用於物質分級的裝置和分級方法與流程

2023-08-05 23:07:16

本發明涉及用於分級分散流體(dispersingfluid)中的物質、尤其是生物材料的裝置；本發明還涉及分散流體中的這些有機或無機物質、特別是微小物質、生物材料等的分級方法。

背景技術：

從現有已知用於彌散物質和顆粒的分級的裝置。特別地，這些裝置能夠用於分級諸如細胞樣品等的生物材料。在這種情況下，顆粒能夠為單細胞或細胞的集群，還彼此不同。

儘管分級裝置能夠用於任何類型的生物材料，但是對使用該裝置來選擇和離析幹細胞存在濃厚的興趣。因此，在以下公共區域的不同分級方法和裝置中，與生物材料和幹細胞相關。

待分離的生物原始細胞樣品是由以附著(附著於基體或支架)或以懸浮在生理流體中的方式生長的不同細胞種類構成的異質性細胞群的等價物。從原始樣品能夠首先獲得以附著於塑料基體的方式培養生長的附著細胞和以分散在分散流體中的方式培養生長的其它懸浮種類。特別地，間充質幹細胞被視作附著細胞，而其它懸浮種類是如血細胞、淋巴細胞、紅細胞、和腫瘤細胞等的細胞。

幹細胞是致力於通過置換損傷的成熟細胞來維持組織的功能和結構完整性的「原始」細胞。幹細胞可以依據其分化成不同種類的組織的能力不同(「潛能」的程度不同)以及在似乎將成為醫學未來的再生醫學中的巨大前景來區分。

簡化來自實際來源的複雜且異質的樣品的可行性以及再利用廢棄組織(作為脂肪組織和新生組織)的機會，基於從再生醫學到診斷等不同應用目的而得到不同細胞類型的亞群，通常是具挑戰性的。近年來，因用作細胞藥物的潛能而特別關注了作為診斷領域的生物標誌物的腫瘤細胞、以及幹細胞和血細胞(特別是外周血)。

幹細胞分布在所有組織中，它們主要存在於包括骨髓、牙髓、脂肪組織、外周血、臍帶和胎膜等來源，幹細胞可以從中選擇，但它們在組織中的定位並不明確，且無法在從更加分化且源於幹細胞的所有不同細胞離析的特定區域內識別。目前，利用識別膜抗原的存在的免疫標記(immunolabeling)技術或通過基因選擇技術來進行人幹細胞的選擇/富集。然而，免疫標記可損傷幹細胞或誘導它們進入不期望的分化進程，並且免疫標記被認為是"硬"細胞分選技術，這是因為其無法滿足關於並非將分析細胞用於研究而是出於醫學和臨床目的而使用的最小限度操作的規定。

此外，基因選擇需要細胞的遺傳修飾，該遺傳修飾具有針對分選細胞的體內再利用的已知相關問題。基因選擇也是昂貴的且顯示長的操作時間。

能夠分化成任何種類的細胞和組織的全能幹細胞的第一來源是胚胎。儘管如此，來自人胚胎的全能幹細胞的實驗和使用在某些國家(如在義大利，由於2005年6月的公投結果)是被禁止的，而許多其他國家也受到強制立法的嚴令禁止或者生物倫理考量的阻撓(如其他歐洲國家或美國)。

多能幹細胞，在全能幹細胞之後，是最具「生活力」的，例如能夠專用於各種組織中的存在於幾乎所有人體組織中的間充質幹細胞。

胚胎以外來源的多能幹細胞的低可用性要求使用有效技術用於它們的選擇/富集，以便獲得充足的細胞數目用以進一步的應用。

多能幹細胞不能通過涉及使用特定標誌物的直接免疫標記或通過細胞選擇技術來選擇/富集，這些方法諸如含有免疫塗布的磁珠的流式細胞術中的流式輔助細胞分選(facs)或磁性輔助細胞分選(macs)，這是因為這些方法的選擇是基於細胞分化性質特有的免疫學標誌物(免疫標誌物)的識別，且隨著幹細胞能力等級的增加而難以識別。出於這些原因，尚不存在能夠毫無疑問地識別間充質細胞的一整套標誌物。

一般而言，間充質幹細胞為表達非常廣泛的且多樣化的表面抗原組的多能細胞，其阻礙了通過直接免疫標記法基於表型特性的準確區分(w.wagner等，experimentalhematology33(2005)1402-1416)。

facs和macs技術也可對分選的間充質幹細胞造成生理負擔，活細胞的回收相對低，再生和生長的能力低，以及分化能力也不同，進而與期望的分化途徑偏離，這會導致不期望的組織和癌組織形成。

