新型大腸桿菌菌株及其製備方法和它們在l－蘇氨酸生產發酵方法中的應用的製作方法

2023-08-03 13:12:46

專利名稱：新型大腸桿菌菌株及其製備方法和它們在l－蘇氨酸生產發酵方法中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及新型大腸桿菌(Escherichia coli)菌株和利用這些微生物的發酵方法。本發明尤其涉及經基因改造的大腸桿菌菌株和它們在胺基酸，特別是天冬氨酸族胺基酸成員，如蘇氨酸生產中的應用。本發明還涉及用於胺基酸發酵生產的大腸桿菌菌株的製備方法。
背景技術：
在大腸桿菌中，胺基酸L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸和L-甲硫氨酸的全部或部分碳原子通過下面的共同生物合成途徑由天冬氨酸衍生而來(G.N.Cohen，「賴氨酸、甲硫氨酸和蘇氨酸合成的共同途徑，(The common pathway to lysine,methionine and threonine,)」pp.147-171《胺基酸生物合成及遺傳調控》(Amino Acids:Biosynthesis andGenetic Regulation),K.M.Herrmann和R.L.Somerville編，Addison-Welesley出版有限公司，Reading,Mass.(1983))天冬氨酸→天冬氨醯磷酸→天冬氨酸半醛→高絲氨酸→甲硫氨酸/蘇氨酸/異亮氨酸↓賴氨酸這個共同途徑的第一步反應是由三種不同的天冬氨酸激酶(AKⅠ、Ⅱ或Ⅲ)中的一種催化的，每一種天冬氨酸激酶由各自的基因編碼並且其活性和合成的調控方式與其它的天冬氨酸激酶不同。例如，天冬氨酸激酶Ⅰ由thrA編碼，其活性受蘇氨酸抑制，其合成受蘇氨酸和異亮氨酸的聯合阻遏。而天冬氨酸激酶Ⅱ是由metL編碼的，並且它的合成受甲硫氨酸的阻遏(儘管它的活性不受甲硫氨酸抑制或甲硫氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸成對的聯合抑制(F.Falcoz-Kelly等，歐洲生物化學雜誌(Eur.J.Biochem.)8:146-152(1969)；J.C.Patte等，Biochim.Biophys,Acta136:245-257(1967))。天冬氨酸激酶Ⅲ由lysC編碼，其活性和合成分別受到賴氨酸的抑制和阻遏。
天冬氨酸激酶中的兩種，天冬氨酸激酶Ⅰ和Ⅱ並不是不同的蛋白質，而是一個複合酶的結構域，這個複合酶分別含有高絲氨酸脫氫酶Ⅰ和Ⅱ，每一種高絲氨酸脫氫酶催化天冬氨酸半醛還原為高絲氨酸(P.Truffa-Bachi等，歐洲生物化學雜誌(Eur.J.Biochem.)5:73-80(12968)]。因此高絲氨酸脫氫酶Ⅰ也是由thrA編碼的，它的合成受到蘇氨酸和異亮氨酸的聯合阻遏，並且它的活性受到蘇氨酸的抑制。高絲氨酸脫氫酶Ⅱ相似地也由metL編碼並且它的合成受甲硫氨酸阻遏。
蘇氨酸的生物合成包括下列附加反應高絲氨酸→高絲氨酸磷酸→蘇氨酸。高絲氨酸的磷酸化也是由高絲氨酸激酶催化的，該酶是一種由thrB編碼的兩個相同的29kDa的亞單位組成的蛋白質，並且該蛋白質的活性受蘇氨酸抑制(B.Burr等，生物化學雜誌(J.Biochem.)62:519-526(1976))。最後一步，由高絲氨酸磷酸到L-蘇氨酸的複雜轉化是由蘇氨酸合酶催化的，該酶是由thrC編碼的47kDa的蛋白質(C.Parsot等，核酸研究(Nucleic Acids Res.)11:7331-7345(1983))。
thrA、thrB和thrC基因都屬於thr操縱子，這是一個位於大腸桿菌基因圖譜0分鐘的單獨操縱子(J.Theze和I.Saint-Girons，細菌學雜誌(J.Bacteriol)118:990-998(1974)；J.Theze等，細菌學雜誌，117:133-143(1974)))。這些基因分別編碼天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶。這些酶的生物合成受到蘇氨酸和異亮氨酸的多價阻遏(M.Freundlich，生物化學和生物物理學研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun)10:277-282(1963))。
在thr操縱子的第一個結構基因的上遊發現了一個調控區，其序列已經確定(J.F.Gardner，美國國家科學院院報(Proc.Natl,Acad.Sci.USA)76:1706-1710(1979))。thr弱化子位於轉錄起始位點下遊，包含一段編碼先導肽的序列，該序列包含8個蘇氨酸密碼子和4個異亮氨酸密碼子。thr弱化子還包含典型的互斥型二級結構，其依賴於帶電荷的蘇氨醯-和異亮氨醯-tRNA的水平允許或阻止RNA聚合酶對結構基因的轉錄。
因為關係到通過自然生物合成獲得高水平胺基酸產量的問題(例如thr操縱子受目的產物的抑制)，構建了具有包含一個thr操縱子的質粒的細菌菌株，該操縱子帶有編碼抗反饋酶的thrA基因。利用這些質粒，已經在工業規模上通過利用多種微生物，例如，黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)和大腸桿菌發酵生產了L-蘇氨酸。
例如，大腸桿菌菌株BKIIM B-3996(Debabov等，美國專利第5,175,107號)含有質粒pVIC40，在36小時產生蘇氨酸約85g/L。該宿主是一種蘇氨酸需求型菌株，因為它的蘇氨酸合酶是缺陷的。在BKIIMB-3996中，重組質粒pVIC40提供了蘇氨酸生物合成必需的關鍵酶活性，即抗反饋天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶。該質粒還互補了宿主的蘇氨酸缺陷。
