人類乳頭瘤病毒檢測用引物、探針及使用它的人類乳頭瘤病毒的檢測方法
2023-08-04 01:38:46 2
專利名稱：人類乳頭瘤病毒檢測用引物、探針及使用它的人類乳頭瘤病毒的檢測方法
技術領域：
本發明涉及人類乳頭瘤病毒檢測用引物、探針及使用它的人類乳頭瘤病毒的檢測方法。
背景技術：
人類乳頭瘤病毒(Human Papilloma virus,HPV)是乳多空病毒科(Papovaviridae family)所屬環狀雙螺旋DNA病毒，能夠感染人類及哺乳動物的上皮樣細胞，與如疣的引起各種惡性腫瘤的症狀密切相關，已知是宮頸癌的重要病因因子。迄今為止已知的100餘種HPV中，在生殖器官中發現了 40餘種，確認了其中的高危群HPV-16及HPV-18的發展速度比其它的HPV類型快約40%左右，並且其重要性佔全部宮頸癌中發現的 HPV 的約 70%左右。另外，HPV-26、HPV-30、HPV-31、HPV-33、HPV-35, HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-53、HPV-56、HPV-58、HPV-59、HPV-61、HPV-66、HPV-67、 HPV-68、HPV-69、HPV-70、HPV-73等因其發展成為宮頸癌的機率相對較高而被分類為「高危群(high risk group) 」，HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-6, HPV-7、HPV-10, HPV-IU HPV-13, HPV-32、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-43、HPV-44、HPV-54、HPV-55、HPV-57、HPV-72、HPV-81 等被分類為「低危群(low risk group)」。另一方面，在全部黏膜皮膚HPV感染中最常見的感染原因是並非與宮頸癌相關的高危群HPV的低危群HPV(HPV-l、HPV-2、HPV-3、HPV-4)，該低危群HPV通常引起黏膜和皮膚的疣病變。疣作為HPV感染皮膚或黏膜產生的非常常見的病毒感染性疾病的一種，引起表皮過度增殖，表現為表面凹凸不平的丘疹。在任何部位的皮膚上均有可能發生，但主要發生在暴露部位的手、足、腿、臉等，也可以通過性接觸發生在性器官。通常情況下，疣根據臨床類型可分為尋常疣、扁平疣、蹠疣及尖銳溼疣。其中尖銳溼疣與宮頸癌相關，對它的研究比較活躍，最近能夠預防它的疫苗已實現商業化。然而如尋常疣的常見皮膚疾病由於與致死無關，因此在此期間未受到醫生或科學家的關注，事實上與它相關的基礎研究幾乎成為空白。HPV感染的診斷方法大致可分為細胞學方法和分子生物學方法。判斷HPV感染細胞的形態變化的細胞學方法有巴氏塗片檢查法(Papanicolaou (Pap) Smear)，但其診斷的客觀性低，而且具有較高的假陰性率(15 45% )，因此存在著不具有一貫準確性的問題。另一方面，分子生物學方法利用病毒的DNA檢測HPV的存在及基因型，大致可分為直接鑑定HPV DNA的方法和利用PCR擴增實施鑑定的方法。該方法能夠客觀地檢測出HPV DNA,診斷準確性顯著，在利用細胞學方法不能明確診斷的情況下，具有能夠在初期診斷出疾病的優點。為了直接確認HPV DNA,傳統上使用利用HPV類型特異性的探針的如Southern 印跡雜交(southern blotting)、斑點印跡法(dot blotting)及 FISH (Filter in situhybridization)的方法，儘管受到FDA認可的二代雜交捕獲法(Hybrid capture II)得到廣泛使用，但因需要大量的HPV DNA，在HPV初期感染或樣品採集稀少的情況下表現出檢測限制，並且使用RNA探針因而安全性低，不僅如此還存在著設備比較昂貴、靈敏度降低的問題。相反地，PCR技術作為能夠利用與目標病原體的核酸鹼基序列特異性結合的互補寡核苷酸(引物)對微量的病原體核酸進行擴增，檢測其是否存在的技術，是多種類型的 HPV感染與否的診斷中使用的代表性技術中的一種。