採用針對非間充質幹細胞的細胞的免疫標誌物的"負"選擇技術將用於從整個細胞群中排除msc。該技術無法絕對保證在去除群體內靶細胞的存在，這是因為其並未特異性標記因而無法結合到特定的標誌物。這種去除，因其非特異性(aspecificity)，也無法區分屬於同一家族的間充質細胞亞群，並且不能區分不同來源的群體之間或同一來源的亞群之間的可能差異。

間充質幹細胞也通過基因選擇過程(基因轉移技術，gtt)進行分選，其在成本和執行時間方面耗費人力且昂貴，需要高度專業化的人員和細胞的遺傳修飾。

然而，現有技術代表了細胞選擇的兩極：極特異意味著低的細胞回收，而非特異則意味著細胞表徵的缺乏。

關於生物材料的分級與選擇，由於細胞操作、缺乏對通過去除技術離析的細胞群體組成的保證、不可能分離由多個群體構成的複合體或原始樣品等，分離/富集的問題仍待解決。在附著條件下生長的生物材料的分離/富集甚至更加成問題，例如多能幹細胞的樣品，特別是人多能幹細胞的樣品，例如是通過相對簡單的方法(其並不涉及細胞的改變或對其造成負擔，不太貴，也由具備普通專業技能的實驗人員來操作)的間充質幹細胞。重要的是要提醒，最小限度的操作對於將物質或顆粒用於任何與科學研究目的不同的應用的重複使用至關重要。

關於罕見群體如幹細胞和癌細胞，已評價了將細胞從不同組織分離的替代技術；特別是場流分級法(下文中，fff為場流分級的縮寫)，其能夠僅基於包括複雜群體中被分析物的形態學和特有的生物物理特性在內的物理差異來區分不同的細胞群和相關的亞群(reschiglian等，trendsinbiotechnologyvol.23no.9，2005年9月)。由於這些技術，變得可以簡化樣品並得到殘留在最小限度操作標準品中的目標細胞。

這些技術和方法包括維持經處理的細胞樣品相對於初始樣品不改變且不增加輔助性質或除去原有性質的程序。我們指的是以下技術：fff(場流分級)、gr-fff(重力場流分級)、sd-fff(沉降場流分級)、fdf(雙向電泳fff)、和離心等。

在動態流體條件下，特別是屬於fff的那些，可比較的分離技術提供將活細胞添加到生理鹽水緩衝液的懸液中製備的細胞級分的分級方法。接著將樣品引入分級裝置內部。引入和分離可以在連續流和包括注射器的注射體系的情況下發生，由此樣品可以引入到分級用毛細管通道中。

接著將樣品通過裝置分離或分級、或者為了研究調查而觀察從初始樣品中離析的單顆粒或顆粒的組的行為。分離可以在靜態或動態條件下進行。在動態情況下，在存在或不存在與裝置本身接觸下泵送連續流並執行來自該裝置的洗脫機構；在靜態情況下，將細胞保持在特定的位置來觀察對細胞所生活的流體的條件和組成方面改變所施加的條件變化的響應。動態分離的方法可以防止待分析/分離的物質在裝置物理組件上固定，避免與之接觸。然後收集含有在穿過分級裝置的過程中分離的不同群體中的不同細胞類型的級分。可選地，一旦研究完成、或出於細胞衰老和存活力等原因，細胞樣品被廢棄。

屬於場流分級技術的一些方法用於從細菌群到上皮細胞的生物樣品的分離，但是通過實施現有技術公開的方法和裝置實現的結果顯示出若干缺點。因地球重力場而在動態流分離條件下運行的技術特別明顯，因為它們是在其他可用於分離目的的技術中最簡單且更便宜的技術。

這些技術使用在圖14中詳細說明的的分級裝置。分級元件1100包括通道1122，在該通道中能夠通過注入口1102沿分級裝置內部的流動方向引入縱向流(由箭頭指出)。該裝置通常受到例如重力等的相對於流動方向垂直作用的力場。

在通道1122中，由於層流，裝置內部的物質的輸送流(流動相)的橫向流速分布是拋物線形的。對於縱向流速的分布也是一樣的。因此，注入分級裝置的細胞以與洗脫流體相同的流動分布運行。隨著側壁附近的流動速度降低而導致趨近於零，並且在側壁的表面上為零，這不可避免地涉及分級裝置的側壁附近的細胞固定。這意味著細胞樣品的損失是由於細胞的固定，其速度等於零，並沉積在分級通道的壁處。對於傾向於附著到諸如裝置的壁的固體支持物的附著幹細胞的分級，樣品損失是明顯的。

