一種牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應用的製作方法
2023-08-04 03:17:06 1
一種牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應用。本發明所述引物組合物由引物組A和引物組B組成，所述引物組A由引物1和引物2組成，所述引物組B由引物3和引物4組成；引物1～引物4的核苷酸序列分別如SEQIDNO.1～4所示。本發明還提供了包含所述引物組合的試劑盒，本發明試劑盒應用於牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的方法如下：提取牛血液中的全組DNA作為模板，進行巢式PCR（NestedPCR）擴增，所得PCR產物進行測序，根據測序結果可直接了解突變位點的鹼基變化，確保了結果的準確性，滿足快速、精準、高通量等特點的檢測技術的需求。
【專利說明】一種牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應用
【技術領域】[0001]本發明涉及生物【技術領域】。更具體地，涉及一種牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物及其試劑盒和應用。
【背景技術】
[0002]隨著人工授精和胚胎移植技術的推廣和應用，奶牛優秀種質(胚胎、精液、種牛)在全球範圍內的廣泛應用，在顯著提高遺傳性能的同時，加速了牛隱性遺傳疾病對牛群的危害。特別是一頭優秀的種公牛一生可以生產幾十萬劑甚至上百萬劑冷凍精液，如果攜帶隱性遺傳缺陷基因，有可能在全世界範圍內快速蔓延，給畜牧業的生產帶來巨大的經濟損失。我國主要從美國、加拿大、德國、澳大利亞、紐西蘭和烏拉圭等國進口大量奶牛優秀種質，進口時檢疫重點在於防止動物傳染病和寄生蟲病的傳入，卻沒有包括防止牛遺傳缺陷的檢疫要求，所以存在的牛遺傳性缺陷攜帶者進入我國的風險。
[0003]遺傳缺陷病是生殖細胞或受精卵內的遺傳物質發生基因突變和染色體畸變導致的，從而使發育個體出現解剖結構上的異常或生理機能上的損害，常常導致某些器官的損害，形成畸形，影響生產性能，甚至導致死亡。具有先天性和家族性的特徵。遺傳缺陷性病分為常染色體遺傳缺陷病和性染色體遺傳缺陷病，其中常染色體遺傳缺陷病根據致病原因又分為單基因遺傳缺陷病、多基因遺傳缺陷病和染色體畸變遺傳缺陷病三種，性染色體遺傳缺陷較少見。常染色體單基因遺傳缺陷病是由一對等位基因控制的，隱性有害基因攜帶者表型正常，兩個親本都為攜帶者時，後代有1/4可能出現隱性純合子，即表型為患病，1/2可能為隱性雜合子，即為有害基因攜帶者。
[0004]尿苷酸合酶缺乏症(Deficiencyof Uridine MonophosPhate Synthase, DUMPS)又稱單譜症，是荷斯坦牛的一種導致胚胎早期死亡的遺傳缺陷，屬於常染色體單基因隱性突變。臨床症狀為血液中瓜氨酸含量升高，尿素循環受阻引起高氨血症，從而導致犢牛在出生一周內死亡，或者母牛懷孕約40d左右時流產。
[0005]尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)的遺傳學基礎是奶牛I號染色體(BTAl)上的尿苷酸合酶(UMPS)基因C-末端密碼子405處存在著一個C — T點突變，可導致原來編碼精氨酸的密碼子CGA轉變為終止密碼子TGA，導致基因編碼產物催化亞基C 一末端缺失76個胺基酸。由於這種蛋白質的酶催化功能喪失，因而造成其作用底物乳清酸的大量積累。根據這一突變位點，由於點突變造成了酶切位點的喪失，國外學者已建立PCR-RFLP、PCR-SSCP等檢測方法，檢測牛群尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS )雜合子。
[0006]根據這一突變位點，目前主要有PCR-RFLP和AS-PCR兩種方法檢測尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)。PCR-RFLP方法是在突變點處設計酶切位點，對PCR產物進行酶切，根據酶切結果判斷是否具有酶切位點用以判斷是否含有突變點，但是由於牛的基因組較大，只通過一次PCR，因DNA模板的濃度和純度的關係，擴增效率不高，而且容易發生錯誤片段，存在假陽性的可能，且該方法引入錯配鹼基後，PCR的擴增效率會受到影響。AS-PCR方法根據突變位點設計特異的引物，其中一條鏈與突變位點的一種鹼基狀態互補，另一條鏈按常規方法進行設計，特異引物在一種基因型中有擴增產物，在另一種基因型中沒有擴增產物，根據擴增產的有無確定是否有鹼基的突變，但該方法有時會引起在引物的3』末端的鹼基與模板的鹼基不互補的情況下，延伸仍然可以進行，容易造成結果的誤判。
【發明內容】
[0007]本發明要解決的技術問題是克服現有牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測檢測技術的不足，提供一種牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物。
