灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感h5n1病毒上的應用的製作方法
2023-08-04 02:00:01 1
灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感h5n1病毒上的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用，其方法包括灰樹花發酵全液分離菌絲體或固體發酵後的菌絲體經過乙醇提取、過濾、減壓濃縮、除色素、除小分子化合物、除脂肪、醇析、離心分離、收集物乾燥、收集物粉碎等步驟。本發明的方法提取的灰樹花發酵菌絲體粗多糖對禽流感病毒具有明顯的抑制作用，該方法具有工藝簡便、成本低、效果好的特點。
【專利說明】灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用，尤其涉及灰樹花275菌株，已於2013年8月26日保藏在「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心」，保藏編號為CGMCC N0.8117，分類名稱為灰樹花Grifola frondosa，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
【背景技術】
[0002]關於灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用，經檢索到的相關專利有:中國專利申請號為99112556.8灰樹花發酵液多糖提取方法，02136517.2灰樹花發酵工藝及其多糖肽的生產方法，89105471 —種雲芝糖肽(PSP)的生產方法，92109345香菇多糖及香菇菌多糖提取工藝，96109095中國靈芝保健飲料，92111030靈芝營養保健液及其製法，93103116靈芝口服液等專利，這些專利內容大多以提取多糖為主要目的，灰樹花、雲芝和靈芝三種製備的活性物質提取物具有抗腫瘤、抗高血壓、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等藥效，但對於抗病毒作用鮮有報導，而對於禽流感H5N1病毒的報導更是沒有檢索到。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的問題是，針對上述灰樹花菌株以及其製備的粗多糖的藥理作用所存在的不足，提供灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用。利用本發明的方法提取的灰樹花275菌株粗多糖對禽流感H5N1病毒具有抑制作用，並且對正常細胞具有保護作用。
[0004]所述的灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用，其特徵是，所述灰樹花275菌株粗多糖由下述方法製得:
(1)加熱提取:取經液體發酵或固體發酵的灰樹花275發酵全液或菌絲體或澄清液放於容器內，加入純淨水調整其pH值為8~12，置60~120°C下加熱100~240分鐘，
(2)過濾:之後冷卻、以180~200目的篩網過濾灰樹花菌絲體，收集濾液,濾渣以其4~8倍體積的蒸餾水稀釋，重複上述操作I~2遍，再收集濾液；
(3)減壓濃縮:合併收集的濾液，在溫度50~70°C，壓力0.2~0.6Kg/cm2，真空度為
0.02~0.06Mpa的條件下進行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/10~1/20 ；
(4)除色素:取濃縮後的提取液，用氨水調pH至6.0~8.0，於30~45°C下攪拌，按每1Oml滴加Iml~2ml 10 %~30%的H2O2，進行脫色10~24h，得到淡黃色液體，
(5)除小分子化合物:然後利用透析袋，截留分子量3000~5000以上，4°C~10°C條件下透析24h~48h,去除多餘的H2O2、小分子化合物。