本發明的目的是提供一種在動態條件下進行分級和離析的裝置，其相對於現有儀器技術克服了關於維持效力、易於使用和便宜等的問題，並且與此同時，能夠將減少固定、細胞回收、活力和樣品操作方面的缺點最小化。換句話說，本發明的目的是提供一種裝置，其允許克服或至少減少在分級通道壁上分離的物質的固定，確保洗脫材料回收的改善。該裝置屬於用於高回收細胞分離和/或高純度的群體或亞群離析的裝置，遵循涉及「擴展」臨床/醫療手術裝置導納(admittance)的最小操作技術類別。

本發明的另一個目的是提供一種用於在流體動態條件下分散流體中的物質的分級方法，允許在不同容器中收集洗脫的物質級分，從而離析含有目標物質的級分並避免注入裝置中的損失細胞材料的風險。

技術實現要素：

通過獨立方案來解決本發明的主題。本發明的有利實施方式是從屬方案的目的。

特別地，本發明涉及用於分散流體中的彌散相的動態分級的裝置。彌散相可以包括物質和顆粒或顆粒的組，優選地包括微小尺寸的如細胞、分子、顆粒等的物質和顆粒或顆粒的組。該裝置包括分級通道和串聯的第一注入口至第三注入口。通過第一注入口，能夠將第一限制流體(confiningfluid)注入通道，而通過第二注入口，能夠將第二限制流體注入通道。通過第三注入口能夠將用於輸送彌散相的洗脫流體注入通道。第三注入口配置在第一注入口與第二注入口之間。分級通道的第一部分包括分別與第一注入口至第三注入口對應的第一終端部至第三終端部。其中，第一終端部(251)至第三終端部(241)具有如下大小：使得第一限制流體和第二限制流體分別具有第一預定流量和第二預定流量，洗脫流體能夠具有第三預定流量，第三預定流量大於第一流量和第二流量，以便將洗脫流體限制在第一限制流體與第二限制流體之間。將通過第一口至第三口引入分級通道的流體定義為分級通道中的流動相。

有利地，第一部分至第三部分可以具有允許將通過對應的口引入的流體發展成與通道的長度方向軸線平行流動的層流的幾何結構。例如，端部可以具有弧形或尖頭形或v字形輪廓。可選地，端部1至3能夠為多邊形。第一注入口至第三注入口能夠分別布置在終端部附近，其中與洗脫流體的注入口對應的端部比與第一限制流體和第二限制流體的可以彼此有利地相同的注入口對應的終端部寬。

本發明的另一目的是用於分散流體中的物質的分級的方法，該方法包括通過第一注入口將第一限制流體注入分級通道，通過第二注入口將第二限制流體注入分級通道。分別以第一預定流量和第二預定流量供給第一限制流體和第二限制流體。該方法還包括通過在第一注入口與第二注入口之間配置的第三注入口注入用於供給流動相的洗脫流體。洗脫流體具有大於第一預定流量和第二預定流量的第三預定流量，以便將洗脫流體限制在第一限制流體與第二限制流體之間。

有利地，第一限制流體的第一預定流量和第二限制流體的第二預定流量能夠在洗脫流體的第三預定流量的從5％至25％的範圍，優選地為第三預定流量的10％。

將在以下參照附圖作為示例性而非限制性說明的一些實施結構的詳細說明中指出根據本發明的分級方法和裝置的進一步優點和特徵，其中：

附圖說明

圖1示出了根據本發明一個實施方式或實施圖的分級裝置的細節的俯視圖；

圖2示出了根據本發明的分級裝置的細節；

圖3示出了處於分解形態的圖2的裝置；

圖4是圖1至圖3的裝置的組成部件的俯視平面圖；

圖5是根據本發明第二實施方式的裝置的細節的立體圖；

圖6是圖5的裝置的分解立體圖；

圖7的(a)和圖7的(b)分別代表實施根據本發明的方法和背景技術部分的方法的裝置中的流體的長度方向速度場分布和總流的長度方向分布之間的比較的圖表。

圖8的(a)和圖8的(b)是通過有限元方法(fem)模擬獲得的圖，其代表了注入根據本發明的裝置的總細胞樣品流的表面趨勢以及與根據背景技術部分的裝置中的總樣品流進行比較；

圖9的(a)和圖9的(b)代表根據本發明的分級裝置內部的通過fem模擬獲得的總流的趨勢的矢量表示(圖9的(b))，用於與根據背景技術部分的裝置中的流的趨勢(圖9的(a))進行比較；