[0008]本發明要解決的另一技術問題是提供一種牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的試劑盒。
[0009]本發明還有一要解決的技術問題是提供所述引物組合物和試劑盒的應用。
[0010]本發明上述目的通過以下技術方案實現:
提供一種牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物，由引物組A和引物組B組成；所述引物組A由引物I和引物2組成；所述引物組B由引物3和引物4組成；引物I~4的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1~4所示。
[0011]所述尿苷酸合酶缺乏症有害基因是尿苷酸合酶基因編碼精氨酸的405處密碼子發生無義突變的基因。
[0012]優選地，引物I和引物2的摩爾比為1: 1，引物3和引物4的摩爾比為1:1。
[0013]本發明提供所述牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物在巢式PCR法檢測牛尿苷酸合酶缺乏症有害基·因方面的應用。
[0014]本發明同時提供含有權利要求1~3任一所述牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物的試劑盒。
[0015]所述試劑盒，包含有如下組分:本發明所述牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物、DNA聚合酶、PCR反應緩衝液、dNTP和滅菌水。
[0016]在所述試劑盒中，優選地，所述引物組A或引物組B為完整獨立包裝。
[0017]本發明提供所述試劑盒在檢測牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因方面的應用。
[0018]優選地，檢測方法是利用巢式PCR方法進行兩次PCR反應，第一次PCR反應的模板為牛血液中的全組DNA，引物為引物組A ;第二次PCR反應的模板為第一次PCR反應產物的稀釋液，引物為引物組B ;對PCR產物進行測序，根據測序結果判定是否為牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因。
[0019]優選地，第一次PCR反應擴增得到一個419bp的片段，如SEQ ID N0.5所示；第二次PCR反應擴增得到一個180bp的片段，如SEQ ID N0.6所示；所述判定的方法為根據測序圖查看所述尿苷酸合酶缺乏症有害基因是尿苷酸合酶基因編碼精氨酸的405處密碼子是否發生無義突變來判斷，如果測序圖中該位點為單峰C，則為非尿苷酸合酶缺乏症有害基因；該位點為雙峰，同時含有C和T，則為尿苷酸合酶缺乏症有害基因。
[0020]優選地，所述第一次PCR反應的擴增體系中各組分的比例為模板:引物1:引物
2: PCR反應緩衝液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10:1: 73 ;
所述第二次PCR反應的擴增體系中各組分的比例為模板:引物3:引物4: PCR反應緩衝液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10:1: 73。[0021]本發明具有以下有益效果:
本發明科學設計一組新的引物組合物，具有優良的擴增特異性，擴增效率高，有效避免假陰性的結果，應用於檢測牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因準確性高。
[0022]本發明所述牛尿苷酸合酶缺乏症(DUMPS)有害基因的檢測方法克服了 PCR-RFLP和AS-PCR兩種檢測方法的缺點，通過兩次PCR，較好地避免了 PCR產物濃度低、擴增效率不高且容易發生錯誤片段等問題，而且第二次PCR反應出現引物配對在錯誤片段上並擴增的概率極低。
[0023]本發明最終結果的判定是通過測序來進行的，可直接測出突變位點的鹼基變化，確保了結果的準確性。同時，避免了其他檢測方法需要的凝膠電泳等操作，方法簡單，具有快速、精準、高通量的優點，為檢測牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因提供了有力的技術基礎，並特別適用於進出口貿易中對牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因的檢測技術需求。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為非尿苷酸合酶缺乏症有害基因攜帶者(正常型)奶牛牛尿苷酸合酶(UMPS)基因測序圖，箭頭處為突變位點。
[0025]圖2為尿苷酸合酶缺乏症有害基因攜帶者奶牛UMPS基因測序圖，箭頭處為突變位點。
[0026]圖3為尿苷酸合酶缺乏症患者奶牛UMPS基因測序圖，箭頭處為突變位點。
[0027]圖4為DUMP基因均一化的HRM溫度變化圖。
[0028]圖5為DUMP基因的HRM差異視圖。
【具體實施方式】
