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產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82的製作方法

2023-10-09 09:34:39 1

產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種黃海海水分離篩選得到的高產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82,是芽孢桿菌屬的Bacillus的新菌種,該菌株保藏於CCTCC,保藏號為CCTCCNo:M2013155,環狀糊精葡萄糖基轉移酶活性達1600U/ml,將在食品、醫藥、農藥和環保等領域有著廣泛應用。
【專利說明】產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82

【技術領域】
[0001]本發明涉及海洋微生物領域,特別是涉及從黃海海水中分離篩選出高產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82及其產生的環狀糊精葡萄糖基轉移酶。

【背景技術】
[0002]環糊精(Cyclodextrin, CD)是由6個或更多的D-吡喃型葡萄糖單元通過a-(1-4)-糖苷鍵連接而成的環狀低聚糖。根據環中D-吡喃型葡萄糖單元數目的不同,環糊精可分為許多種,其中分別由6、7和8個葡萄糖單元組成的α-、β-和Y-環糊精最為常見,也稱之為基礎環糊精。除了基礎環糊精外,還有比較少見的分別由9、10、11和12個葡萄糖單元組成的δ-、ξ-、ζ-和η-環糊精。環糊精具有圓筒形空心結構,可容納化合物分子。其空腔外表面具有親水性,內表面卻具有疏水性,這一特性使得環糊精及其衍生物在食品、醫藥、農藥和環保等領域廣泛用作添加劑或包埋材料,其中尤以β_環糊精的應用最為廣泛。目前我國環糊精的實際產量約有4萬噸左右,其中90%的產量被用於其他工業用途,如食品行業中作為稠化劑、紡織工業用輔料和香妝品工業等等。而環糊精更具有開發前景的用途是作為藥物分子的包埋劑,可將一些難溶藥物加工成可溶性藥物製劑。
[0003]環狀糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)可作用於澱粉類物質產生⑶,目前主要應用軟化芽孢桿菌、嗜熱脂肪桿菌、巨大芽孢桿菌、環狀芽孢桿菌、嗜鹼芽孢桿菌等微生物在嚴格控制的條件下進行液體深層發酵來製備。我國CD的生產和應用史已有30多年,但CGTase生產菌種的酶產量不理想,導致了 CD的生產成本過高而應用受到限制。因此,選育CGTase高產菌是我國酶製劑研究的一項重要任務。
[0004]隨著海洋生物技術的發展,人們意識到開發海洋資源的重要性。海洋微生物為適應海洋各種極端環境,其產生的酶表現出獨特的生理功能與酶學特性,比來自陸源微生物的酶更具開發應用潛力,越來越引起世界各國的重視,爭相開發、尋找具有全新性質的酶已成為國際酶製劑研究的熱點。


【發明內容】

[0005]本發明的目的在於尋找生存在自然環境中特別是在極端環境條件下高產高活性環狀糊精葡萄糖基轉移酶的微生物,經發明人廣泛深入開發研究,在對黃海海水中微生物進行分離篩選基礎上,獲得一株具有高效催化能力的高產高活性環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株Bacillussp.cd82 (簡稱菌株cd82)。
[0006]本發明提供的高產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82是從黃海海水中分離篩選獲得的高產高活性環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株,根據海洋微生物菌株 cd82 的 16SrDNA 序列相似性比對,cd82 的 16SrDNA 與 Bacillusalkalitolerans有99%的同源性。菌株cd82的GenBanK登錄號為KC928273,鑑定確定為芽孢桿菌屬的細菌,是Bacillus的新菌株。該高產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株Bacillussp.cd82於2013年4月23日保藏在中國典型培養物保藏中心,保藏號:CCTCCNo:M2013155。
[0007]菌株cd82的篩選
[0008]初篩:取1ml水樣,加入到90ml無菌水中進行梯度稀釋,取30 μ 110'10'10'10_5的懸液塗布基礎培養基(所述基礎培養基(Wt):蛋白腖1%,牛肉膏1%,葡萄糖1%,NaCl0.5%,固體另加2%瓊脂,調至ρΗ7.0,115°C高壓蒸汽滅菌30min)平板中,35°C培養箱中靜止培養24h;固體篩選平板分為8個小格,把基礎培養基平板上形態大小不同的單菌落依次挑取點接入小格中,30°C培養箱篩選用培養基中培養24h後觀察透明圈的大小(所述篩選用培養基(g/L):可溶性澱粉10g,蛋白腖5g,酵母膏5g,K2HPO4Ig, MgSO4.7Η200.2g,Na2C035g,酚酞0.3g,甲基橙0.lg,瓊脂15g,121°C滅菌15min,自然pH值。環狀糊精與甲基橙和酚酞染料反應形成複合物,可在培養基平板上出現黃色透明圈,將黃色透明圈較大的菌落反覆傳代培養,直至獲得純培養菌株,接種於基礎培養基斜面內,4°C冰箱保存。
[0009]復篩:分別取一環初篩保存的菌接入含有3ml基礎培養液的試管中進行活化,35°C、200r/min振蕩培養18h,取此培養液Iml轉接入裝有25ml發酵培養基(所述發酵培養基(g/L):可溶性澱粉 4.5g,蛋白腖 3.9g,酵母膏 4.2g,K2HPO40.8g,MgSO4.7H200.3g,Na2CO30.3g,pH7.0,121°C滅菌15min)的250ml三角燒瓶中,同樣條件下培養
[0010]72h。發酵液1000rpm離心3min,取上清測定酶活大小,通過酶活測定最終分離到產環狀糊精葡萄糖基轉移酶,酶活高且穩定性好的菌株cd82。
[0011]本發明提供的高產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82的形態與生理生化特徵為:
[0012]形態特徵:柱狀芽孢桿菌,長2.5-5 μ m,寬0.7-1 μ m,橢圓芽孢次端生。
[0013]培養特徵:在基礎培養基(wt)蛋白腖1%,牛肉膏1%,葡萄糖1%,NaCl0.5%,固體另加2%瓊脂,調至pH7.0)中,4°C~50°C的溫度下生長,其最適生長溫度範圍為30°C~40°C,生長pH範圍為pH6~11,培養24h的菌落圓形、全緣、扁平,直徑1.9-3.2mm,白色半透明。
[0014]生理生化特徵:卵磷脂酶陽性、纖維素酶陽性、V-P陰性;可利用木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇,產酸為發酵型糖代謝;可以水解澱粉;能夠利用檸檬酸鹽,好氧,無尿酶活性。
[0015]本發明提供的高產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82的16srDNA全序列(GenBanK登錄號為KC928273)如圖1,全長為1551bp。,

