有55%失活。螢光強度的減少比例為減少到未加熱樣品的50%時的溫度對TM2而言為87°C,對鏈黴菌抗生物素蛋白而言為78°C，而對鏈黴菌抗生物素蛋白(Dynal)為72°C,對抗生物素蛋白而言為84。C。(ii)高溫下的生物素結合活性生物素結合蛋白的生物素結合位點上如果結合螢光生物素，則螢光生物素的螢光強度消失。利用該性質，將TM2磁珠在高溫條件下的生物素結合能力與市售的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠進行了比較。TM2磁珠通過在表面包覆有羧基的磁珠(DynabeadsM-270CarboxylicA.cid，Dynal公司)上共價結合TM2來製作。此外，市售的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠使用DynabeadsM-270Streptavidin(Dynal公司)。TM2磁珠為2x109珠/30mg/mL，每lmg磁珠結合333pmo1的焚光生物素。此外，市售的的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠為6.7xl8珠/10mg/mL，每lmg磁珠結合625pmo1的螢光生物素。將TM2磁珠、以及市售的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠300(iL用300fiL的PBS緩沖液洗滌2次，再將其懸浮在300pL的PBS緩衝液中。將各磁珠分注在7管中，每管42(iL。將50pL(50pmol)的lpmol/VL的螢光生物素溶液(生物素_4-螢光素MolecularProbe公司)分別添加在測定緩衝液(5OmMNaH2P04、100mMNaCl、lmMEDTA(pH7.5))150、149、148、146、142、140、134fiL中,在室溫、50、60、65、70、80、95。C下預溫育10分鐘,然後，再將兩磁珠在室溫、50、60、65、70、80、95。C下預溫育5分鐘，然後取l、2、4、8、10、16|aL添加到50pmo1螢光生物素溶液中，使得最終容積為200jiL,將它們在各溫度下繼續加熱20分鐘。這期間，用吸液管(匕。X、乂X一y夕、、)懸浮混合液3次。然後，迅速地用磁鐵回收磁珠，使用InfiniteM200(TECAN)測定上清的螢光強度，其中Ex=460nm、Em=525nm(實驗1)。在實驗2中，與實驗1同樣地，在室溫、70、75、80、85、90。C下進行分析。實驗:1.的結果如圖5A以及B所示，實驗2的結果如圖5C以及D所示。該結果為在TM2磁珠中，與室溫相比，與螢光生物素的結合在7(TC以下未見變化，而在8CTC、85。C時分別保持了75%、62%的活性(圖5A)。另一方面，在市售的的鏈黴菌抗生物素蛋白磁珠中，與螢光生物素的結合在80°C時消失了60%80%(圖5B)。螢光強度的減少比例為減少到未加熱樣品的500/。時的溫度對鏈黴菌抗生物素蛋白(Dynal)而言為77.5°C，而對tamavidin2而言為87.5。C。TM2Sepharose珠的製作將表面的羧基被用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活性酯化後的Sepharose珠(直徑34)im)HiTrapNHS陽activatedHP(GEHealth公司)lmL用10ml冷的lmM鹽酸洗滌後，再用lml.冷超純水進行洗滌。將Sepharose珠與預先在含0.5M氯化鈉的0.2M碳酸氫鈉緩沖液(pH8.3)中透析過的lml的lmg/ml的T'M2混合。在室溫下振蕩3小時，使得TM2與Sepharose珠結合。然後，用5ml的50mMTris緩沖液(pH8.0)除去未反應的活性基團後，用5ml含0.5%BSA、0.05%Tween20的PBS緩沖液封閉Sepharose珠。用lml的PBS緩衝液將Sepharose珠懸浮，從而完成了TM2S印harose珠的製作。TM2S印harose珠的加熱試-瞼使用螢光生物素，驗證了TM2Sepharose珠的耐熱性。將TM2Sepharose珠用PBS緩沖液洗滌後，在室溫、70、75、80、85、90。C下加熱20分鐘。製備在150(iL的測定緩衝液中包含0piL16pL的梯度的經過加熱的Sepharose珠的溶液。然後，混合50(il(150pmoi)的3pmols/Vl生物素-4-螢光素溶液，室溫放置20分鐘後，使用InfiniteM200測定上清的萸光強度，其中Ex=460nm、Em=525nm。該結果為與室溫相比，與螢光生物素的結合在80。C以下時未見變化，在85。C時為64%的活性。此外，焚光強度的減少比例為減少至未加熱樣品的50%時的溫度為86°C,顯示出與固定化有TM2的磁珠等同的耐熱性(圖6)。實施例2:tamavidin1(TM1)2-l.tamavidin1的表徵tamavidin.1的大腸桿菌表達與純化將編碼tamavidin1的DNA(序列號l)導入表達載體pTrc99A上，並使之在大腸桿菌中表達，此時，表達的tamavidinl蛋白基本上蓄積在可溶性級分中,其表達量多，為與tamavidin2相同的水平。因此，對於重組tamavidin1，進行了如下純化。誘導表達後收集菌體，將得到的大腸桿菌的沉澱懸浮在20mMKpipH7.0中，用超聲波破碎菌體。以15000rpm離心10分鐘後，將上清於7(TC處理l.O分鐘。熱處理後再進行離心分離操作，將其上清更換為50mMTris-HCIpH7.0、50mMNaCl。