上述PCR技術可實現客觀的大規模檢測，與上述細胞學方法及HPV DNA直接檢測法相比，在準確性、易用性及費用方面受到了具有相對優勢的評價。到目前為止，基於PCR的HPV檢測法中使用的引物，已開發出與HPV類型無關地使其DNA擴增的通用引物，或是與各種類型特異性結合而僅使型特異性HPV DNA選擇性擴增的型特異性引物。然而上述傳統技術在與迄今為止揭示的多種HPV類型進行比較時，僅能夠診斷出極其有限的類型的HPV，並且存在著基於HPV類型的檢測的靈敏度大幅降低等問題，在實際臨床使用上受到較大的限制。尤其是即使藉助使用通用引物的PCR反應得到了擴增產物， 也難以準確地確認新鑑定分類的HPV類型是高危群還是低危群，在使用型特異性引物的情況下，為了確認樣品內是否存在HPV，存在著需要同時使用各種不同引物的麻煩，在臨床上廣泛使用方面受到限制。因此為了提高基於是否使用PCR進行HPV DNA擴增的疾病診斷的實際使用效率， 急需開發出能夠選擇性地對HPV類型進行擴增，從而能夠在初期診斷出是否感染HPV，並一次簡便地診斷出HPV引起的疾病的引物。
發明內容
要解決的技術問題為此，本發明的發明者發現了用於特異性檢測出黏膜皮膚疣的產生原因即6種亞型的人類乳頭瘤病毒的新型PCR引物對，並利用它開發出按不同類型特異性地快速檢測出人類乳頭瘤病毒的方法，並完成本發明。因此本發明的目的在於，提供一種能夠有效檢測出人類乳頭瘤病毒的人類乳頭瘤病毒檢測用引物及探針。本發明的另一目的在於，提供一種人類乳頭瘤病毒檢測用微陣列，其特徵在於將所述的探針集成在基質上。本發明的又一目的在於，提供一種使用所述的引物或探針的檢測人類乳頭瘤病毒的方法。此外，本發明的又另一目的在於，提供一種包含所述的引物或探針的人類乳頭瘤病毒檢測用試劑盒。技術方案為實現如上所述的本發明的目的，本發明提供了包含由序列編號1及2的鹼基序列組成的第1引物對、由序列編號3及4的鹼基序列組成的第2引物對、由序列編號5及6 的鹼基序列組成的第3引物對、由序列編號7及8的鹼基序列組成的第4引物對、由序列編號9及10的鹼基序列組成的第5引物對、及由序列編號11及12的鹼基序列組成的第6引物對組成的群中所選的一種以上引物對的人類乳頭瘤病毒檢測用引物。另外，本發明提供了包含由序列編號1及2的鹼基序列組成的第1引物對、由序列編號3及4的鹼基序列組成的第2引物對、由序列編號5及6的鹼基序列組成的第3弓丨物對、由序列編號7及8的鹼基序列組成的第4引物對、由序列編號9及10的鹼基序列組成的第5引物對、及由序列編號11及12的鹼基序列組成的第6引物對組成的群中所選的一種以上引物對的人類乳頭瘤病毒檢測用探針。本發明的一實施例中，人類乳頭瘤病毒檢測用引物的特徵在於，所述的第1引物對是HPV-IDNA的擴增引物，所述的第2引物對是HPV-2DNA的擴增引物，所述的第3引物對是HPV-3DNA的擴增引物，所述的第4引物對是HPV-4DNA的擴增引物，所述的第5引物對是 HPV-27DNA的擴增引物，所述的第6引物對是HPV-57DNA的擴增引物。另外，本發明提供了包括固定在基質上的所述的引物或探針的人類乳頭瘤病毒檢測用微陣列。另外，本發明提供了包含所述的引物或探針的人類乳頭瘤病毒檢測用試劑盒。另外，本發明提供了人類乳頭瘤病毒的檢測方法，該方法中包括了以使用所述的人類乳頭瘤病毒檢測用引物的聚合酶鏈式反應探測人類乳頭瘤病毒的步驟。本發明的一實施例中，所述的人類乳頭瘤病毒可以選自HPV-1、HPV-2、HPV_3、 HPV-4、HPV-27 及 HPV-57 組成的群。有益效果依照本發明的人類乳頭瘤病毒檢測用引物或探針及使用它的人類乳頭瘤病毒的檢測方法，具有能夠快速準確地掌握成為皮膚黏膜疣的原因的6種亞型(HPV-l、HPV-2、 HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57)的人類乳頭瘤病毒的存在與否及類型的效果，能夠減少檢測感染在疣中的人類乳頭瘤病毒所花費的時間和費用，有效地進行診斷。