[0005](6)除脂肪:取上述提取液，裝入索氏提取器，按1:0.5~I的比例加入石油醚，加熱回流提取2~6h，待冷卻後，棄去石油醚層，回收餘下的提取液。
[0006](7)醇析:在回收的提取液中，加入量為其體積4~8倍的95%乙醇溶液並不斷攪拌，攪拌速度為30~60r/min，10~20分鐘後，靜置24~48小時進行醇析；
(8)離心分離:醇析後棄上清液，沉澱物移入離心管中，以轉速為3000~5000r/min離心20~30min，離心後棄去上清液，收集離心沉澱物；
(9)收集物乾燥:將上述收集的離心沉澱物，在50~70°C溫度條件下乾燥36~48小時；
(10)收集物粉碎:取上述烘乾的收集物，進行粉碎，經200目篩網過篩後即為灰樹花粗多糖。
[0007]其中，所述的灰樹花275發酵全液是指灰樹花275菌株發酵液與菌絲體的集合體。
[0008]步驟(I j所述的灰樹花275菌絲體是指灰樹花275菌株液體發酵和固體發酵所得的菌絲體所述灰樹花275菌株通過以下步驟進行發酵:
(O液體種子培養:採用500毫升三角瓶，每瓶裝200毫升液體培養基，將10%的灰樹花菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，調節PH為3-8，培養溫度為20-35°C，搖瓶轉速為80-280r/min，培養7_15天，即可得到灰樹花液體種子；
(2)發酵罐發酵:先將發酵罐中的培養基進行滅菌，滅菌壓力為0.1~0.2公斤/平方釐米，滅菌時間為1-2小時；當灰樹花液體種子pH值降至2.5-4時，將搖瓶中的灰樹花種子接種到發酵罐的培養液中，調整pH為5-8，培養溫度25-35°C，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌轉速100-250r/min,培養 7-30 天。
[0009]所述液體種子培養基或發酵培養基配方以克/100毫升計是:
地瓜澱粉I~3%葡萄糖I~5%
蛋白腖0.2~0.6%酵母膏0.2~0.5%
硫酸鎂0.1~0.3%磷酸二氫鉀 0.05~0.1%
(3)固體發酵
所述固體培養基配方以百分含量計是:
玉米芯63~83%，麩皮15~35%，葡萄糖1%，碳酸鈣1%
所述固體培養基製備方法:將灰樹花275菌株液體菌種接種至事先製備的固體培養基的菌包中，其含水量約為65%，12X30 cm、15X 30 cm或17X 30cm菌袋，每袋重150 g~1050 g，pH自然，培養溫度25°C~27°C、空氣相對溼度50%~70%、黑暗培養100 d~160d，定期檢察並移除汙染菌包，待菌包表面全部呈桔紅色後，開包取出菌絲體，粉碎後進行提取。
[0010]所述固體培養基還可以為穀物培養基，其配方是:(I)小麥98%，碳酸鈣1%，石灰1% ; (2)穀子98%，碳酸鈣1%，石灰1% ; (3)玉米98%，碳酸鈣1%，石灰1% ； (4)大麥98%，碳酸鈣1%，石灰1%。
[0011]所述穀物培養基的製備方法:先將穀物加水浸泡12小時加入石灰1%，煮沸後撈出，浙幹表面水分，拌入1%碳酸鈣後，裝瓶，封口，然後植入高壓鍋中進行高壓滅菌。121°c下保持2h，溫度降到30°C後，取出，冷卻後將灰樹花液體菌種接種至固體培養基的中，培養溫度25°C~27°C、空氣相對溼度50%~70%、黑暗培養160 d，檢察並移除汙染，待菌瓶表面全部長滿白色菌絲，取出菌絲體，進行提取。
[0012]採用本發明的抗禽流感病毒的灰樹花275菌株粗多糖，具有工藝簡便、成本低、產量高的特點。該方法採用灰樹花發酵菌絲體進行多糖提取，大大解決了灰樹花275菌株子實體匱乏，原料奇缺，子實體重金屬含量高的困境；解決了灰樹花275菌株子實體人工培養難度大、時間長的技術問題；降低了活性物質提取的原料成本和生產成本，提高了菌絲體的產量，提高了活性物質產率。
[0013]採用本發明的方法提取的灰樹花275菌株粗多糖，經青島農業大學藥用真菌研究所在中國動物衛生與流行病學中心外來病研究中心所作的體外抗禽流感病毒藥物篩選試驗，灰樹花275菌株粗多糖對禽流感H5N1病毒具有抑制作用，並且對正常細胞具有保護作用。