將該樣品上樣再用相同緩沖液平tf化的離子交換柱MonoQHR5/5(Phaemacia)上，回收直4妻通過柱的級分作為重組tamavidin1。蛋白的回收量為每5OmL培養液約1mg。質譜分析tamavidin1的質謙分析按照與實施例1相同的方式進行。其結果，觀察到m/zH5961.6(相當於單體)、31922.5(相當於二聚體)。單體的質量與tamavidin1經SDS-聚丙烯醯胺電泳後的分子量良好吻合。另一方面，在tamavidin1中添加過量的生物素，將溫育後的樣品的SDS-聚丙烯醯胺電泳圖像與實施了相同處理的tamavidin2的電泳圖像進行比較分析，提示tamavidin1為4聚體。使用遺傳信息處理軟體GENETYXVer.7(Genetechs公司制)對由全長143胺基酸組成的tamavidin1的等電點進行計算，結果為6.23。與生物素的結合性對上述70。C熱處理後的離心上清中的tamavidin1的螢光生物素結合活性進行測定。方法參照tamavidin2的情況。與螢光生物素的溫育在室溫進行。結果如圖7所示。可知tamavidin1即使在70。C處理後，仍與螢光生物素結合。2-2.tamavidin1的'耐熱寸生蛋白的穩定性將每組10nL(2pg)的0.2iig/(iL濃度的純化tamavidin1在室溫、50、60、70、80、90、99。C下加熱20分鐘。然後，以15000rpm離心0分鐘，將上清的可溶性蛋白懸浮在等量的2xSDS樣品緩沖液(100mMTris-HCIpH6.8，12%2-巰基乙醇，2%SDS，20%甘油)中，在95。C加熱IO分鐘後，進行SDS-PA.GE。蛋白條帶通過C.BB染色進行檢測。使用Las-3000(FUJIFILM)以定量標誌(LMWELECTROPHORESISCALIBRATIONKIT;PharmaciaBiotech)為基準製作標準曲線，對蛋白條帶進行定量化。其結果，tamavidin1的50%蛋白消失的溫度為76°C。該結果表明tamavidin1的耐熱性比上述的鏈黴菌抗生物素蛋白高5°C。此外，如果加入生物素，則tamavidin1的耐熱性變得極強，即使在95。C處理後，4聚體仍不解離。工業實用性連接於本發明的固體載體的tamavidin,在高溫下仍可保持蛋白穩定性以及生物素結合性，因此，本發明的固體載體可以用於包含高溫下的處理的測定系統。包含高溫下的處理的測定系統可以高特異性地進行物質的分離、濃縮、純化、檢測和/或捕捉，對一系列操作的快速化做出貢獻。此外，tamavidin的生產效率比來源於卵清的抗生物素蛋白或鏈黴菌抗生物素蛋白高，因此，與市售的連接有生物素結合蛋白的固體載體相比，本發明的固體載體在成本方面是有利的。權利要求1.一種固體載體，該固體載體上連接有選自下組的耐熱性生物素結合蛋白a)包含序列號2或序列號4的胺基酸序列的蛋白；b)包含在序列號2或序列號4的胺基酸序列中、發生1個或更多個胺基酸的缺失、取代、插入或添加而得到的胺基酸序列的蛋白；c)包含與序列號2或序列號4的胺基酸序列具有至少60％以上的序列同一性的胺基酸序列的蛋白；以及d)包含由在嚴格條件下與序列號1或3的鹼基序列的互補鏈雜交的核酸編碼的胺基酸序列的蛋白。2.根據權利要求1所述的固體載體，其經過70。C至90。C的加熱處理後，仍保持生物素結合能力。3.根據權利要求1所述的固體栽體，其在70。C至90。C的加熱條件下仍具有生物素結合能力。4.根據權利要求1至3中任一項所述的固體載體，該固體載體是主要以選自下組的材料構成的纖維素、特氟隆TM、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯醯胺、聚酯、聚碳酸酯、聚醯胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化矽、玻璃、玻璃纖維、金、4白、銀、銅、鐵、不鏽鋼、鐵氧體、矽晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白(白蛋白等)、碳以及它們的組合。5.根據權利要求1至3中任一項所述的固體載體，該固體載體選自珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜、板、微量板、碳納米管以及傳感器晶片。6.權利要求1至5中任一項所述的固體載體的應用，其中，暴露在70°C至90。C的加熱條件下使用。7.與生物素連接的物質的分離、濃縮、捕捉、純化和/或檢測方法，該方法包括以下步驟1)使權利要求1至6中任一項所述的固體載體和與生物素連接的物質相接觸，使與生物素連接的物質結合在該固體載體上；2)清洗未結合在該固體載體上的雜質；然後，3)通過回收結合在該固體載體上的與生物素連接的物質，來分離、濃縮、捕捉或純化該物質，和/或檢測該物質；並且，上述步驟中的至少1個是在70。C90。C的加熱條件下進行的。8.根據權利要求7所述的方法，其中加熱條件為75。C85。C。9.根據權利要求7所述的方法，其中，與生物素連接的物質是與生物素連接的核酸。全文摘要本發明涉及連接有耐熱性生物素結合蛋白的固體載體。本發明還涉及連接有耐熱性生物素結合蛋白的固體載體的應用。本發明進一步涉及使用耐熱性生物素結合蛋白進行的與生物素連接的物質的純化、濃縮、檢測、捕捉等
技術領域：
。用於本發明的固體載體的生物素結合蛋白具有耐熱性，因此，其對於伴隨有暴露於70℃以上的溫度下的情況的測定系統的應用是有用的。文檔編號C07K16/14GK101595132SQ20078004859公開日2009年12月2日申請日期2007年12月28日優先權日2006年12月28日發明者宇佐美悟,市川雅子,高倉由光申請人:日本菸草產業株式會社