圖10的(a)和圖10的(b)是代表根據本發明的分級裝置中的輸送流體(流動相)的總表面速度場的趨勢(圖10的(b))、用於與背景技術部分的裝置中的速度的趨勢(圖10的(a))進行比較的圖；

圖11的(a)和圖11的(b)代表根據本發明的分級裝置中的輸送流體(流動相)的總速度矢量場的趨勢(圖10的(b))，用於與背景技術部分的裝置中的速度的趨勢(圖11的(a))進行比較；

圖12的(a)和圖12的(b)代表利用在背景技術部分已知的裝置和利用根據本發明的裝置的被洗脫樣品的檢測圖表；

圖13的(a)和圖13的(b)是代表分別在背景技術部分的裝置中的和在根據本發明的裝置中的、靠近布置有被洗脫級分的收集口的端的細胞分布的照片；

圖14示意性地示出了從現有技術已知的分級裝置的細節。

具體實施方式

以下段落說明本發明的各種代表性實施方式。例如，為了便於理解，將參照生物材料、特別是細胞的分級來說明根據本發明的分級裝置。必須注意的是，參照以下不同實施方式說明的方案還能夠用於不同類型的如下樣品的分析和分離：諸如包括在數微米與數百微米之間的適當尺寸的有機和無機顆粒等，例如聚合物顆粒、球狀或層狀礦物質顆粒、碳顆粒、二氧化矽顆粒、用於給藥的顆粒、血清和懸浮細胞、細菌群落、脂質體囊泡。

說明書和技術方案中使用的術語分級通道表示在根據本發明的裝置的分級元件中獲得的凹部，流體能夠從與分級元件的第一端對應地配置的注入口流過該凹部的內部、流向與分級元件的和第一端相反的第二端對應地定位的提取點。分級通道能夠為毛細管通道。

術語毛細管用於表示大小在至少一個維度上允許在分級通道內部產生層流的通道。毛細管分級通道能夠具有不滿足毛細管的定義的長度和寬度，而具有滿足該定義的厚度，以獲得層流。

術語分級通道意味著在至少一個維度上滿足前段中的定義的毛細管通道。

術語側帶表示分級通道的與通道的側壁相鄰的部分，該部分遍及通道的長度地沿著側壁延伸，並且具有與通道的側壁垂直的大小，從這裡起，在寬度方面不等於零來表示該大小。

術語物質是指進行分離處理的彌散相，也就是顆粒或一簇小尺寸的、優選為微小的有機或無機顆粒，諸如聚合物顆粒、球狀或層狀礦物質、炭顆粒、二氧化矽顆粒、用於給藥的顆粒、血清和懸浮細胞、細菌群落、脂質體囊泡等。

術語彌散相是指物理狀態與分散相的物理狀態不同的成分。分散相是彌散相均勻分布、但不混溶的成分。例如，在顆粒或細胞的情況下，彌散相或細胞彌散可以是固體顆粒彌散(固相)均勻地分散在液體(分散液)中。在這種情況下，因為這兩相處於不同的物理狀態且不混溶(固體和液體)，所以可以稱作固/液彌散。

本發明基於如下觀察：在背景技術部分已知的且使用場流分級原理的分級裝置具有待分析或待分離的樣品的不可忽略的級分會附著到分級通道壁的缺點。通過傳統分級裝置分離微小材料的方法，可能會損失大約40％的樣品。這歸因於如下事實：樣品注入分級通道的洗脫流體具有層流，並且流速分布是拋物線形的，其中最大速度在通道的中央處，而在通道的側壁附近為零。進入洗脫流體的所有物質在通道的壁附近的速度均為零，並且傾向於附著到通道的側壁。在背景技術部分已知的一些裝置的另一問題是當流動相停止時，或者換言之，在無流動相的情況下，將樣品注入通道，在剛注入樣品之後流動相再次開始。還在這種情況下，注入通道的樣品級分會附著到通道底壁，並且不會被朝向作為樣品收集口的出口運送。另外，通道的側壁附近的物質以為零的速度懸浮在洗脫流體中的事實允許這些物質與側壁接觸，從而導致這些物質以這種方式損失，因此會降低分級裝置的效率。如果待分離的物質包括那些較容易附著到壁的二氧化矽顆粒、聚合物顆粒、或者諸如生物群落、細胞(特別是上皮細胞或貼壁幹細胞)等的生物材料，則該問題是顯著的。