大腸桿菌菌株29-4(E.Shimizu等，Biosci.Biotech.Biochem.59:1095-1098(1995))是重組大腸桿菌蘇氨酸產生菌的另一個例子。菌株29-4的構建是通過將一個蘇氨酸過量產生突變株，大腸桿菌K-12(βIM-4)(來自大腸桿菌ATCC 21277)的thr操縱子克隆至質粒pBR322，再將該質粒引入親株(K.Wiwa等，農業生物化學(Agric.Biol.Chem.)47:2329-2334(1983))。菌株29-4在72小時內產生約65g/L蘇氨酸。
利用其它微生物構建了相似的重組菌株。例如粘質沙雷氏菌菌株T2000含有編碼抗反饋的thrA基因產物的thr操縱子的質粒，且在96小時內產生約100g/L蘇氨酸(M.Masuda等，應用生物化學與生物技術(Applied Biochemistry and Biotechnology)37:255-262(1992))。所有這些菌株都含有帶多拷貝編碼蘇氨酸生物合成酶的基因的質粒。該質粒允許過量表達這些酶。這種來自質粒的編碼蘇氨酸生物合成酶的基因的過量表達，尤其是編碼抗反饋天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ的thrA基因，使得這些菌株產生大量的蘇氨酸。其它的含有質粒的微生物的例子也已被描述，如美國專利第4,321,325；4,347,318；4,371,615；4,601,983；4,757,009；4,945,058；4,946,781；4,980,285；5,153,123；和5,236,831號。
然而這些含質粒的菌株還存在限制它們在商業化發酵生產胺基酸上的應用的問題。例如這些菌株的一個顯著的問題是必須確保在整個發酵過程中維持包含質粒的菌株的完整性。因為在細胞生長和分化過程中質粒可能丟失。要避免這個問題，就有必要在培養過程中選擇性地淘汰不含質粒的細胞，例如通過在質粒上加上抗生素抗性基因。然而這種需要向發酵培養基中添加一種或多種抗生素的方法對大規模的發酵在商業上是不實用的。
包含質粒的菌株的另一個顯著的問題是質粒的穩定性。基因編碼在質粒上的酶的高表達是對商業化實用性的發酵方法而言所必要的，但卻經常引起質粒的不穩定性(E.Shimizu等．Biosci.Biotech.Biochem.59:1095-1098(1995))。質粒的穩定性還依賴於諸如培養溫度和培養基中的溶解氧水平等因素。例如，包含質粒的菌株29-4在較低的培養溫度(30℃比37℃)和較高的溶解氧水平時更穩定(E.Shimizu等，Biosci.Biotech.Biochem.59:1095-1098(1995))。
不合質粒的微生物儘管不如上述那些菌株有效，也已用作蘇氨酸產生菌。大腸桿菌如菌株H-8460是通過一系列常規誘變和對幾種代謝類似物的抗性篩選獲得的，它在70小時內產生大約75g/L的L-蘇氨酸(Kino等，美國專利第5,474,918號)。菌株H-8460沒有攜帶重組質粒，在染色體上有一個蘇氨酸生物合成基因的拷貝。這個菌株的產量與含有質粒的菌株如BKIIM B-3996相比較低，據信是由於酶活性較低的緣故(尤其是那些由thr操縱子編碼的酶)，因為這些不合質粒的菌株僅僅含有一個拷貝的蘇氨酸生物合成基因。其它適合的不含質粒的微生物的例子也有描述，如美國專利第5,376,538；5,342,766；5,264,353；5,217,883；5,188,949；5,164,307；5,098,835；5,087,556；5,077,207；5,019,503；5,017,483；4,996,147；4,463,094；4,452,890；3,732,144；3,711,375；3,684,654；3,684,653；3,647,628；3,622,453；3,582,471；3,580,810；3,984,830；和3,375,173。
無論是不含質粒還是含有質粒的大腸桿菌菌株，其thr操縱子都是由該菌株自身的蘇氨酸啟動子所調控的。如前面所述，自身啟動子的表達受到由一段DNA區域控制的弱化機制的調節，這段DNA編碼一個先導肽並含有大量的蘇氨酸和異亮氨酸密碼子。這段DNA區域由一個能感受蘇氨醯-tRNA和異亮氨醯-tRNA水平的核糖體所翻譯，當這兩種氨醯-tRNA的水平足夠使先導肽翻譯時，轉錄被過早地終止。但是當其水平不足以使先導肽翻譯時，轉錄不被終止而整個操縱子被轉錄，隨後進行翻譯，導致蘇氨酸生物合成酶產量增加。於是當蘇氨醯-tRNA和/或異亮氨醯-tRNA水平低時，thr操縱子被最大程度地轉錄並且蘇氨酸生物合成酶產量最大。
在大腸桿菌蘇氨酸產生菌株BKIIMB-3996中，質粒上的蘇氨酸操縱子被其自身的啟動子所調控。因此，只有當菌株缺乏蘇氨酸和/或異亮氨酸時，thr操縱子才能被最大程度地表達。因為在產蘇氨酸菌株中不可能存在蘇氨酸飢餓，這些菌株被賦予異亮氨酸缺陷型來獲得較高水平的酶活性。
克服弱化控制的另一條途徑是降低細胞中蘇氨醯-tRNA和/或異亮氨醯-tRNA水平。例如，一個帶蘇氨醯-tRNA合酶的thrS突變株，該酶對蘇氨酸的表觀親和力降低了200倍，結果使thr操縱子過量表達，原因可能是蘇氨醯-tRNA的水平較低(E.J.Johnson等．細菌學雜誌(J.Bacteriol.)129:66-70(1977))。
然而在利用這些菌株的發酵方法中，必須在生長期補加異亮氨酸，因為細胞的異亮氨酸生物合成不足。隨後在生產期細胞缺乏誘導蘇氨酸生物合成酶表達的異亮氨酸。所以，利用自身蘇氨酸啟動子控制蘇氨酸生物合成酶表達的一個主要缺點是必須為細胞補加異亮氨酸。
已知抗生素疏螺旋體素(borrelidin)能降低蘇氨醯-tRNA合酶的酶學活性，並因而抑制大腸桿菌生長(G.Nass等。生物化學與生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)34:84(1969))。鑑於這種降低的酶活，某些大腸桿菌的疏螺旋體素敏感菌株被用於生產高水平的蘇氨酸(日本公開專利申請第6752/76號；美國專利第5,264,353號)。發現向培養物中添加疏螺旋體素可以增加L-蘇氨酸的產量。短桿菌屬(Brevibacterium)和棒桿菌屬(Corynebacterium)的菌株也已被用於生產高水平的蘇氨酸(日本專利第53-101591號)。
