紅景天愈傷組織培養方法

2023-08-05 23:48:21

專利名稱：：紅景天愈傷組織培養方法
技術領域：
：本發明屬於植物組織培養
技術領域：
，具體涉及一種紅景天愈傷組織培養方法。
背景技術：
：高山紅景天(RhodiolasachalinensisA.Bor)又叫庫頁紅景天，為景天科(Crassulaceae)紅景天屬(RhodiolaL.)多年生草本或亞灌木植物，是一種瀕危珍稀藥用植物，也是一種很有發展前途的環境適應性藥物。我國已有悠久的紅景天應用歷史。20世紀60年代起，紅景天開始得到前蘇聯科學家的極大重視，現代藥理學研究表明，紅景天具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗輻射等功效，是一種具有良好發展前途的環境適應性藥物。目前紅景天由於其自然生存環境惡劣，生長緩慢且年產量低，加上紅景天需求量的日益增大，使得原本就稀少的野生資源受到了前所未有的威脅。大量無限制的開發利用將使得紅景天這一瀕稀藥用植物物種近於滅絕，紅景天產區的生態環境不斷惡化。目前高山紅景天的細胞培養主要集中在愈傷組織誘導、基本培養條件篩選和理化因子的考查等方面，還沒有非生物誘導子對紅景天苷生物合成的調控以及代謝途徑關鍵酶做系統研究。國內外已上市的紅景天類保健品及藥品均為天然提取的紅景天製劑，由於其具有很高的藥用價值，深受患者喜愛。然而由於其成分複雜，有效成分含量低，大大影響了該藥的臨床療效以及市場的進一步擴大。特別是天然紅景天已作為瀕臨滅絕的植物種受到世界以及我國政府的重點保護，嚴禁採摘。為此研究紅景天的替代產品，特別是如何提高紅景天中紅景天苷的含量顯得十分重要。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種繁殖速度快，紅景天苷含量高的紅景天愈傷組織培養方法。本發明的目的是這樣實現的一種紅景天愈傷組織培養方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理選擇68月份海拔2500m以上的野生高山紅景天新鮮植株，取其幼莖及葉片進行清洗和無菌處理，制的0.30.5cm2大小的紅景天組織；b、愈傷組織誘導培養將經過無菌處理後的紅景天組織在誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，培養時間124天，培養溫度1030。C，光照時間024小時/天，光照強度0100iimo1/m2s;所述的誘導培養基為基本培養基MS+蔗糖050g/L+瓊脂010g/L+a-萘乙酸0.15.Omg/L+6-節氨基嘌呤0.15.0mg/L+硝普鈉SNP1080iimol/L+硝酸銀AgN031080iimol/L，pH值為5.07.0;c、大規模培養選取經過誘導培養產生的紫紅色愈傷組織，在大規模培養基中進行大規模培養，培養時間1024天，培養溫度103(TC，光照時間024小時/天，光照強度03100iimol/m2s;所述的大規模培養基為基本培養基MS+蔗糖050g/L+瓊脂010g/L+a-萘乙酸0.15.Omg/L+6-節氨基嘌呤0.15.Omg/L+硝普鈉SNP1080iimol/L+硝酸銀AgN031080iimol/L，pH值為5.07.0。作為本發明紅景天愈傷組織培養方法更優化的技術方案，對培養基的配方比例和培養條件進行優化選擇。所述的愈傷組織誘導培養培養時間1020天，培養溫度2025。C，光照時間816小時/天，光照強度5080iimol/m2*s;基本培養基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-節氨基嘌呤2.03.0mg/L+硝普鈉SNP4060iimol/L+硝酸銀AgN034060iimol/L，pH值為5.56.5;所述的大規模培養培養時間1220天，培養溫度2025。C，光照時間816小時/天，光照強度5080iimol/m2s;基本培養基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-苄氨基嘌呤2.03.Omg/L+硝普鈉SNP4060iimo1/L+硝酸銀AgN034060iimol/L，pH值為5.56.5。在誘導培養基中加入非生物誘導子是本發明的重點內容，其中所述的非生物誘導子包括硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03。