圖1所示為本發明的一實施例中的代表具有6種亞型的標準品HPV DNA各亞型的擴增用引物對實施多重聚合酶鏈式反應的結果的照片。其中，列M代表尺寸標記物(size marker)，列1代表HPV-I，列2代表HPV-2，列3代表HPV-3，列4代表HPV-4，列5代表 HPV-27,列 6 代表 HPV-57。圖2所示為本發明的另一實施例中的代表以6種亞型的標準品HPV DNA的混合物為模板利用6種引物摻雜形成的引物試劑盒實施多重聚合酶鏈式反應的結果的照片。其中，列 M 代表尺寸標記物(size marker)，列 1 代表 HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、 HPV-57的混合液。圖3所示為本發明的又一實施例中的代表利用6種引物摻雜形成的引物試劑盒以各個標準品HPV亞型DNA為單一模板實施多重聚合酶鏈式反應的結果的照片。其中，列M 代表尺寸標記物(size marker)，列1代表HPV-1、列2代表HPV-2、列3代表HPV-3、列4代表HPV-4、列5代表HPV-27、列6代表HPV-57的混合液。圖4所示為本發明的又另一實施例中的代表反應結束的PCR產物在1. 8%瓊脂糖凝膠上利用電泳展開後以DNA的尺寸確認HPV的存在及亞型的結果的照片。其中，列M代表 IOObp Ladder 的尺寸標記物(size marker)。
具體實施例方式本發明的發明者設計出能夠特異性檢測出成為皮膚黏膜疣的原因的人類乳頭瘤病毒的引物及探針，開發出使用所述的引物或探針的人類乳頭瘤病毒的檢測方法及包含所述的引物或探針的人類乳頭瘤病毒檢測用試劑盒及微陣列。因此，本發明的特徵在於，提供了能夠檢測出人類乳頭瘤病毒中6種亞型的人類乳頭瘤病毒的引物，具體地說，提供了包含由序列編號1及2的鹼基序列組成的第1引物對、由序列編號3及4的鹼基序列組成的第2引物對、由序列編號5及6的鹼基序列組成的第3引物對、由序列編號7及8的鹼基序列組成的第4引物對、由序列編號9及10的鹼基序列組成的第5引物對、及由序列編號11及12的鹼基序列組成的第6引物對組成的群中所選的一種以上引物對的人類乳頭瘤病毒檢測用引物。本發明中，人類乳頭瘤病毒是發生皮膚黏膜疣的原因因子，以HPV-1、HPV_2、 HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57亞型的人類乳頭瘤病毒為佳。依照本發明的所述的人類乳頭瘤病毒檢測用引物是指能夠與人類乳頭瘤病毒的基因互補雜交的引物，優選地，可以是能夠擴增所述的人類乳頭瘤病毒的特異性基因的引物、引物對或引物試劑盒。本發明中，術語「引物」意指能夠以帶有短游離3'-末端羥基(free 3' hydroxyl group)的核酸序列與互補模板(template)形成鹼基對，並且起到模板分段複製用起點的作用的短核酸序列。即，引物是指能夠在合適的緩衝液中在合適的條件(例如，四種不同的三磷酸核苷及如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶的聚合劑)及合適的溫度下，開始模板指示DNA合成的單鏈寡核苷酸。另外，本發明的引物可以使用固相亞磷醯胺三酯法，或其它公知的方法通過化學方式合成。另外，上述引物在不對人類乳頭瘤病毒的特異性檢測產生影響的範圍內，可以利用相應領域公知的多種方式進行變型(例如添加，缺失，置換)，儘管無需與模板完全互補，但也需要以能夠與模板雜交的程度充分互補。上述變型的非限定性例子，如甲基化， 加帽，利用一個以上同族體置換天然核苷酸，及核苷酸之間的變形，例如，不帶電的連結體 (例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷胺酸二乙酯、氨基甲酸酯等)或帶電的連結體(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的變型。