大腸桿菌的疏螺旋體素抗性突變株同樣表現出蘇氨醯-tRNA合酶活性的改變。更進一步說，疏螺旋體素抗性的大腸桿菌表現為具備下列特徵之一(ⅰ)組成型地增加野生型蘇氨醯-tRNA合酶的水平；(ⅱ)結構上改變了的蘇氨醯-tRNA合酶；或(ⅲ)一些未知的細胞變化，可能由於一種膜的改變(G.Nass和J.Thomale,FEBS Lett.39:182-186(1974))。然而這些突變株還沒有一種被用於L-蘇氨酸的發酵生產上。
鑑於上述討論，在現有技術上尚存對這種微生物菌株的需求，它們可以有效地產生胺基酸，如蘇氨酸，但不存在與現有技術有關的問題。
發明概述本發明的一個目的在於提供能夠有效地產生大量的L-蘇氨酸，而不需要任何含有編碼蘇氨酸生物合成酶基因的重組質粒，並且優選地沒有對胺基酸營養的需求的微生物。本發明其它的目的、特性和優點將在隨後的優選實施方案的詳細描述中給出，並且部分將通過說明書得到明確或從本發明的實踐中學習到。本發明的這些目的和優點將通過在此次書面描述和權利要求中特別指出的方法得以實現。
這些目的和其它目的是通過本發明的方法完成的；在本發明第一實施方案中涉及一種用於生產胺基酸如蘇氨酸的方法，該方法包括在培養基中培養一種大腸桿菌菌株並從培養基中回收胺基酸的步驟。本方法中採用的大腸桿菌菌株具有下列特徵(ⅰ)它在染色體上含有一個處於非自身啟動子控制之下的胺基酸生物合成遺傳決定子，如蘇氨酸操縱子(該操縱子編碼蘇氨酸生物合成酶)；且(ⅱ)它不需要任何含有編碼蘇氨酸生物合成酶基因的重組質粒用於產生蘇氨酸。
本發明的另一個實施方案涉及具有上述特徵的大腸桿菌菌株的生物純培養。
本發明的另外一個實施方案涉及一種用於生產胺基酸，如蘇氨酸的方法，它包括在培養基中培養一種大腸桿菌菌株並從培養基中回收胺基酸的步驟，其中大腸桿菌菌株為疏螺旋體素抗性。
本發明的另一個實施方案涉及一種產生用於發酵生產胺基酸，如蘇氨酸的大腸桿菌菌株的方法，它包括這樣幾個步驟(a)將遺傳物質從一種胺基酸產生菌引入到一種大腸桿菌缺陷型的染色體中，使得該大腸桿菌成為原養型；(b)在該胺基酸生物合成基因的染色體位置之前插入一個非自身啟動子到染色體上以控制其表達；以及選擇性地，(c)從該染色體上去除胺基酸生物合成對胺基酸的營養需求，和/或胺基酸生物合成的調控障礙。
需要理解的是，前面的一般性描述和後面的描述都僅僅意在舉例和解釋，目的在於提供根據權利要求的本發明的進一步解釋。
附圖簡述

圖1描繪的是由質粒Kohara′sλ676和質粒pUC19構建質粒pAD103的過程。圖2描繪的是由質粒pAD103和質粒pUC4k構建質粒pAD106的過程。圖3描繪的是由質粒pAD103和質粒pKK223-3構建質粒pAD115的過程。圖4描繪的是由質粒pAD115和質粒pAD106構建質粒pAD123的過程。圖5描繪的是將啟動子區域從質粒pAD123整合到大腸桿菌染色體的過程。
本發明優選實施方案的詳述在第一個實施方案中，本發明涉及可以用於胺基酸發酵生產方法的新細菌菌株。本發明的新細菌菌株具有以下特徵(ⅰ)該菌株在染色體上至少含有一個處於非自身啟動子的控制之下的thr操縱子，即至少一套編碼蘇氨酸生物合成酶的基因；以及(ⅱ)該菌株不需要任何編碼蘇氨酸生物合成酶的重組質粒用於產生蘇氨酸。
優選地，這些創造性的菌株能夠在約30小時內產生至少約50g/L左右的L-蘇氨酸；更優選地在約30小時內產生至少約70g/L，甚至更優選地在約30小時內產生至少約80g/L，最優選地在約30小時內產生至少約90g/L L-蘇氨酸。優選地，這些創造性的菌株能夠在約48小時內產生至少約90g/L，更優選地在約48小時內產生至少約100g/L，最優選地在約48小時內產生至少約110g/L的蘇氨酸。
優選地，這些創造性的菌株能夠以至少2克/升/小時左右的速率產生L-蘇氨酸，更優選地以至少2.5克/升/小時左右的速率，更優選地以至少3克/升/小時左右的速率，最優選地以至少3.6克/升/小時左右的速率產生L-蘇氨酸。
在一個具體的優選實施方案中，用於發酵產生蘇氨酸的新細菌菌株同樣沒有對胺基酸營養的需求，即不需要添加胺基酸用於細胞生長和產生蘇氨酸。
根據本發明，創造性的細菌菌株不需要任何包含一種或多種編碼用於產生蘇氨酸的蘇氨酸生物合成酶基因的重組質粒，即該菌株能夠產生蘇氨酸而不需要由重組質粒中所含的基因編碼一種或多種蘇氨酸生物合成酶。當然這些創造性的菌株根據需要可選擇地含有一種或多種重組質粒。例如，儘管這樣的質粒不是產生蘇氨酸所要求的，這些創造性的菌株可以含有編碼蘇氨酸生物合成酶的重組質粒用於增加蘇氨酸的產量。本發明的菌株同樣可以含有編碼參與蘇氨酸生物合成的其它酶如天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的重組質粒。
優選地，這些創造性的菌株為大腸桿菌菌株。更優選地，這些創造性的菌株是對大環內酯類抗生素疏螺旋體素呈抗性的大腸桿菌菌株。這些創造性的細菌菌株的一個特別優選例子是大腸桿菌菌株kat-13，它於1996年6月28日被保藏於農業研究機構保藏中心(NRRL),1815 NorthUniversity Street,Peoria,Illinois 61604，美國，保藏號為NRRL B-21593。
位於這些創造性細菌菌株細胞染色體上的蘇氨酸(thr)操縱子編碼蘇氨酸生物合成所必需的酶。優選地，蘇氨酸操縱子包含AK-HD基因(thrA或metL)、高絲氨酸激酶基因(thrB)和蘇氨酸合酶基因(thrC)。更優選地，thr操縱子包含thrA(AKⅠ-HDⅠ基因)、thrB和thrC。合適的thr操縱子可以從諸如大腸桿菌菌株ATCC21277和菌株ATCC21530中獲得。特別優選來自菌株ATCC21277的thr操縱子。染色體上可能存在多拷貝的thr操縱子。
優選地，thr操縱子含有至少一種非弱化的基因，即該基因的表達不受(胞外和/或胞內)一種或多種蘇氨酸生物合成酶水平和/或其產物(如蘇氨酸和異亮氨酸)水平的阻遏。創造性菌株還可能含有具有缺陷型thr弱化子(位於轉錄起始位點下遊和第一個結構基因上遊的調控區)或沒有thr弱化子的一種thr操縱子。