[0029]以下結合附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明採用的試劑、設備和方法為本【技術領域】常規試劑、設備和方法。
[0030]本發明實施例所用Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul)和 IOXPfu Buffer、dNTPMixture (2.5 mmol/L),均購自天根生物科技有限公司。
[0031]實施例1製備篩查牛尿苷酸合酶缺乏症的巢式PCR反應試劑盒 1、引物設計
根據NCBI上UMPS基因序列(GenBank: AC_000158)結合本發明整體思路不斷分析、總結和調整引物的設計，最終根據牛I號染色體(BTAl)上的尿苷酸合酶(UMPS)基因C-末端密碼子405處存在著一個C — T點突變，設計了一種檢測牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因的巢式PCR方法，獲得引物1、引物2、引物3和引物4。序列分別如SEQ ID N0.1~4所示:根據NCBI上牛的基因序列設計引物1、引物2、引物3和引物4。序列如SEQ ID N0.1-4所示:
引物 I:SEQ ID N0.1:gttattttag ggtcttagtg gage ；
引物 2:SEQ ID N0.2:atatttcaat aaaaagtaac c ；
引物 3:SEQ ID N0.3:ggtgtggtta actgctgtct tg ；
引物 4:SEQ ID N0.4:ccaatcaata ggcttacctc ctg。[0032]其中，引物I和引物2為引物組A(外引物)，引物3和引物4為引物組B(內引物)。
[0033]所有引物可以採用合成等常規方法獲得。本實施例引物由上海英駿生物技術有限公司合成。
[0034]本發明所述篩查牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因攜帶者的試劑盒，除了包含有上述引物組，還包含有PCR反應相關試劑。所述引物組是引物組A和引物組B ;所述PCR反應相關試劑為DNA聚合酶、PCR反應緩衝液、dNTP和滅菌水。
[0035]本實施例以引物組A和引物組B同時使用(巢式PCR反應試劑盒)為例，說明檢測牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因的試劑盒的製備。
[0036]2、本實施例製備的巢式PCR反應試劑盒包括兩個部分:第一次PCR (外引物)試劑盒和第二次PCR (內引物)試劑盒。
[0037](I)第一次PCR (外引物)試劑盒
試劑盒除了包括外引物(引物I和引物2)，還包括PCR反應試劑:Pfu DNA Polymerase酶(2.5U/ul)、10XPfu Buffer,dNTP Mixture (2.5 mmol/L)、ddH20。PCR 反應的引物 I 為正向引物，引物2為反向引物，正反向引物濃度均為10pmol/L。
[0038]PCR反應體系以25 uL體系為例:引物I和引物2各0.5mL，IOXPfu Buffer2.5mL、dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 2.5mL> Pfu DNA Polymerase 酶(2.5U/ul) 0.25mL、ddH20 18.25mL,剩下的0.5mL體積為模板DNA。即用於第一次PCR反應的試劑混合液中各成分比例為，引物 1:引 物 2:1OXPfu Buffer: dNTP Mixture: Pfu DNA Polymerase酶:ddH20=2: 2: 10: 10:1: 73。
[0039]實驗時根據體系的總量按比例加入相關成分並混勻，加入模板DNA進行第一次PCR反應。
[0040](2)第二次PCR (內引物)試劑盒:
試劑盒包括外引物(引物3和引物4)，PCR反應的引物3為正向引物，引物4為反向引物，正反向引物濃度均為lOpmol/L。除引物外，其他相關成分和各成分的比例同第一次PCR試劑盒相同。即引物3:引物4:1OXPfu Buffer: dNTP Mixture: Pfu DNA Polymerase酶:ddH20=2: 2: 10: 10:1: 73。
[0041]實驗時根據體系的總量按比例加入相關成分並混勻，以便加入模板DNA進行第二次PCR反應。
[0042]實施例2利用實施例1製備的巢式PCR反應試劑盒檢測奶牛尿苷酸合酶缺乏症 1、牛血液中全組DNA的提取
頸靜脈採血法隨機採集江蘇某隔離場243頭荷斯坦奶牛的血液樣本5mL/頭，並置於真空肝素鈉抗凝管中搖勻後用離心管分裝每管2mL，-20°C凍存備用。
[0043]採用Promega Maxwell 16核酸自動提取儀進行血液基因組DNA的提取，使用配套試劑盒(Promega 公司的 AS1010)。Promega 的 AS1010 試劑盒包含 Maxwell 16 Blood DNACartridges、Purification Plungers、Elution Tubes、Elution buffer。操作按試劑盒說明書進行，該儀器啟動後大約每28min可以完成16個樣品DNA的提取。DNA提取完畢後，將其從洗脫管中轉移至離心管(Ep管)中，置於_20°C保存待用。