核酸可以含有一個以上附加的共價結合的殘基，例如，蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、多聚左旋賴氨酸等)，嵌入劑(例如吖啶、 補骨脂素等)，絡合劑(例如金屬、放射性金屬、鐵、氧化性金屬等)及烷基化劑。本發明的核酸序列還可以利用能夠直接或間接地提供可檢測的信號的標記發生變型。上述標記例如放射性同位素、螢光性分子、生物素等。本發明中，能夠檢測出人類乳頭瘤病毒的引物可以是特異性擴增HPV-1、HPV_2、 HPV-3、HPV-4、HPV-27及HPV-57的特定區域的引物。另外，本發明的引物可以是能夠與所述的基因互補結合的具有10至40個，優選20至30個鹼基序列的正向及反向引物對。本發明的所述的引物，更優選地，可以是由序列編號1及2的鹼基序列組成的第1 引物對，由序列編號3及4的鹼基序列組成的第2引物對，由序列編號5及6的鹼基序列組成的第3引物對，由序列編號7及8的鹼基序列組成的第4引物對，由序列編號9及10的鹼基序列組成的第5引物對及由序列編號11及12的鹼基序列組成的第6引物對組成的群中所選的一種以上引物對。具體地說，HPV-I通過具有序列編號1和2的鹼基序列的引物對，HPV-2通過具有序列編號3和4的鹼基序列的引物對，HPV-3通過具有序列編號5和6的鹼基序列的引物對，HPV-4通過具有序列編號7和8的鹼基序列的引物對，HPV-27通過具有序列編號9和 10的鹼基序列的引物對，HPV-57通過具有序列編號11和12的鹼基序列的引物對，分別能夠特異性地擴增各自基因的特定區域。本發明中，提供了如上所述的特異性基因擴增用引物對，以探測出HPV-1、HPV-2、 HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57的亞型的特異性DNA鹼基序列，尤其是6種亞型的人類乳頭瘤病毒引物對全部混合而成的引物試劑盒。能夠設計併合成出6種PCR引物對，使所述的6 種亞型的人類乳頭瘤病毒的特異性DNA鹼基序列，在尺寸相互不同的情況下同時被探測出來。根據本發明的一實施例，在所述的人類乳頭瘤病毒檢測用引物對中，設計出如下記錄的由序列編號1及2的鹼基序列組成的第1引物對T1-5/T1-3，以特異性探測出HPV-1， 擴增特異性基因約57^ρ。序列編號l(Tl-5) :5' -GTGAACCATCATTTACAATAGTGA-3『序列編號2 (TU) :5' -ACGACCAGATAAGTTTGGCAGCA-3 『另外，設計出如下記錄的由序列編號3及4的鹼基序列組成的第2引物對Τ2-5/ Τ2-3，以特異性探測出HPV-2，擴增特異性基因約222bp。序列編號3(T2-5) :5' -ATACATTTCAAGGCCTGCCTCCGCA-3『序列編號4(Τ2-3) 5' -ACGTATGGCGAAATAATAACGACTA-3『另外，設計出如下記錄的由序列編號5及6的鹼基序列組成的第3引物對Τ3-5/ Τ3-3，以特異性探測出HPV-3，擴增特異性基因約348bp。序列編號5(T3-5) :5' -TACTATTTGTGCAGGCTTTCTCTGT-3『序列編號6(Τ3-3) 5' -ACAGGTGACCTGCAACTACAACCT-3『另外，設計出如下記錄的由序列編號7及8的鹼基序列組成的第4引物對Τ4-5/ Τ4-3,以特異性探測出HPV-4，擴增特異性基因約437bp。序列編號7(T4-5) :5' -TCTGGAATGTTTTATTCTGCCAGGA-3『序列編號8(Τ4-3) 5' -ATTTTCCACCACTCCCGGTGCAAA-3『另外，設計出如下記錄的由序列編號9及10的鹼基序列組成的第5引物對Τ27-5/ Τ27-3，以特異性探測出HPV-27，擴增特異性基因約174bp。序列編號9(T27-5) 5' -TAATTGTGACATATCGCCACCAT-3『序列編號10(T27-3) :5' -TAAGCCAATGAGGGTGAGAA-3『另外，設計出如下記錄的由序列編號11及12的鹼基序列組成的第6引物對 Τ57-5/Τ57-3，以特異性探測出HPV-57，擴增特異性基因約511bp。