[0014]體外抗禽流感病毒藥物篩選試驗的具體方法如下:
1、實驗材料
1、細胞:MDCK細胞
2、病毒:禽流感病毒毒株為H5N1型
3、培養液:含10%胎牛血清的DMEM培養液
I1、實驗條件 生物安全三級實驗室
II1、實驗步驟
1、採用CPE法結合MTT法對MDCK細胞進行毒性的測定:在96孔板上，100 μ I/孔加A4X105ml-l濃度的MDCK細胞懸液，培養24 h後，在單層細胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重複3孔，並設正常細胞對照。置37°C，5% CO2培養箱中培養48 h後，棄培養液上清，100 μ I/孔加入5 mg.ml-lMTT的維持液，繼續培養Ih後，棄MTT上清液，每孔加DMSO溶解液100 μ 1，振蕩5-10 min,待結晶完全溶解，酶標儀測492nm處的OD值。當加樣組的OD492值不顯著`低於細胞對照組OD492時，此濃度即為樣品的最大安全濃度。計算出樣品的半數中毒濃度(CC5tl)及最大安全濃度。
[0015]2、粗多糖對H5N1禽流感病毒的藥效測定:採用所得到的最大安全濃度範圍內對樣品在MDCK細胞水平上進行對H5N1毒株的攻毒實驗。試驗中，設置正常細胞對照組，病毒對照組，質量濃度在無毒範圍內2倍稀釋4個質量濃度，設置3孔重複。棄96孔細胞培養板孔內上清，100μ I/孔加入10000TCID50病毒液(10-4.43)，設置3個重複。37°C吸附2h，棄病毒液上清，100 μ I/孔加入不同濃度的樣液。置37°C，5% CO2培養箱中繼續培養48h。採用MTT法測定0D492值，用統計學軟體SPSSl1.5的Probit回歸法，計算樣品的半數毒性濃度(CC5tl)和半數有效濃度(EC5tl)，得到樣品的選擇指數(SI)=CC5tl / EC5tl，計算病毒抑制率。
[0016]根據下公式計算病毒抑制率:
病毒抑制率=(A-B) / (C-B) X 100%
A:樣液處理組OD值，B:病毒對照組OD值，C:細胞對照組OD值
IV、實驗結果
1、病毒的 TCID5。為 10_4。
[0017]2、取灰樹花275菌株粗多糖5個濃度即100、50、25、12.5,6.25mg / ml進行細胞毒性測定，每濃度做10個復孔，同時設細胞對照。結果顯示最大無毒濃度為25 mg / ml。
[0018]3、取25、12.5、6.25,0.625 mg / ml藥液，做10個復孔，觀察對禽流感病毒的抑制作用。試驗設病毒對照和細胞對照。結果顯示灰樹花275粗多糖4個不同濃度藥物對禽流感病毒具有很好的抑制作用。[0019]結果顯示:在25mg/ml濃度下對H5N1毒株可達到最高的抑制率為36.8%，此時CC50 為 38.587mg/ml，SI 為 0.831
下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的說明。
[0020](四)【具體實施方式】 實施例1:
灰樹花275菌株粗多糖由下述方法製得:
1.發酵培養基配方:
地瓜澱粉I~3%葡萄糖I~5%
蛋白腖0.2~0.6%酵母膏0.2~0.5%
硫酸鎂0.1~0.3%磷酸二氫鉀 0.05~0.1%
2.發酵罐發酵:
將灰樹花275菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以25°C溫度，搖瓶轉速為110r/min，pH 7條件下，震動培養7天；培養中當pH值降到3時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度25°C，發酵罐壓力0.1公斤/平方釐米，pH 3，通氣量0.5-1.lvvm，攪拌速度100轉/分的條件，培養7天，即可利用發酵全液製備灰樹花275菌株粗多糖。
[0021]3.菌絲體粗多糖的提取:
取發酵全液10L，進行過濾，得到灰樹花275菌絲體100克，放於3000ml容器內，加入2000ml純淨水，調整其pH值為8，置100°C下加熱120min，之後冷卻、以200目的篩網過濾，收集濾液，濾渣以其8倍體積的純淨水稀釋，重複上述操作I遍，再收集濾液；合併收集的濾液，在50°C，壓力0.6Kg/cm2，真空度為0.06Mpa的條件下進行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/10 ；
取濃縮後的提取液，用氨水調pH至8.0，於30°C下攪拌，按每IOml滴加Iml 10 %的H202，進行脫色24h，得到淡黃色液體，然後利用透析袋，截留分子量5000以上，10°C條件下透析24h，去除多餘的H202、小分子化合物。取上述提取液，裝入索氏提取器，加入200ml石油醚加熱回流提取2h，待冷卻後，棄去石油醚層，回收餘下的提取液。在回收的提取液中，加入量為其體積4倍的95%乙醇溶液並不斷攪拌，攪拌速度為60r/min，20分鐘後，靜置24小時進行醇析；醇析後棄上清液，沉澱物移入離心管中，以轉速為5000r/min離心20min，離心後棄去上清液，收集離心沉澱物；在501:溫度條件下乾燥48小時後，進行粉碎，經200目篩網過篩後即為灰樹花粗多糖。
[0022]採用上述的灰樹花275菌株粗多糖，對MDCK細胞進行毒性的測定:
在96孔板上，100μ I/孔加入4X105ml-l濃度的MDCK細胞懸液，培養24 h後，在單層細胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重複3孔，並設正常細胞對照。置37°C，5%C02培養箱中培養48 h後，棄培養液上清，100 μ I/孔加入5 mg.ml-lMTT的維持液，繼續培養Ih後，棄MTT上清，每孔加溶解液(DMSO)IOOy `1，振蕩5_10 min，待結晶完全溶解，酶標儀測492nm處的OD值。計算出樣品的半數中毒濃度CC50為38.587mg/ml，最大安全濃度 EC50 為 25mg/ml。
[0023]採用所得到的最大安全濃度範圍內對樣品在MDCK細胞水平上進行對H5N1毒株的攻毒實驗。試驗中，設置正常細胞對照組，病毒對照組，質量濃度在無毒範圍內2倍稀釋4個質量濃度，設置3孔重複。棄96孔細胞培養板孔內上清，100 μ I/孔加入10000TCID50病毒液(10-4.43)，設置3個重複。37°C吸附2 h，棄病毒液上清，100 μ I/孔加入不同濃度的樣液。置37°C，5% C02培養箱中繼續培養48h。採用MTT法測定OD492值，用統計學軟體SPSS11.5的Probit回歸法，計算樣品的半數毒性濃度(CC50)和半數有效濃度(EC50)，得到樣品的選擇指數(SI)=CC50 / EC50，計算病毒抑制率。
[0024]實驗結果顯示:在12.5mg/ml濃度下對H5N1毒株可達到最高的抑制率為23.1%，此時 CC50 為 38.587mg/ml，SI 為 0.831
實施例2:
灰樹花275菌株粗多糖由下述方法製得:
穀物培養基一玉米培養基的製備方法:
先將玉米加水浸泡12小時，加入石灰1%，煮沸後撈出，浙幹表面水分，拌入1%碳酸鈣後，裝瓶，封口，然後置入高壓鍋中進行高壓滅菌。121°C下保持2h，溫度降到30°C後，取出，冷卻後將灰樹花液體菌種接種至玉米培養基中，培養溫度25°C、空氣相對溼度50%、黑暗培養160 d，檢察並移除汙染，待菌瓶表面全部長滿白色菌絲，取出菌絲體，進行提取。
[0025]取灰樹花275菌絲體100克，放於3000ml容器內，加入2000ml純淨水，調整其pH值為8，置100°C下加熱60min，之後冷卻、以200目的篩網過濾，收集濾液，濾渣以其10倍體積的純淨水稀釋，重複上述操作I遍，再收集濾液；合併收集的濾液，在50°C，壓力0.6Kg/cm2，真空度為0.06Mpa的條件下進行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/10 ；