在本發明的一個特定優選實施方案中，thr操縱子編碼一種或數種抗反饋的蘇氨酸生物合成酶，即酶的活性不受胞外和/或胞內的蘇氨酸生物合成的中間產物和終產物水平的抑制。最優選地，thr操縱子含有一個編碼抗反饋的AK-HD的基因，如抗反饋的AKⅠ-HDⅠ。抗反饋AK-HD的應用為蘇氨酸生物合成提供了高水平的酶活性，即使在產生蘇氨酸的狀態下也是如此。
這些創造性菌株中蘇氨酸操縱子的表達受非自身啟動子的控制，即通常不控制自然界中大腸桿菌菌株中的thr操縱子表達的啟動子。把蘇氨酸生物合成酶自身啟動子替換成一種非自身的強啟動子來控制thr操縱子的表達，使得即使只有一個基因組拷貝的thr操縱子也能得到較高產量的蘇氨酸。另外，既然用一種非自身的啟動子來控制蘇氨酸操縱子的表達，也就沒有必要為了獲得更高產量的蘇氨酸而賦予菌株異亮氨酸缺陷型了。合適的啟動子的示範性的例子包括，但並不局限於lac啟動子；trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；PR啟動子；lpp啟動子和tac啟動子。特別優選用於這些創造的細菌菌株的是tac啟動子。
除了蘇氨酸操縱子以外，該創造性細菌菌株的細胞染色體上優選地還含有至少一種編碼天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)的基因。最優選地，本發明中的細胞染色體含有至少一種asd基因，至少一種thrA基因，至少一種thrB基因和至少一種thrC基因。當然該染色體可以含有一種或多種這些基因的多個拷貝。
蘇氨酸脫氫酶(tdh)催化L-蘇氨酸氧化為α-氨基-β-丁酮酸。相應地，在一個特別優選實施方案中，該創造性的細胞的染色體還含有至少一種缺陷型蘇氨酸脫氫酶(tdh)基因。該缺陷型tdh基因可能是一個蘇氨酸脫氫酶表達水平降低的基因，或者是一個編碼與自身蘇氨酸脫氫酶相比活性降低的蘇氨酸脫氫酶突變體的基因。優選地，在該創造性菌株中採用的缺陷型tdh基因不表達蘇氨酸脫氫酶。不表達蘇氨酸脫氫酶的合適的tdh基因的示範性例子包括一種具有插入到tdh基因中的氯黴素乙醯轉移酶(cat)基因的tdh基因，或一種具有插入到tdh基因中的Tn5轉座子的tdh基因，如在美國專利第5,175,107號中所述。
本發明的細菌菌株可以通過任何為本領域的技術人員所熟知和可行的方法和技術加以製備。構建該創造性的細菌菌株合適的方法的示範性例子包括用合適的試劑如NTG進行誘變；通過轉化線性DNA片段和同源重組所介導的基因整合技術；以及由噬菌體P1介導的轉導作用。這些方法在本領域是眾所周知的，也有文獻描述，例如在J.H.Miller的《分子遺傳學實驗》(Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring HarborLaboratory出版社，Cold Spring Harbor,紐約(1972))；J.H.Miller的《細菌遺傳學簡明教程》(A Short Course in Bacterial Genetics,Cold SpringHarbor Laboratory出版社，Cold Spring Harbor，紐約(1992))；M.Singer和P.Berg的《基因與基因組》(Genes Genomes,UniversityScience Books,Mill Valley,California(1991))；J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis的《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，Cold Spring Harbor,紐約(1989))；P.B.Kaufman等的《生物學和醫學的分子和細胞學方法手冊》(Handbook of Molecular and CellularMethods in Biology and Medicine,CRC出版社，Boca Raton,Florida(1995))；B.R.Giick和J.E.Thompson主編的《植物分子生物學和生物技術方法》(Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,CRC出版社,Boca Raton,Florida(1993))以及P.F.Smith-Keary的《大腸桿菌的分子遺傳學》(Molecular Genetics ofEscherichia coli,The Guilford出版社，紐約，NY(1989))。
在本發明的一個特定優選實施方案中，利用P1介導的轉導作用引入蘇氨酸操縱子到大腸桿菌菌株ATCC21277，使生長時需要蘇氨酸的大腸桿菌菌株472T23轉變成蘇氨酸產生菌，大腸桿菌菌株ATCC21277可以從美國典型培養物保藏中心得到(American Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852，美國)。這個thr操縱子包含抗反饋的天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶基因(thrA)，高絲氨酸激酶基因(thrB)和蘇氨酸合酶基因(thrC)。
為了提高該創造性菌株的蘇氨酸產量，可以通過P1轉導作用引入來自大腸桿菌菌株CGSC6945(相關基因型tdh-1::cat1212；來自美國耶魯大學的大腸桿菌基因儲存中心(E.coli Genetic Stock Center,335Osborne Memorial Laboratory，生物系，耶魯大學，New Haven,Connecticut 06520-8104,美國))的缺陷型的蘇氨酸脫氫酶基因。所得到的蘇氨酸產生菌可以通過NTG誘變和/或疏螺旋體素抗性篩選得到進一步改良。