非生物誘導子硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03的製備方法是將硝普鈉SNP用二甲基亞碸匿SO溶解，經0.22m濾膜過濾制的一氧化氮NO的供體；將AgN03用蒸餾水溶解經0.22iim濾膜過濾制的AgN03誘導子。非生物誘導子可以直接加入到誘導培養基中，也可以在愈傷組織誘導培養過程的不同時期添加到培養基中。植物體的的無菌處理是本發明的技術環節，無菌處理的方法包括如下步驟a)將選取的植物體用水清洗泥土，再浸泡於蒸餾水中；b)將清洗的植物體用7080%的酒精浸泡1020秒進行表面滅菌；c)將經過酒精滅菌的植物體置於0.050.2%氯化汞溶液中浸泡36分鐘，浸泡過程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經過氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗36遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗乾淨，再將植物體用無菌濾紙吸乾水分；e)用無菌剪刀將葉片剪成0.30.5cm2大小，無菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種於誘導培養基中培養。本發明的優點在於該方法易操作，有效成分含量高，生產成本低，不汙染環境，可以實現批量生產。用本發明方法培養技術生產紅景天苷，不變性、含量高、成本低、周期短、極具市場競爭力。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。實施例1:一種紅景天愈傷組織培養方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理a)選擇7月份海拔2500m以上的野生高山紅景天新鮮植株，用水清洗泥土，再浸泡於蒸餾水中，置於超淨工作檯內待用；b)將清洗的植物體取出放入無菌空瓶，用75%的酒精浸泡15秒進行表面滅菌；c)將經過酒精滅菌的植物體置於0.1%氯化汞溶液中浸泡5分鐘，浸泡過程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經過氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗5遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗乾淨，再將植物體用無菌濾紙吸乾水分；e)用無菌剪刀將葉片剪成O.30.5cm2大小，無菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種於誘導培養基中培養；b、愈傷組織誘導培養將經過無菌處理後的紅景天組織在誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，培養時間12天，培養溫度22t:，光照時間6小時/天，光照強度50mol/m2s;所述的誘導培養基為基本培養基MS+蔗糖18g/L+瓊脂5g/L+a-萘乙酸3mg/L+6_苄氨基嘌呤3mg/L+石肖普納SNP20iimol/L+石肖酸銀AgN0330iimol/L，pH值為6;其中，硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03是非生物誘導子，非生物誘導子的製備方法是將硝普鈉SNP用二甲基亞碸匿SO溶解，經0.22m濾膜過濾制的一氧化氮NO的供體，將AgN03用蒸餾水溶解經0.22m濾膜過濾制的AgN03誘導子；將製得的兩種非生物誘導子直接加入到滅菌後的培養基中；c、大規模培養選取經過誘導培養產生的紫紅色愈傷組織，在大規模培養基中進行大規模培養，培養時間18天，培養溫度22t:，光照時間6小時/天，光照強度40iimol/m2s;所述的大規模培養基為基本培養基MS+蔗糖15g/L+瓊脂4.5g/L+a-萘乙酸3!^/1+6-苄氨基嘌呤4mg/L+硝普鈉SNP40iimol/L+硝酸銀AgN0350iimol/L，pH值為6。