序列編號ll(T57-5) :5' -GYAACATTTCACAGCCTGTATCAT-3『序列編號12(T57-3) :5' -GTTTATTGACACGYAGCAATACA-3『因此，本發明的人類乳頭瘤病毒檢測用引物對不僅分別對6種人類乳頭瘤病毒， 即，HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57具有特異性，而且能夠以相互不同的尺寸擴增特異性基因，因此能夠分別探測出6種人類乳頭瘤病毒，也能夠同時探測出所述的6種人類乳頭瘤病毒。因此，本發明的所述的引物能夠有效使用在是否感染HPV，確認感染的HPV 遺傳型，HPV免疫學檢測，HPV疫苗的有效性及危害度檢測等。另外，本發明提供了能夠檢測出人類乳頭瘤病毒的探針。依照本發明的能夠檢測出人類乳頭瘤病毒的所述的探針，優選地，其組成可以是由序列編號1及2的鹼基序列組成的第1引物對，由序列編號3及4的鹼基序列組成的第 2引物對，由序列編號5及6的鹼基序列組成的第3引物對，由序列編號7及8的鹼基序列組成的第4引物對，由序列編號9及10的鹼基序列組成的第5引物對及由序列編號11及 12的鹼基序列組成的第6引物對組成的群中所選的一種以上引物對。另外，優選地，所述的第1引物對是HPV-IDNA的擴增引物，所述的第2引物對是 HPV-2DNA的擴增引物，所述的第3引物對是HPV-3DNA的擴增引物，所述的第4引物對是 HPV-4DNA的擴增引物，所述的第5引物對是HPV-27DNA的擴增引物，所述的第6引物對是 HPV-57DNA的擴增引物。本發明中，所述的「探針」意指能夠與DNA或RNA形成特異性結合的數個至數百個鹼基對應的核酸片段，另外所述的探針中形成標記(labeling)，能夠確認特定DNA或RNA是否存在。探針可製作成寡核苷酸探針、單鏈DNA探針、雙鏈DNA探針、RNA探針等形態，可利用生物素、FITC、羅丹明及DIG等標記，或利用放射線同位素等標記。另外，本發明提供了包括固定在基質上的所述的引物或探針的人類乳頭瘤病毒檢測用微陣列。所述的微陣列可以包括DNA或RNA聚核苷酸。所述的微陣列除了在探針或引物的聚核苷酸中包含本發明的聚核苷酸之外，由普通的微陣列組成。將探針聚核苷酸固定在基質製備微陣列的方法為業界所公知。本發明中，所述的 「探針聚核苷酸」意指可雜交的聚核苷酸，意味著能夠序列特異性地結合在核酸的補鏈上的寡核苷酸。上述探針中可包含Nielsen等在kience2M，1497-1500 (1991)中記錄的肽核酸。依照本發明的將人類乳頭瘤病毒相關探針聚核苷酸固定在基板上的過程，也可以使用傳統技術容易地進行製備。另外，微陣列上的核酸的雜交及雜交結果的檢測也為業內公知。所述的檢測舉例來說，核酸試樣列舉螢光物質為例，利用包含如Cy3及Cy5的物質的能夠發生可檢測信號的標記物質進行標記，之後雜交在微陣列上，通過檢測由所述的標記物質產生的信號，能夠檢測出雜交的結果。另外，本發明提供了利用依照本發明的人類乳頭瘤病毒檢測用引物或探針檢測人類乳頭瘤病毒的方法。本發明的能夠檢測出人類乳頭瘤病毒儘管不限定於此，但可通過多重聚合酶鏈式反應(Multiplex polymerase chain reaction),聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，逆轉錄聚合酶鏈式反應(Reverse transcriptase PCR)，DNA 測序 (DNA sequencing),基於微陣列(microarray)的雜交，PCR-RFLP (restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS (sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplifiedregions), ISSR(inter-simple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism), Northern 印跡雜交(Northern blot)及Southern印跡雜交(Southern blot)所組成的群中選擇的一種以上的方法實施。