攜帶抗生素抗性標記的質粒，如kan(編碼卡那黴素抗性)，和強啟動子，如PL或tac，可以被構建並用作將所需DNA片段引入染色體的載體，啟動子優選地位於thrA上遊DNA和野生型thrA基因的數百個鹼基對(即不是整個thrA基因)之間。該質粒上的片段可以通過合適的限制性酶消化得到分離並加以純化，再通過轉化或電穿孔法引入到菌株中以去除蘇氨酸操縱子的控制區，再通過同源重組替換成所需的片段，也就是位於thr基因開始處的抗生素抗性標記基因和強啟動子。該片段可通過P1轉導作用再次轉移到疏螺旋體素抗性菌株中。
優選的宿主菌株472T23對異亮氨酸的需求可以消除掉，比如通過P1轉導作用引入該標記基因的野生型等位基因。其它宿主不需要的營養需求可以通過類似的方式，或通過為本領域的技術人員周知的和可行的其它方法得到消除。
本發明的第二個實施方案涉及所述細菌菌株在生產天冬氨酸族胺基酸的發酵方法中的應用。例如，蘇氨酸是通過在合成或天然培養基中培養該創造性的菌株而得到的，培養基中含有至少一種碳源、至少一種氮源以及合適的無機鹽、生長因子等等。
適當的碳源的示範性例子包括，但並不局限於碳水化合物類，如葡萄糖、果糖、蔗糖、澱粉水解物、纖維素水解物和糖蜜；有機酸類，如乙酸、丙酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸和延胡索酸，以及醇類，如甘油。
適當的氮源的示範性例子包括，但並不局限於氨，包括氨氣和液氨；無機或有機酸銨鹽，如氯化銨、磷酸銨、硫酸銨和乙酸銨；以及其它含氮物，包括肉浸出物、腖、玉米漿、酪蛋白水解物、豆餅水解物和酵母浸出物。
經過培養後，培養液中積累的L-蘇氨酸可以根據任何已知的方法分離出來，例如通過利用在美國專利第5,342,766號中描述的離子交換樹脂法。該方法包括首先通過離心去除培養液中的菌體，然後用鹽酸把培養液的pH調節至大約2。酸化液隨後通過一種強酸型陽離子交換樹脂，吸附物用稀釋的液氨洗脫。氨通過真空蒸發除去，濃縮所得溶液。加入乙醇並隨後冷卻得到L-蘇氨酸晶體。
天冬氨酸族的其它胺基酸可以通過與上面詳細描述的方法相似的方法獲得。例如異亮氨酸可以從該創造性的細菌菌株中得到，在該菌株的染色體上或質粒上有一個擴增(amplified)的ilvA基因或tdc基因，這兩個基因都編碼由蘇氨酸到異亮氨酸的生物轉化中的第一個酶蘇氨酸脫氨酶。對該基因的擴增，例如通過使用一種編碼抗反饋酶的ilvA基因，導致異亮氨酸的生物合成增加。
相似地，甲硫氨酸可以通過如大腸桿菌等微生物得到，該菌株在染色體上至少含有一個met操縱子，即metL基因(編碼AKⅡ-HDⅡ)、metA基因(編碼高絲氨酸琥珀醯轉移酶)、metB基因(胱硫醚-γ-合酶)、metC基因(編碼胱硫醚-β-裂解酶)以及metE和metH基因(編碼高絲氨酸甲基化酶)。這些基因，包括其抗反饋變株，以及任選地一種非自身的啟動子，可以根據一種和多種以上討論的一般方法和/或為本領域的技術人員所熟知的方法引入到宿主微生物的染色體上。賴氨酸可以同樣地由微生物得到，該微生物含有編碼賴氨酸生物合成酶的基因(優選地由lysC和/或dapA編碼的抗反饋賴氨酸生物合成酶)以及任選地一種非自身啟動子。
本發明的第三個實施方案涉及抗疏螺旋體素的細菌菌株在L-蘇氨酸生產的發酵方法中的應用。優選地，該疏螺旋體素抗性菌株是大腸桿菌菌株的突變株。這樣的突變株的特定優選實施方案是大腸桿菌菌株kat-13，它於1996年6月28日被保藏於農業研究機構保藏中心(NRRL),1815North University Street,Peoria,Illinois 61604，美國，保藏號NRRL B-21593。
疏螺旋體素抗性可以用為本領域技術人員所熟知並公認的任何一種方法來測定。例如，按照文獻G.Nass和J.Thomale,FEBS Lett,39:182-186(1974)中描述的方法，抗疏螺旋體素的菌株可以通過將候選菌株塗布到含大約139μM疏螺旋體素的最低培養基上分離得到。另外，特定菌株的疏螺旋體素抗性可以表現為一種或多種細胞表型特徵的改變。例如，大腸桿菌菌株6-8的疏螺旋體素抗性突變株及其派生菌株呈圓形，而不是棒狀。在這樣的例子中，表型特徵改變的證據足夠用以鑑別疏螺旋體素抗性菌株。
在本發明的這一實施方案中有用的疏螺旋體素抗性突變株能夠產生蘇氨酸。編碼蘇氨酸生物合成酶的基因可能存在於染色體上或是在質粒中，亦或存在於二者之上。也可能存在這些基因的多重拷貝。優選地，編碼蘇氨酸生物合成酶的基因是抗弱化控制的和/或編碼抗反饋酶。
正如上面所提到的，這些創造性的疏螺旋體素抗性菌株根據需要可以含有一種或多種重組質粒。例如，這些創造性的微生物可以含有編碼蘇氨酸生物合成酶的重組質粒。這些創造性的細菌菌株同樣可以含有編碼其它參與蘇氨酸生物合成的酶，如天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)，或促生長的酶的重組質粒。
另外，疏螺旋體素抗性菌株也可以根據需要加以修飾，例如為了增加蘇氨酸的產量、消除營養需求等等，可以使用為本領域技術人員周知並可行的方法和技術。用於修飾疏螺旋體素抗性大腸桿菌突變株及其變株的合適方法的示範性例子包括，但不局限於利用紫外線或X-射線照射進行誘變；或用化學誘變劑處理，如亞硝基胍(N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍)、甲基甲磺酸、氮芥等；基因整合技術，如由轉化線性DNA片段和同源重組介導的技術；以及由噬菌體如P1介導的轉導作用。這些方法為本領域技術人員周知並有文獻描述，如J.H.Miller的《分子遺傳學實驗》；J.H.Miller的《細菌遺傳學簡明教程》；M.Singer和P.Berg,的《基因與基因組》；J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis的《分子克隆實驗室手冊》；P.B.Kaufman等的《生物學和醫學的分子和細胞學方法手冊》；B.R.Glick和J.E.Thompson主編的《植物分子生物學和生物技術方法》以及P.F.Smith-Keary的《大腸桿菌的分子遺傳學》。