取濃縮後的提取液，用氨水調pH至8.0，於30°C下攪拌，按每IOml滴加Iml 10 %的H2O2，進行脫色24h，得到`淡黃色液體，然後利用透析袋，截留分子量5000以上，10°C條件下透析24h，去除多餘的H2O2、小分子化合物。取上述提取液，裝入索氏提取器，加入200ml石油醚加熱回流提取2h，待冷卻後，棄去石油醚層，回收餘下的提取液。在回收的提取液中，加入量為其體積4倍的95%乙醇溶液並不斷攪拌，攪拌速度為60r/min，20分鐘後，靜置24小時進行醇析；
醇析後棄上清液，沉澱物移入離心管中，以轉速為5000r/min離心20min，離心後棄去上清液，收集離心沉澱物；在501:溫度條件下乾燥48小時後，進行粉碎，經200目篩網過篩後即為灰樹花粗多糖。
[0026]採用上述的灰樹花275菌株粗多糖對MDCK細胞進行毒性的測定，在96孔板上，100 μ I/孔加入AXlO5nIr1濃度的MDCK細胞懸液，培養24 h後，在單層細胞上分別加入不同濃度的含樣維持液，每種濃度重複3孔，並設正常細胞對照。置37°C，5%C02培養箱中培養48 h後，棄培養液上清，100 μ I/孔加入5 mg.Hir1MTT的維持液，繼續培養Ih後，棄MTT上清，每孔加DMSO液100 μ 1，振蕩5-10 min,待結晶完全溶解，酶標儀測492nm處的OD值。計算出樣品的半數中毒濃度CC5tl為34.026mg/ml,最大安全濃度EC5tl為25mg/ml。
[0027]採用所得到的最大安全濃度範圍內對樣品在MDCK細胞水平上進行H5N1毒株的攻毒實驗。試驗中，設置正常細胞對照組，病毒對照組，質量濃度在無毒範圍內2倍稀釋4個質量濃度，設置3孔重複。棄96孔細胞培養板孔內上清，loo μ I/孔加入1000tcid5q病毒液(10-4.43)，設置3個重複。37°C吸附2 h，棄病毒液上清，100 μ I/孔加入不同濃度的樣液。置37°C，5% CO2培養箱中繼續培養48h。採用MTT法測定0D492值，用統計學軟體SPSS11.5的Probit回歸法，計算樣品的半數毒性濃度(CC5tl)和半數有效濃度(EC5tl),得到樣品的選擇指數SI=CC5tl / EC5tl，計算病毒抑制率。
[0028] 實驗結果顯示 :在25mg/ml濃度下對H5N1毒株可達到最高的抑制率為36.8%，此時 CC5tl 為 38.587mg/ml，SI 為 0.831。
【權利要求】
1.灰樹花275菌株粗多糖在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵是，所述灰樹花275菌株粗多糖由下述方法製得: (1)加熱提取:取灰樹花275菌株液體發酵的發酵全液或菌絲體或澄清液，或者固體發酵的菌絲體放於容器內，加入純淨水調整其pH值為8~12，置60~120°C下加熱100~240分鐘； (2)過濾:之後冷卻、以180~200目的篩網過濾灰樹花菌絲體，收集濾液，濾渣以其4~8倍體積的蒸餾水稀釋，重複上述操作I~2遍，再收集濾液； (3)減壓濃縮:合併收集的濾液，在溫度50~70°C，壓力0.2~0.6Kg/cm2，真空度為.0.02~0.06Mpa的條件下進行減壓濃縮，使濾液濃縮至原有體積的1/10~1/20 ； (4)除色素:取濃縮後的提取液，用氨水調pH至6.0~8.0，於30~45°C下攪拌，按每1Oml滴加Iml~2ml 10 %~30%的H2O2，進行脫色10~24h，得到淡黃色液體； (5)除小分子化合物:然後利用透析袋，截留分子量3000~5000以上，4°C~10°C條件下透析24h~48h,去除多餘的H2O2、小分子化合物； (6)除脂肪:取上述提取液，裝入索氏提取器，按1:0.5~I的比例加入石油醚，加熱回流提取2~6h，待冷卻後，棄去石油醚層，回收餘下的提取液； (7)醇析:在回收的提取液中，加入量為其體積4~8倍的95%醇溶液並不斷攪拌，攪拌速度為30~60r/min，10~20分鐘後，靜置24~48小時進行醇析； (8)離心分離:醇析後棄上清液，沉澱物移入離心管中，以轉速為3000~5000r/min離心20~30min，離心後棄去上清液，收集離心沉澱物； (9)收集物乾燥:將上述收集的離心沉澱物，在50~70°C溫度條件下乾燥36~48小時； (10)收集物粉碎:取上述烘乾的收集物，進行粉碎，經200目篩網過篩後即為灰樹花粗多糖； 其中，所述的灰樹花275菌株發酵全液是指灰樹花275菌株發酵液與菌絲體的集合體。