實施例2:—種紅景天愈傷組織培養方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理a)選擇8月份海拔2500m以上的野生高山紅景天新鮮植株，用水清洗泥土，再浸泡於蒸餾水中，置於超淨工作檯內待用；b)將清洗的植物體取出放入無菌空瓶，用75%酒精中浸泡15秒進行表面滅菌；c)將經過酒精滅菌的植物體置於0.1%氯化汞溶液中浸泡5分鐘，浸泡過程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經過氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗5遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗乾淨，再將植物體用無菌濾紙吸乾水分；e)用無菌剪刀將葉片剪成O.30.5cm2大小，無菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種於誘導培養基中培養；b、愈傷組織誘導培養將經過無菌處理後的紅景天組織在誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，培養時間8天，培養溫度2(TC，光照時間8小時/天，光照強度40Pmol/m2S;所述的誘導培養基為基本培養基MS+蔗糖20g/L+瓊脂4.5g/L+a-萘乙酸2mg/L+6_苄氨基嘌呤2mg/L+石肖普納SNP30iimol/L+石肖酸銀AgN0340iimol/L，pH值為6;其中，硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03是非生物誘導子，非生物誘導子的製備方法是將硝普鈉SNP用二甲基亞碸匿SO溶解，經0.22m濾膜過濾制的一氧化氮NO的供體，在第6天加入到培養基中；將AgN03用蒸餾水溶解經0.22m濾膜過濾制的AgN03誘導子，在第7天加入到培養基中；c、大規模培養選取經過誘導培養產生的紫紅色愈傷組織，在大規模培養基中進行大規模培養，培養時間20天，培養溫度23°C，光照時間8小時/天，光照強度50mol/m2s;所述的5大規模培養基為基本培養基MS+蔗糖20g/L+瓊脂4g/L+a-萘乙酸4!^/1+6-苄氨基嘌呤3mg/L+石肖普納SNP45iimol/L+石肖酸銀AgN0355iimol/L，pH值為6。實施例3:對野生紅景天、實施例1和實施例2培養得到的愈傷組織進行檢測。運用HPLC色譜檢測法在色譜柱為DiamonsilODSC-18烷基矽膠柱、流動相為4.6mmX250mm、甲醇水為1:2035:100、紫外檢測波長為275nm、柱溫為104(TC、進樣量為15y1、流速為0.12.0m1/分鐘的條件下檢測紅景天苷的含量。檢測方法包括如下步驟a)紅景天苷標準溶液的配製紅景天苷標準品購自遼寧省藥檢所(編號110818)。精密稱取紅景天苷標準品5.Omg於10ml容量瓶中，流動相溶解，配成0.5mg/L的對照品儲備液；b)紅景天苷標準曲線的繪製分別吸取上述儲備液O.25、0.50、1.00、1.50、2.00、3.OOml置於5ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，取稀釋液各5iU進樣。以紅景天苷濃度(C)對峰面積(A)做線性回歸。回歸方程為C=AX7X10-7+0.004，R2=0.9993;c)紅景天苷含量檢測乾燥至恆重的細胞粉末，過三號篩(50目)後，稱取0.lg，用10ml蒸餾水浸提24小時，超聲30分鐘，4000rpm離心15分鐘，移出上清，濾渣再加10ml蒸餾水超聲30分鐘，4000rpm離心15分鐘，移出上清，將兩次上清合併，定容至25ml。從中取10ml提取液於6(TC下蒸乾水分，再用2ml流動相溶解，過O.45Pm濾膜後，再用高效液相色譜法(HPLC)進行含量測定。所得供試品分別於0小時、2小時、4小時、7小時進樣，讀取峰面積，計算RSD。通過代入標準曲線計算樣品紅景天苷的含量。表一不同形態愈傷細胞生長和紅景天苷含量比較接種量愈傷組織鮮比生長速率紅景天苷含量愈傷組織形態，(gFW/瓶)重(g/瓶)(cT1)(mg/g)綠色鬆軟1.02.610.0642.02紫紅色緻密1.03.570.0858.81黃色鬆軟1.02.920.0711.25由表一可知本方法培育出的紅景天不同形態愈傷細胞生長量和紅景天苷含量紫紅色緻密的愈傷組織最好。