優選地，本發明的疏螺旋體素抗性突變株經過修飾，使得位於編碼蘇氨酸生物合成酶的一種或多種基因的上遊包括一種非自身的啟動子，啟動子與基因可操縱性地相連，而不論這些基因是在染色體上和/或是包含在質粒中。
根據本發明這一實施方案的一個特定優選方式，L-蘇氨酸是通過如上述在合成或天然培養基中培養至少一種疏螺旋體素抗性細菌菌株而得到的，該培養基含有至少一種碳源、至少一種氮源以及合適的無機鹽、生長因子等。積累的蘇氨酸可以用本領域技術人員知道的任何方法加以回收。
下面的例子僅僅是示範性的，並不意在限制由附加權利要求書規定的本發明的範圍。本領域的技術人員將會很清楚，在不背離本發明的精神和範圍的條件下，本發明的方法中可以進行不同的修飾和變化。因此，這意味著本發明涵蓋了這些修飾和變化，只要它們是在附加權利要求書和與其相等的文件的範圍之內。
此處提及的所有專利和出版物都明確地引入作為參考。實施例1大腸桿菌菌株kat-13的製備A、將大腸桿菌菌株ATCC21277的蘇氨酸操縱子轉入大腸桿菌菌株472T23的染色體中大腸桿菌菌株ATCC21277(美國專利第3,580,810號)可以從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,12301parklalon Drive,Rockville,Maryland 20852,美國)得到，它是氨基-β-羥戊酸(AHV)抗性株，但在最低培養基中生長時需要脯氨酸、硫胺素、異亮氨酸和甲硫氨酸。據報導ATCC21277在發酵過程中積累6.20g/L蘇氨酸。ATCC21277的蘇氨酸操縱子包括一種編碼抗反饋酶的天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ基因(thrA)，一種高絲氨酸激酶基因(thrB)和一種蘇氨酸合酶基因(thrC)。
大腸桿菌菌株472T23保藏於USSR抗生素研究所(USSR AntibioticsResearch Institute)的USSR商業微生物保藏中心(USSR Collection ofCommercial Microorganisms)，保藏號為BKIIMB-2307，據報導它在含葡萄糖、氨、維生素B1和礦物鹽的最低培養基中生長時需要蘇氨酸和異亮氨酸。該菌株不能產生蘇氨酸，因為它帶有缺陷的thrC基因，而該基因是蘇氨酸生物合成的必需基因。菌株472T23還帶有缺陷的蘇氨酸脫氨酶基因ilvA，它編碼異亮氨酸生物合成的第一個酶。
將噬菌體培養在ATCC21277上製備噬菌體P1的裂解產物。然後用該P1裂解產物感染菌株472T23，其中少量的噬菌體顆粒攜帶ATCC21277的蘇氨酸操縱子。感染後，通過將細菌塗布在補充0.25g/L異亮氨酸的最低培養基E(葡萄糖0.05g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L，檸檬酸·H2O 2.0g/L,K2HPO410.0g/L,NaHNH4PO4·4H2O 3.5g/L，瓊脂15.0g/L)的瓊脂平板上，篩選合成蘇氨酸的細菌。數株帶有ATCC21277蘇氨酸操縱子的蘇氨酸原養型轉導子如今能夠在僅添加異亮氨酸的最低培養基平板上生長。
這些轉導子是按照下面實施例2的描述，通過搖瓶發酵產生蘇氨酸篩選到的。其中一個產蘇氨酸的轉導子G9被選作進行進一步菌株培育。
B、將帶有插入的氯黴素乙醯轉移酶(cat)基因的缺陷型蘇氨酸脫氫酶(tdh-)基因轉入大腸桿菌菌株G9的染色體中菌株CGSC6945帶有缺陷型蘇氨酸脫氫酶基因(tdh-)，獲自美國耶魯大學的大腸桿菌基因儲存中心(E.coli Genetic Stock Center,335Osborne Memorial Laboratory，生物系，耶魯大學，New Haven,Connecticut 06520-8104，美國))，該蘇氨酸脫氫酶是缺陷的，因為其中插入了氯黴素乙醯轉移酶(cat)基因。為了將這個缺陷基因轉入G9，在CSCG6945上培養P1噬菌體，裂解產物用來感染G9。根據下面實施例2的描述，利用搖瓶發酵篩選到幾株產生蘇氨酸的氯黴素抗性轉導子。其中一株G909的蘇氨酸產量比G9高，被選作進行進一步培育。
C、將一個非自身的啟動子插入到大腸桿菌菌株G909的染色體中為了將tac啟動子轉至G909染色體中，採用了線性DNA片段與一株外切核酸酶Ⅴ陰性的菌株(recD)的染色體之間的同源重組。
線性DNA片段含有1.5kb的蘇氨酸操縱子上遊序列(5＇端)，一個卡那黴素抗性標記，tac啟動子序列和大約480bp的thrA基因。這個提供5＇端同源區、一個選擇性標記(卡那黴素抗性)、一個對蘇氨酸操縱子(tac)的強且可控制的啟動子和3＇端同源區的片段分別是按下述方法產生的。
利用λ克隆676的DNA，將野生型大腸桿菌W3110的蘇氨酸操縱子克隆到質粒pUC19上的限制酶SphⅠ位點上。λ克隆676來自日本的Yuji Kohar博士，分子生物學系，科學院，Nagoya大學，Chikusa-ku,Nagoya，日本)。然後用SphⅠ消化λ克隆676的DNA和pUC19。pUC19片段隨後用蝦鹼性磷酸酶(SAP)去磷酸化並用瓊脂糖凝膠純化。來自λ克隆的6.9kb蘇氨酸操縱子片段也被純化。這兩個片段隨後用T4 DNA連接酶連接成為質粒pAD103。
然後構建了用於同源重組的上遊側翼區和卡那黴素抗性標記。將pAD103用限制性酶BstEⅡ、XbaⅠ消化並用Klenow片段處理形成平端。將只含有蘇氨酸操縱子5＇端(上遊)的1.5kb片段(而不是thr操縱子本身或它的控制區)分離並連接到來自pUC4K(Pharmacia)的卡那黴素抗性基因片段上，pUC4K用限制性酶SalⅠ消化並用Klenow片段處理填補3＇端冗餘而形成中間質粒pAD106。
pAD103也用限制性酶TaqⅠ消化並用Klenow片段處理形成平端，分離含有自身核糖體結合位點以及約480bp的thrA基因編碼序列的片段，然後連接到pKK233-3片段上(Pharmacia)(pKK233-3事先經限制性酶SmaⅠ消化並用SAP去磷酸化)得到質粒pAD115，它含有tac啟動子的DNA序列、核糖體結合位點和thr基因的數百鹼基。