本發明中，術語「聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction :PCR)」是在試管內利用酶對特定DNA區域的所需部分進行擴增的，代表性的核酸擴增技術(NAT)中的一種。 於1985年由穆裡斯(Mullis)等人開發出來，無論DNA分子的任何部分，只需知道其旁鄰序列，即可通過該方法進行擴增。PCR基本上由變性、退火、延長三個階段組成，在重複該過程的同時擴增DNA。在PCR的第1階段變性階段使模板DNA變性為單鏈，在第2階段的退火階段使其結合在位於目標區域之間的兩種單鏈DNA。並且，在第3階段延伸階段，利用耐高溫的DNA聚合酶由引物合成DNA，以上循環重複25至30次。本發明的所述的人類乳頭瘤病毒檢測方法中可使用的引物或探針，可以是由序列編號1及2的鹼基序列組成的HPV-I檢測用第1引物對、由序列編號3及4的鹼基序列組成的HPV-2檢測用第2引物對、由序列編號5及6的鹼基序列組成的HPV-3檢測用第3引物對、由序列編號7及8的鹼基序列組成的HPV-4檢測用第4引物對、由序列編號9及10 的鹼基序列組成的HPV-27檢測用第5引物對、及由序列編號11及12的鹼基序列組成的 HPV-57檢測用第6引物對組成的群中所選的一種以上引物對或探針。具體地說，本發明的一實施例中提出了利用使用依照本發明的引物多重聚合酶鏈式反應(M-PCR)的方法，僅特異性檢測出人類乳頭瘤病毒中的6種亞型的方法。S卩，利用能夠擴增HPV-I、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57的6種亞型特異性DNA鹼基序列的引物對，能夠分別檢測6種亞型人類乳頭瘤病毒。另外，本發明的另一實施例中，利用使用包含全部6對引物對的引物試劑盒的多重聚合酶鏈式反應，能夠將HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57中的一種以上類型，根據擴增出的DNA的尺寸加以區分，同時將其檢測出來。依照本發明的一實施例，首先採集疣皮膚組織，實施蛋白酶!((proteinase K)，由組織提取出DNA，之後將其作為模板DNA，實施使用PCR引物混合液的多重聚合酶鏈式反應。 若多重聚合酶鏈式反應結束，則將擴增的DNA在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，根據有無特異性DNA鹼基序列擴增及其尺寸確認及判定亞型(參照圖1至圖3)。如上所述，使用能夠分別對HPV-l、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57特異性的 DNA進行擴增的引物試劑盒，實施多重聚合酶鏈式反應的結果，能夠確認出種亞型的特異性引物對，不能擴增不同類型的人類乳頭瘤病毒DNA。因此，本發明的檢測方法的特徵在於，不僅能夠利用第1引物對至第6引物對中選擇的1種引物對，特異性地檢測出各種人類乳頭瘤病毒亞型，而且利用含有全部6種引物對的引物試劑盒實施多重聚合酶鏈式反應，從而能夠一次快速檢測出6種類型(HPV-1、 HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57)的人類乳頭瘤病毒。另外，其特徵在於，能夠更加容易快速地確認皮膚或黏膜中產生的各種疣的亞型， 在此期間相對於表現出極低致病率的高危群疣，以實際上最常接觸到的疣類型為重點，可提高診斷價值。本發明進一步提供了包含所述的依照本發明的人類乳頭瘤病毒檢測用引物或探針的人類乳頭瘤病毒檢測用試劑盒。