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1海洋微生物菌株cd82的16s rDNA全序列

【具體實施方式】
[0017]本發明用下列實施例來進一步說明本發明,但本發明的保護範圍並不限於下列實施例。
[0018]實施例
[0019]I)、菌株cd82的篩選
[0020]取1ml水樣,加入到90ml無菌水中進行梯度稀釋,取30 μ 110'10'10'10-5的懸液塗布基礎培養基(所述基礎培養基(wt):蛋白腖1%,牛肉膏1%,葡萄糖1%,NaCl0.5%,固體另加2%瓊脂,調至ρΗ7.0,115°C高壓蒸汽滅菌30min。)平板中,30°C培養箱篩選用培養基中(所述篩選用培養基(g/L):可溶性澱粉10g,蛋白腖5g,酵母膏5g,K2HPO4Ig,MgSO4.7Η200.2g,Na2C035g,酚酞 0.3g,甲基橙 0.lg,瓊脂 15g,121°C滅菌 15min,自然 pH 值。環狀糊精與甲基橙和酚酞染料反應形成複合物,可在培養基平板上出現黃色透明圈)靜止培養24h ;固體篩選平板分為8個小格,把基礎培養
[0021]基平板上形態大小不同的單菌落依次挑取點接入小格中,30°C培養箱中培養24h後觀察
[0022]透明圈的大小;將透明圈較大的菌落反覆傳代培養,直至獲得純培養菌株,接種於基礎培養基斜面內,4°C冰箱保存。分別取一環初篩保存的菌接入含有3ml基礎培養液的試管中進行活化,30°C、200r/min振蕩培養18h,取此培養液Iml轉接入裝有25ml發酵培養基(所述產酶(發酵)培養基(g/L):可溶性澱粉4.5g,蛋白腖3.9g,酵母膏4.2g, K2HPO40.8g,MgSO4.7Η200.3g,Na2CO30.3g,pH7.0,121°C滅菌 15min)的 250ml 三角燒瓶中,同樣條件下培養48h。發酵液1000rpm離心3min,取上清測定酶活大小,通過酶活測定最終分離到產環狀糊精葡萄糖基轉移酶酶活高且穩定性好的菌株cd82。
[0023]2)、海洋微生物菌株cd82的形態與生理生化特徵為:
[0024]形態特徵:柱狀芽孢桿菌,長2.5-5 μ m,寬0.7-1 μ m,橢圓芽孢次端生。
[0025]培養特徵:在基礎培養基(wt)(蛋白腖1%,牛肉膏1%,葡萄糖1%,NaCl0.5%,固體另加2%瓊脂,調至pH7.0)中,4°C~50°C的溫度下生長,其最適生長溫度範圍為30°C~40°C,生長pH範圍為pH6~11,培養24h的菌落圓形、全緣、扁平,直徑1.9-3.2mm,白色半透明。
[0026]生理生化特徵:卵磷脂酶陽性、纖維素酶陽性、V-P陰性;可利用木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露醇,產酸為發酵型糖代謝;可以水解澱粉;能夠利用檸檬酸鹽,好氧,無尿酶活性。
[0027] 3)、海洋微生物菌株cd82的16srDNA全序列(GenBanK登錄號為KC928273)如圖1o
【權利要求】
1.一種產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82,其特徵在於是從黃海海水中分離獲得的高產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株Bacillussp.cd82,是芽孢桿菌屬的Bacillus的新菌株,該菌株菌落圓形、全緣、扁平,直徑1.9-3.2mm,白色半透明,為柱狀芽孢桿菌,長2.5-5 μ m,寬0.7-1 μ m,橢圓芽孢次端生,保藏在中國典型培養物保藏中心,保藏號為CCTCCNo:M2013155;該菌株cd8216srDNA全序列如圖1,全長為1551bp。
2.根據權利要求1的產環狀糊精葡萄糖基轉移酶的海洋微生物菌株cd82產生的環狀糊精葡萄糖基轉移 酶。
【文檔編號】C12N1/20GK104130955SQ201310161167
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年5月3日 優先權日:2013年5月3日
【發明者】孫謐, 郝建華, 劉均忠 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所

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