隨後pAD115用限制性酶BamHⅠ消化，將含有所需DNA序列的0.75kb DNA片段分離出來。pAD106也用BamHⅠ消化並用SAP去磷酸化。然後將這兩個片段連接起來形成質粒pAD123，它含有蘇氨酸操縱子的上遊DNA序列、卡那黴素抗性標記基因、tac啟動子和thrA基因起始處大約480bp。
pAD123再用SpeⅠ和BglⅠ消化，將含有所需DNA序列的片段分離出來。
外切核酸酶Ⅴ陰性的菌株(recD)是將P1噬菌體培養在大腸桿菌菌株KW251(相關基因型argA81::Tn10,recD1014；來自Pharmacia)上製備的，該菌株含有recD基因，在argA上插入有一個可共轉導的轉座子Tn10。來自噬菌體的裂解物再用於感染菌株G9，並將四環素抗性的轉導子G9T7分離出來。
將來自質粒pAD123的DNA片段用電穿孔法轉入大腸桿菌G9T7。分離到一株G9T7的抗卡那黴素菌株，將P1噬菌體在該菌株上生長獲得裂解物。P1噬菌體裂解物隨後用於轉導G909。分離到G909的一株卡那黴素抗性轉導子tac3，其在搖瓶研究中存在IPTG時tac3的蘇氨酸產量更高。
隨後再用菌株tac3製備P1噬菌體裂解物並用於感染菌株6-8(如下所述)。篩選出卡那黴素抗性轉導子，並從中分離出一株在搖瓶中比tac3的蘇氨酸產量更高的菌株6-8tac3。
D利用NTG誘變且從大腸桿菌菌株G909和6-8中分離疏螺旋體素抗性突變株按傳統的方法將菌株G909細胞用N-甲基-N』-硝基-N-亞硝基胍(NTG)處理進行誘變(50mg/L,30分鐘，36℃)。將所得細胞塗布在含0.25g/L異亮氨酸和0.1％(v/v)疏螺旋體素的最低培養基E瓊脂平板上。在36℃培養3-5天後，挑選平板上形成的包括菌株6-8的大菌落進行疏螺旋體素抗性和L-蘇氨酸產生試驗。
為試驗疏螺旋體素抗性，每個菌株培養在20mL的種子培養基SM中(含32.5g/L葡萄糖；1g/L MgSO4·7H2O,24.36g/L K2HPO4,9.52g/LKH2PO4,5g/L(NFH4)2SO4,15g/L酵母提取物；pH7.2)36℃振蕩培養17小時。收穫細胞並用最低培養基E洗滌。細胞懸液再接種到含3mL最低培養基E的無菌試管中，管中分別含0、0.1、0.5或1mM疏螺旋體素。36℃振蕩培養24小時後，在660nm測量光密度值以檢測細胞的生長。結果以相對於不含疏螺旋體素的生長量示於下表。
E、去除異亮氨酸需求和乳糖阻遏基因(lacI)通過引入非自身的tac啟動子和抗反饋thrA基因，thr操縱子(thrA、thrB、thrC)的表達不再受到弱化機理的控制。結果，蘇氨酸生產不再需要異亮氨酸飢餓和/或ilvA-營養缺陷型標記的存在。
因此，野生型ilvA標記由轉導引入6-8tac3以補償菌株對異亮氨酸的需求，即消除細胞生長對補加異亮氨酸培養基的需求。來自CGSC7334(相關基因型lacI42::Tn10,lacZU118；來自E.coli Genetic StockCenter,355 Osborne Memorial Laboratory，生物系，耶魯大學，NewHaven,Connecticut 06520-8104,美國)的P1噬菌體裂解物用於感染6-8tac3，篩選出異亮氨酸生物合成陽性的轉導子。在搖瓶試驗中，這些轉導子產生和菌株6-8tac3大約相同數量的L-蘇氨酸。這些轉導子中的一株，即6-8tac3ile+被選作進一步培育。
因為6-8tac3ile的蘇氨酸操縱子處於tac啟動子的控制之下，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)對於誘導細胞完全表達thr操縱子是必需的。然而根據本發明的方法利用IPTG誘導thr操縱子的表達不是優選的。
因此，為了消除這個不必要的調節障礙，通過來自CGSC7334的P1噬菌體感染6-8tac3ile+引入了缺陷型lac阻遏基因(lacI)。產生的轉導子(6-8tac3lacI-)進行了四環素抗性試驗，並篩選出四環素抗性克隆。實施例2蘇氨酸產生的搖瓶發酵研究根據不同的大腸桿菌菌株在搖瓶發酵時的表現，測定了它們在蘇氨酸產生上的差異。供試菌株生長在LB瓊脂培養基上(10g/L胰蛋白腖、5g/L提取物、15g/L瓊脂)。生長1-2天後，將細胞懸浮在5mL種子培養基中(葡萄糖32.5g/L、K2HPO424.35g/L、KH2PO49.5g/L、酵母提取物15g/L、(NH4)2SO425g/L、MgSO4·7H2O 1g/L),pH7.2。種子以250轉/分鐘的攪拌速度，37℃培養24小時。將15mL發酵培養基(含葡萄糖40g/L、酵母提取物2g/L、檸檬酸2g/L、(NH4)2SO425g/L、MgSO4·7H2O 2.8g/L、CaCO320g/L、微量金屬溶液2mL)加到種子中，37℃、攪拌速度250轉/分鐘繼續發酵。培養後，積累在培養液中的L-蘇氨酸的量用HPLC分析(ISCO和2353型泵，Rainin RI-1型分光指數檢測儀，和aminex HP87-CA柱)。
每個試驗菌株產生的蘇氨酸的量示於下表
例3發酵研究本發明的大腸桿菌菌株和它們的前體菌株通過發酵測定L-蘇氨酸產量。