所述的檢測用試劑盒可以包含依照本發明的人類乳頭瘤病毒檢測用引物或探針， 所述的試劑盒可以包含病毒檢測試劑盒通常的組成成分，所述的通常的組成成分可以包括反應緩衝液、DNA聚合酶及dNTP等。本發明的一實施例中的人類乳頭瘤病毒檢測用試劑盒中，包括含有依照本發明的序列編號 1-12 的鹼基序列的 6 對引物對(T1-5/T1-3 ；T2-5/T2-3 ；T3-5/T3-3 ；T4-5/T4-3 ； T27-5/T27-3 ；T57-5/T57-3)的引物試劑盒，反應緩衝液及Taq DNA聚合酶。以下通過實施例對本發明進行詳細說明。然而該實施例用於更加具體地對本發明進行說明，本發明的範圍並不限定於該實施例。6 #M白■鼎DNA鹼赫歹丨丨牛廣 曾腕丨_糾十力☆成,本發明的發明者設計及合成出檢測用PCR引物，作為以如表1的HPV基因之間的 (intergenic sequence)為對象的各個類型的特異性鹼基序列，能夠不引起皮膚黏膜疣的 HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27、HPV-57的相互交叉反應，可一次將其檢測出來。表1
權利要求
1.一種人類乳頭瘤病毒檢測用引物或探針，其特徵在於，包含選自以下引物對所組成的群中的一種以上的引物對由序列編號1及2的鹼基序列組成的第1弓I物對； 由序列編號3及4的鹼基序列組成的第2弓I物對； 由序列編號5及6的鹼基序列組成的第3弓I物對； 由序列編號7及8的鹼基序列組成的第4引物對； 由序列編號9及10的鹼基序列組成的第5弓丨物對；及由序列編號11及12的鹼基序列組成的第6引物對。
2.根據權利要求1所述的人類乳頭瘤病毒檢測用引物或探針，其特徵在於， 所述的第1引物對是HPV-IDNA的擴增引物，所述的第2引物對是HPV-2DNA的擴增引物， 所述的第3引物對是HPV-3DNA的擴增引物， 所述的第4引物對是HPV-4DNA的擴增引物， 所述的第5引物對是HPV-27DNA的擴增引物， 所述的第6引物對是HPV-57DNA的擴增引物。
3.一種人類乳頭瘤病毒檢測用微陣列，其特徵在於，在基質上固定有如權利要求1或權利要求2中所述的引物或探針。
4.一種人類乳頭瘤病毒檢測用試劑盒，其特徵在於，包含如權利要求1或權利要求2中所述的引物或探針。
5.一種人類乳頭瘤病毒的檢測方法，其特徵在於，包括通過使用如權利要求1中所述的人類乳頭瘤病毒檢測用引物的聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)探測人類乳頭瘤病毒的步驟。
6.根據權利要求5所述的人類乳頭瘤病毒的檢測方法，其特徵在於，所述的人類乳頭瘤病毒選自 HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27 及 HPV-57 所組成的群。
全文摘要
本發明涉及人類乳頭瘤病毒檢測用引物，探針及使用它的人類乳頭瘤病毒的檢測方法。具體地說，本發明涉及包含由序列編號1及2的鹼基序列組成的第1引物對、由序列編號3及4的鹼基序列組成的第2引物對、由序列編號5及6的鹼基序列組成的第3引物對、由序列編號7及8的鹼基序列組成的第4引物對、由序列編號9及10的鹼基序列組成的第5引物對、及由序列編號11及12的鹼基序列組成的第6引物對組成的群中所選的一種以上引物對的，能夠特異性檢測出人類乳頭瘤病毒的引物，探針，包含它的人類乳頭瘤病毒檢測用微陣列，人類乳頭瘤病毒檢測用試劑盒及使用所述的引物或探針檢測人類乳頭瘤病毒的方法。依照本發明的人類乳頭瘤病毒檢測用引物及使用它的人類乳頭瘤病毒的檢測方法具有非常有用的效果，能夠特異性地、快速準確地掌握作為皮膚黏膜疣的原因的人類乳頭瘤病毒HPV-1、HPV-2、HPV-3、HPV-4、HPV-27及HPV-57的存在與否及類型。
文檔編號C12N15/11GK102428183SQ200980159172
公開日2012年4月25日 申請日期2009年9月10日 優先權日2009年5月7日
發明者崔順榮, 樸榮珉, 金範俊 申請人:天主教大學產學協力團