[0044]經過測定，提取的牛血液全組DNA樣品的濃度為83ng/ μ L。
[0045]2、第一次PCR (外引物)反應以上述抽提得到的DNA為模板，用實施例1中的第一次PCR試劑盒進行擴增。體系為25μ L:模板DNA 0.5mL (41.5 ng)、第一次PCR試劑混合物24.5mL (其中包括引物I和引物2各 0.5mL, IOXPfu Buffer 2.5mL、dNTP MixtureC2.5 mmol/L)2.5mL、Pfu DNA Polymerase酶(2.5U/ul) 0.25mL、ddH20 18.25mL)。擴增條件為:94°C 3min,94°C 30s,51.4°C 30s、70.4°C 15s,30cycles,70.4°C lmin。
[0046]以無菌水為模板作為陰性對照.3、第二次PCR (內引物)反應
取5mL第一次PCR產物稀釋100倍作為第二次PCR反應的模板，用實施例1中的第二次PCR試劑盒進行擴增。體系為50 μ L:模板DNA lmL、第二次PCR試劑混合物49mL。擴增條件為:94°C 3min,94°C 30s,65°C 30s,68°C 15s,30 cycles,68°C lmin。
[0047]4、分別對第一次PCR和第二次PCR產物進行測序(測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成)，擴增產物的測序結果用DNAMAN軟體分析，附圖中箭頭所標位點為導致DUMPS的SNP位點。根據測序圖查看牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因攜帶者突變位點是否有變化，如果測序圖中該位點為單峰C (如圖1所示，箭頭處為突變位點)，則為非尿苷酸合酶缺乏症有害基因攜帶者(正常型);如果該位點為雙峰，同時含有C和T (如圖2所示，箭頭處為突變位點)，則為尿苷酸合酶缺乏症有害基因攜帶者(雜合子);如果該位點為單峰T (如圖3所示，箭頭處為突變位點)，則為尿苷酸合酶缺乏症患者(突變型)。
[0048]統計結果顯示，243份樣品中，DUMPS正常型236份，DUMPS雜合子5份，DUMPS突變型2份。
[0049]對比例I利用HRM檢測方法檢測奶牛瓜氨酸血症
1、材料
(I)試驗樣本:同實施例2， 頸靜脈採血法隨機採集江蘇某隔離場243頭荷斯坦奶牛的血液樣本5ml/頭，並置於真空肝素鈉抗凝管中搖勻後用離心管分裝每管2ml，-2(TC凍存備用。
[0050]DNA提取方法同實施例2。
[0051](2)試劑及試劑盒
普通Taq酶試劑盒，購自水源生物科技(上海)有限公司；
Gel extraction kit,購自上海捷瑞生物科技有限公司；
100 bp DNA Ladder Marker，購自水源生物科技(上海)有限公司；
Hot start Taq酶試劑盒,購自水源生物科技(上海)有限公司；
EverGreen Q-PCR Mix，購自水源生物科技(上海)有限公司；
T-載體，購自寶生物(大連)生物工程有限公司；
SYBR GREEN I，購自北京普博欣生物科技有限公司。
[0052](3)主要試劑的配製
電泳緩衝液(50 X TAE貯存液):稱取Tris 242g，冰乙酸57.lmL，加入IOOmL 0.5mol/L EDTA溶液(pH8.0)，定容至1L，用前以蒸餾水稀釋為IX工作液。
[0053]SYBR Green I染料(電泳級)工作液:取TAE電泳工作緩衝液與SYBR Green I染料以1:3的比例配置。
[0054]2、標準質粒的構建採用全基因合成的方法(由上海捷瑞生物科技有限公司合成)，構建DUMP標準品，突變基因型質粒(T/T型)、野生基因型質粒(G/G型)，再以二者等比例混合做成雜合基因模版(G/T 型)。
[0055]3、HRM引物的設計與合成
根據Genbank已發表的DUMP序列，應用DNAstar軟體設計特異性PCR的引物。引物由上海捷瑞生物科技有限公司合成。具體引物如下:
Fl 5』 -TTCTGAATTTGTGATTGGTTTTAT-3』 ；
Rl 5』 -CCTCCTGCTTCTAACTGAACTC-3』。
[0056]引物的產物大小為96bp,退火溫度為60°C。
[0057]4、HRM檢測方法的初步建立
(1)243頭荷斯坦奶牛的血液樣本DNA的基因型的確定方法為，參照標準質粒的曲線形態來確定。
[0058](2)取I μ L各標準質粒的野生和突變的純合性及混合質粒DNA分別做模板，按照如下體系進行PCR擴增。PCR體系為30yL，包括15yL的2XMix buffer、5 μ L的dNTP、上下遊引物各0.5 μ L、I μ L模板DNA、13 μ L的ddH20。