G909按下述條件測試。2L帶擋板搖瓶中裝0.5L液體培養基，其中含30g/L胰蛋白酶水解大豆液和5g/L酵母提取物，接種1.5mLG909並在搖瓶機上200轉/分鐘，35℃培養8.5小時。0.9mL(0.03％)成熟的種子加到含3.0L種子培養基的玻璃發酵罐中(培養基含10g/L d.s.玉米漿，0.4g/L L-異亮氨酸，2.5g/L KH2PO4,2.0g/L MgSO4·7H2O,0.5g/L(NH4)2SO4,0.192g/L無水檸檬酸，0.03g/L FeSO4·7H2O,0.021MnSO4·H2O和80g/L葡萄糖)。培養按如下條件進行前18小時溫度39℃，然後調至37℃；pH6.9(通過補加NH4OH維持)；空氣流量3.5升/分；開始攪拌速度500轉/分鐘，隨後增加攪拌速度維持溶解氧(DO)在20％；反壓1-2psi。以葡萄糖耗盡作為種子罐發酵完成的指示。315mL(15％)種子罐中的成熟種子加到含相同培養基(主發酵罐培養基)的玻璃發酵罐中，培養基與上述相同，除了體積為2.1L並加入0.34g/L L-蘇氨酸。在下列條件下培養48小時溫度37℃，pH6.9(用NH4OH維持)，空氣流量在前20小時為3.5升/分然後增加至4.0升/分，攪拌速度開始為500轉/分鐘，然後增加以維持DO在20％，反壓1-2psi，葡萄糖水平10g/L(通過補加50％w/w葡萄糖溶液維持)。發酵在48小時後結束。G909產生下列結果蘇氨酸終濃度62.3g/L、總產量為274g，得率為23.2％。
tac3在與上述G909相同的條件下測試，除了在主發酵罐期的開始加入1mg/L的IPTG。通過添加IPTG,tac3產生終濃度為85.7g/L的蘇氨酸，總產量為355g，得率為28.8％。
6-8在與上述G909相同的條件下測試。6-8產生下列結果蘇氨酸終濃度為74.1g/L，總產量為290g，得率為28.3％。
6-8tac3在與上述tac3相同的條件下測試，包括添加IPTG。6-8tac3產生下列結果蘇氨酸終濃度為99.3g/L，總產量為421g，得率為35.1％。
6-8tac3ile+在與上述6-8tac3相同的條件下測試，除了在種子罐期或主發酵罐期都不需要L-異亮氨酸。由於在22.5小時時攪拌失敗，只記錄了在22小時的濃度(62g/L蘇氨酸)。
Kat-13在與上述6-8tac3相同的條件測試，除了不加IPTG。在這些條件下，kat-13產生終濃度102g/L蘇氨酸，總產量445g，得率33.1％。
所構建的菌株的相關基因型、蘇氨酸發酵產生所需的添加物和記錄的濃度值示於下表
Bor-R疏螺旋體素抗性ND未進行NA失敗ptacthrABC處於tac啟動子控制之下的thrA、thrB和thrC基因。
權利要求
1.一種用於產生L-蘇氨酸的方法，包括下列步驟(a)在培養基中培養大腸桿菌菌株，以及(b)回收由所述大腸桿菌產生的L-蘇氨酸；其中所述大腸桿菌(ⅰ)在染色體上含有至少一種蘇氨酸(thr)操縱子，它與至少一種非自身啟動子可操縱地相連；以及(ⅱ)不需要任何含有一種或多種編碼一種或多種蘇氨酸生物合成酶基因的重組質粒用於產生蘇氨酸。
2.權利要求1的方法，其中所述大腸桿菌能夠在大約30小時內產生至少約50g/L的L-蘇氨酸。
3.權利要求1的方法，其中所述非自身啟動子選自tac啟動子、lac啟動子、trp啟動子、lpp啟動子、PL啟動子和PR啟動子。
4.權利要求1的方法，其中所述的蘇氨酸操縱子含有一種編碼抗反饋的天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶的基因。
5.根據權利要求1的方法，其中所述的大腸桿菌為菌株kat-13。
6.根據權利要求3的方法，其中所述的非自身啟動子為tac啟動子。
7.根據權利要求1的方法，其中所述的大腸桿菌在染色體上含有一種缺陷型蘇氨酸脫氫酶基因。
8.權利要求1的方法，其中所述的蘇氨酸操縱子獲自ATCC 21277。
9.權利要求1的方法，其中所述的大腸桿菌為疏螺旋體素抗性。
10.一種製備大腸桿菌胺基酸產生菌株的方法，該菌株不帶有編碼一種或多種該胺基酸生物合成酶基因的重組質粒，該方法包括以下步驟(a)將遺傳物質從一種胺基酸產生菌引入到一種大腸桿菌菌株的染色體中；(b)將非自身啟動子在胺基酸生物合成基因的染色體位置之前插入到所述染色體中，並與該生物合成基因可操縱地相連以控制其表達；以及(c)選擇性地從所述染色體上去除胺基酸生物合成的調控障礙和/或營養需求。
11.一種微生物大腸桿菌的菌株，具有下列特徵(ⅰ)它的染色體含有至少一種蘇氨酸(thr)操縱子，其與至少一種非自身啟動子可操縱地相連，以及(ⅱ)不需要任何含有一種或多種編碼一種或多種蘇氨酸生物合成酶基因的重組質粒用於產生蘇氨酸。
12.權利要求11的菌株，其中所述的蘇氨酸操縱子含有一種抗反饋的天冬氨酸激酶Ⅰ-高絲氨酸脫氫酶Ⅰ基因(thrA)、一種高絲氨酸激酶(thrB)基因、一種蘇氨酸合酶基因(thrC)。
13.權利要求11的菌株，其中所述的大腸桿菌為菌株kat-13。
14.根據權利要求11的菌株，其中所述的非自身啟動子為tac啟動子。
15.權利要求11的菌株，其中所述的大腸桿菌在染色體上含有一種缺陷型蘇氨酸脫氫酶基因。
16.權利要求11的菌株，其中所述的蘇氨酸操縱子來自ATCC 21277。
17.權利要求11的菌株，其中所述的大腸桿菌為疏螺旋體素抗性。
18.權利要求11的菌株，其中所述的大腸桿菌具有菌株NRRL B-21593的特徵。
19.一種產生L-蘇氨酸的方法，它包括以下步驟(a)在培養基中培養疏螺旋體素抗性的大腸桿菌菌株，以及(b)回收由該大腸桿菌產生的L-蘇氨酸。
20.權利要求19的方法，其中所述的大腸桿菌能夠在大約30小時內產生至少約50g/L的L-蘇氨酸。
21.權利要求19的方法，其中所述的大腸桿菌含有至少一種蘇氨酸(thr)操縱子，其與至少一種非自身啟動子可操縱地相連。
22.權利要求21的方法，其中所述的蘇氨酸操縱子含有一種編碼抗反饋的天冬氨酸激酶-高絲氨酸脫氫酶的基因。
23.根據權利要求19的方法，其中所述的大腸桿菌為菌株kat-13。
24.根據權利要求21的方法，其中所述的非自身啟動子為tac啟動子。
全文摘要
本發明涉及大腸桿菌的新菌株和利用這些新菌株的發酵方法。本發明尤其涉及經基因修飾的大腸桿菌菌株和它們在胺基酸特別是天冬氨酸族胺基酸成員,如蘇氨酸生產中的應用。本發明還涉及用於胺基酸發酵生產的大腸桿菌菌株的製備方法。
文檔編號C12N1/21GK1226931SQ97196897
公開日1999年8月25日 申請日期1997年7月30日 優先權日1996年7月30日
發明者M－D·王, J·S·布拉德沙瓦, S·L·斯維舍, H·J·利奧, P·D·哈克, T·P·賓德爾 申請人:阿徹-丹尼爾斯-米德蘭公司