表二野生高山紅景天與高山紅景天培養物兩個實施例樣品中紅景天苷產量的比較tableseeoriginaldocumentpage7由表二可知本方法培育出的紅景天的紅景天苷含量明顯高於野生高山紅景天c權利要求一種紅景天愈傷組織培養方法，它包括如下步驟a、植物體的選擇及無菌處理選擇6～8月份海拔2500m以上的野生高山紅景天新鮮植株，取其幼莖及葉片進行清洗和無菌處理，制的0.3～0.5cm2大小的紅景天組織；b、愈傷組織誘導培養將經過無菌處理後的紅景天組織在誘導培養基中進行愈傷組織誘導培養，培養時間1～24天，培養溫度10～30℃，光照時間0～24小時/天，光照強度0～100μmol/m2·s；所述的誘導培養基為基本培養基MS+蔗糖0～50g/L+瓊脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L+硝普鈉SNP10～80μmol/L+硝酸銀AgNO310～80μmol/L，pH值為5.0～7.0；c、大規模培養選取經過誘導培養產生的紫紅色愈傷組織，在大規模培養基中進行大規模培養，培養時間10～24天，培養溫度10～30℃，光照時間0～24小時/天，光照強度0～100μmol/m2·s；所述的大規模培養基為基本培養基MS+蔗糖0～50g/L+瓊脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L+硝普鈉SNP10～80μmol/L+硝酸銀AgNO310～80μmol/L，pH值為5.0～7.0。2.按照權利要求1所述的紅景天愈傷組織培養方法，其特徵在於所述的愈傷組織誘導培養培養時間1020天，培養溫度2025。C，光照時間816小時/天，光照強度5080iimol/m2*s;基本培養基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-節氨基嘌呤2.03.0mg/L+硝普鈉SNP4060iimol/L+硝酸銀AgN034060iimol/L，pH值為5.56.5;所述的大規模培養培養時間1220天，培養溫度2025°C，光照時間816小時/天，光照強度5080iimol/m2s;基本培養基MS+蔗糖2030g/L+瓊脂46g/L+a-萘乙酸2.03.Omg/L+6-節氨基嘌呤2.03.0mg/L+硝普鈉SNP1080iimol/L+石肖酸銀AgN031080iimol/L，pH值為5.56.5。3.按照權利要求1或2所述的紅景天愈傷組織培養方法，其特徵在於非生物誘導子硝普鈉SNP和硝酸銀AgN03的製備方法是將硝普鈉SNP用二甲基亞碸匿S0溶解，經0.22iim濾膜過濾制的一氧化氮NO的供體；將AgN03用蒸餾水溶解經0.22ym濾膜過濾制的Ag冊3誘導子。4.按照權利要求1或2所述的紅景天愈傷組織培養方法，其特徵在於植物體的無菌處理方法包括如下步驟a)將選取的植物體用水清洗泥土，再浸泡於蒸餾水中；b)將清洗的植物體用7080%的酒精浸泡1020秒進行表面滅菌；c)將經過酒精滅菌的植物體置於0.050.2%氯化滎溶液中浸泡36分鐘，浸泡過程中不斷輕輕攪拌使植物體表面充分接觸到氯化汞溶液；d)將經過氯化汞溶液浸泡滅菌的植物體用高溫滅菌處理的蒸餾水漂洗36遍，將植物體表面粘附的氯化汞溶液漂洗乾淨，再將植物體用無菌濾紙吸乾水分；e)用無菌剪刀將葉片剪成0.30.5cm2大小，無菌條件下，將上述表面滅菌處理的材料，每瓶接種5塊接種於誘導培養基中培養。全文摘要本發明公開了一種紅景天愈傷組織培養方法，它包括如下步驟植物體的選擇及無菌處理、愈傷組織誘導培養和大規模培養三個環節，其核心技術是愈傷組織誘導培養，是在基本培養基MS+蔗糖0～50g/L+瓊脂0～10g/L+α-萘乙酸0.1～5.0mg/L+6-苄氨基嘌呤0.1～5.0mg/L的基礎上，加入非生物誘導子硝普鈉SNP和硝酸銀AgNO3，其中硝普鈉SNP10～80μmol/L+硝酸銀AgNO310～80μmol/L。該方法易操作，有效成分含量高，生產成本低，不汙染環境，可達到產業化水平。用本發明方法培養技術生產紅景天苷，不變性、含量高、成本低、周期短、極具市場競爭力。文檔編號A01H4/00GK101773070SQ20101000076公開日2010年7月14日申請日期2010年1月19日優先權日2010年1月19日發明者賈景明申請人:煙臺匯鵬生物科技有限公司