[0059]反應條件為94°C預變性3min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，40個循環，反應在Roche480螢光定量PCR儀上進行，反應結束後進行HRM分析。HRM分析採用Roche480螢光定量PCR儀，檢·測條件為95°C變性lmin，40°C復性lmin，50°C保持IOs,從50°C開始，以0.01°C /s升溫速度採集熔解曲線數據，每秒採集40次數據，至95°C結束螢光米集。
[0060]5、數據分析
採用Roche 480自帶的HRM分析軟體進行分析。首先對原始熔解曲線進行均一化(normalization)，軟體會自動對曲線類型進行分組，具有相同或接近的曲線形態的樣品將被歸為一組，然後通過軟體的差別顯示功能顯出分組的結果。與已知標準質粒同組的樣品即具有該質粒基因類型的基因型。
[0061]結果如附圖4和附圖5所示，DUMP基因的三種質粒的HRM曲線，T/T、C/C純和型和c/τ雜合型曲線都各自不同，得到了很好的區分，經過差異化後，三者區分更明顯，一般很難區分的純合型T/T、C/C都分得很開。
[0062]統計結果顯示，243份樣品中，CN正常型236份，CN雜合子5份，CN突變型2份。
[0063]結果與本發明巢式PCR方法結合測序的檢測方法所得的結果一致。
[0064]本發明利用巢式PCR方法結合測序檢測牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因攜帶者的方法簡單、易操作，且準確性高，適合快速、精準、高通量的檢測技術的需要。
【權利要求】
1.一種牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物，其特徵在於，由引物組A和引物組B組成；所述引物組A由引物I和引物2組成；所述引物組B由引物3和引物4組成；引物I~4的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.1~4所示。
2.根據權利要求1所述牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物，其特徵在於，所述牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因是尿苷酸合酶基因編碼精氨酸的405處密碼子發生無義突變的基因。
3.根據權利要求1所述牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物，其特徵在於，引物I和引物2的摩爾比為1:1 ;引物3和引物4的摩爾比為1:1。
4.權利要求1~3所述牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物在巢式PCR法檢測牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因方面的應用。
5.一種含有權利要求1~3任一所述牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物的試劑盒。
6.根據權利要求5所述試劑盒，其特徵在於，包含有如下組分:權利要求1~3任一所述牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因檢測的引物組合物、DNA聚合酶、PCR反應緩衝液、dNTP和滅菌水。
7.權利要求5所述試劑盒在檢測牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因方面的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於，檢測方法是利用巢式PCR方法進行兩次PCR反應，第一次PCR反應的模板為牛血液中的全組DNA，引物為引物組A ;第二次PCR反應的模板為第一次PCR反應產物的稀釋液，引物為引物組B ;對PCR產物進行測序，根據測序結果判定是否為牛尿苷酸合酶缺乏症有害基因。
9.根據權利8所述應用，其特徵在於，第一次PCR反應擴增得到一個419bp的片段，如SEQ ID N0.5所示；第二次PCR反應擴增得到一個180bp的片段，如SEQ ID N0.6所示；所述判定的方法為根據測序圖查看所述尿苷酸合酶缺乏症有害基因是尿苷酸合酶基因編碼精氨酸的405處密碼子是否發生無義突變來判斷，如果測序圖中該位點為單峰C，則為非尿苷酸合酶缺乏症有害基因；該位點為雙峰，同時含有C和T，則為尿苷酸合酶缺乏症有害基因。
10.根據權利8或9所述應用，其特徵在於，所述第一次PCR反應的擴增體系中各組分的比例為模板:引物1:引物2: PCR反應緩衝液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10: I: 73 ； 所述第二次PCR反應的擴增體系中各組分的比例為模板:引物3:引物4: PCR反應緩衝液:dNTP: DNA聚合酶:滅菌水=2: 2: 10: 10:1: 73。
【文檔編號】C12N15/11GK103627804SQ201310617444
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】郭霄峰, 代元元, 吳曉薇 申請人:華南農業大學