2.如權利要求1所述的灰樹花275菌株粗多糖在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於所述灰樹花發酵全液經分離獲得灰樹花275菌株菌絲體。
3.如權利要求1或2所述的灰樹花275菌株粗多糖在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於，所述灰樹花275菌株粗多糖通過以下步驟獲得: (O液體種子培養:採用500毫升三角瓶，每瓶裝200毫升液體培養基，將10%的灰樹花菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，調節PH為3-8，培養溫度為20-35°C，搖瓶轉速為80-280r/min，培養7_15天，即可得到灰樹花液體種子； (2)發酵罐發酵:先將發酵罐中的培養基進行滅菌，滅菌壓力為0.1~0.2公斤/平方釐米，滅菌時間為1-2小時；當灰樹花液體種子pH值降至2.5-4時，將搖瓶中的灰樹花251菌株種子接種到50L發酵罐的培養基中，調整pH為5-8，培養溫度25-35°C，通氣量.0.5-1.lvvm，攪拌轉速100-250r/min，培養7_30天，即可獲得灰樹花275菌株發酵全液。
4.如權利要求3所述的灰樹花275菌株粗多糖在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於，灰樹花275菌株發酵培養基以克/100毫升計是:地瓜澱粉 1~3%，葡萄糖1~5%，蛋白腖0.2~0.6%，酵母膏0.2~0.5%，硫酸鎂0.1~0.3%，磷酸二氫鉀.0.05 ~0.1%。
5.如權利要求1所述的灰樹花275菌株粗多糖在製備抗禽流感H5N1病毒藥物上的應用，其特徵在於，灰樹花275菌株固體發酵的培養基 以百分含量計是:玉米芯63~83%，麩皮15~35%，葡萄糖1%，碳酸鈣1%; 所述固體培養基還可以為穀物培養基，其配方是:小麥98%，碳酸鈣1%，石灰1% ;或者穀子98%，碳酸鈣1%，石灰1% ;或者玉米98%，碳酸鈣1%，石灰1% ;或者大麥98%，碳酸鈣1%，石灰1% ； 所述穀物培養基的製備方法及菌絲體培養方法為:先將穀物加水浸泡12小時，加入石灰1%，煮沸後撈出，浙幹表面水分，拌入1%碳酸鈣後，裝瓶，封口，然後植入高壓鍋中進行高壓滅菌，121°C下保持2h，溫度降到30°C後，取出，冷卻後將樟芝液體菌種接種至固體培養基的中，培養溫度25°C~27°C、空氣相對溼度50%~70%、黑暗培養160 d，檢察並移除汙染，待菌瓶表面全部長滿白色菌絲，取出菌絲體，進行提取。
6.如權利要求1所述的灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用，其特徵是，所述灰樹花菌株名為灰樹花275菌株系山東省應用真菌重點實驗室選育。
7.如權利要求1所述的灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用，其特徵在於步驟(7)中所述醇溶液為甲醇或乙醇水溶液，濃度為60-95%。
8.如權利要求1所述的灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用，其特徵在於步驟(9)中所述乾燥使用真空乾燥，真空度0.02-0.06 Mpa，乾燥時間36-48小時。
9.如權利要求1所述的灰樹花275菌株粗多糖在抗禽流感H5N1病毒上的應用，其特徵在於步驟(10)中所述粗多糖粉碎時採用200目的中藥粉碎機對粗多糖進行粉碎過篩。
【文檔編號】A61P31/16GK103800360SQ201310401646
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】宋愛榮, 趙晨, 孔超, 楊松, 秦丹 申請人:青島農業大學