根據本發明的裝置基於如下確認：對於裝置的最終性能，洗脫流體的在分級裝置的長度方向軸線的垂向上的流分布具有不可忽略的作用。在這種情況下，通道的長度方向軸線被識別成諸如始終沿著一個方向從通道的注入口向收集口延伸的軸線等。特別地，本發明基於如下觀察：進入分離通道的最優洗脫流在理想情況下可以有利地具有實質上為階梯波或方形波分布。實際上，在與通道的長度方向軸線垂直的定向上的中央的前方不為零、在分級通道的位於側壁附近的側帶處為零的洗脫流分布會減少樣品附著到通道的側壁，從而以這種方式確保了裝置的效率的重大提高。優選地，側帶的寬度在通道的總寬度的從10％和25％的範圍中。

圖1示出了根據本發明的如上所述地允許洗脫流體流的分級裝置的細節。圖11的(b)示出了進入通道221的流體速度趨勢。

特別地，圖1示出了分級元件200的平面圖，從該平面圖獲得分級通道221。分級元件200包括第一流體注入口321和第二流體主入口321，分級元件200的實施將參照圖2所示的實施形式的說明進行說明。以下還用術語第一側口和第二側口稱呼第一注入口和第二注入口。通過第一注入口321，能夠將第一限制流體注入通道，同時通過第二注入口321，能夠將第二限制流體注入通道。可以通過以下還稱作中央口的第三注入口311將用於供給流動相(mobilephase)的洗脫流體注入通道221。第三注入口311配置在第一注入口321和第二注入口321之間。通道221的第一端部包括分別與第一注入口321至第三注入口311對應地配置的第一終端部251至第三終端部241。構造有第一終端部至第三終端部，並且第一終端部至第三終端部具有諸如使三股不同的流進入分級通道221的幾何結構。特別地，第一限制流體和第二限制流體分別構成兩股側流，這兩股側流可以分別具有第一預定流量和第二預定流量。通過第三注入口注入的洗脫流體限定可以具有第三預定流量的中央流。

第三預定流量比第一預定流量和第二預定流量高，以便使洗脫流體限制在第一限制流體與第二限制流體之間。另外，優先建立具有比洗脫流體的流量低的流量的限制流允許中央流具有允許執行樣品場流分級的寬度，從而避免了樣品的一部分與分級通道的側壁接觸。通道幾何結構的選擇、特別是終端部241、251的選擇允許以有效的方式應用場流分級法。終端部241、251的如下幾何結構和位置的選擇將不允許樣品的材料分離：使得產生沿著分級通道的長度方向軸線始終集中在數微米帶、特別是集中在例如小於100微米的洗脫流體流。

通過第一注入口和第二注入口注入的流在注入步驟期間和分離步驟期間用作限制成分或用作樣品的流體引導物。該構造防止了細胞損失和導致分離效率降低的洗脫流的帶變寬。有利地，第一限制流和第二限制流可以彼此平行，並且可以與洗脫流體流或中央流平行。為了獲得流體引導物，可以將第一終端部251至第三終端部241構造和配置成使得它們各自的長度方向軸線彼此平行並且與分級通道221的長度方向軸線平行。該構造允許容易且精確地產生彼此平行的層流，使得洗脫流體與第一限制流體和第二限制流體的流平行地在通道的中央流動。

在本發明的有利形式中，與第三注入口311對應的以下還用術語中央終端部稱呼的第三終端部241的基部大於分別與第一注入口321和第二注入口321對應地配置的第一終端部251和第二終端部251(以下還用術語第一側終端部和第二側終端部稱呼)的基部。在根據本發明的分級通道221的構造中，終端部的基部是各終端部241、251的連接到分級通道221的部分。以下將用術語點終端部傳統地稱呼終端部241、251的與基部相反的部分。

在上述構造的另一發展中，第一終端部和第二終端部的基部寬度可以具有直到第三終端部的基部寬度的50％的值。第一終端部251和第二終端部251的基部寬度可以被選擇成確保中央流距分級通道221的側壁的預定距離不為零(notnull)，例如在第三終端部的基部寬度的從25％至50％的範圍中。

在本發明的圖示實現中，側流可以具有0.1ml/min的流量，並且可以與具有1ml/min的流量的中央流平行。更具體地，可以選擇第三終端部241的幾何結構和大小，以便獲得如下寬度的洗脫流體流(中央流)：在該寬度下，獲得了細胞樣品沿著分級通道221的寬度的分布始終等於通道221的總寬度的近似一半。第一終端部251和第二終端部251可以具有如下幾何結構和形狀：使得在中央通道兩側產生寬度在通道221的總寬度的從10％至25％的範圍中的側通道。通過第一限制流體和第二限制流體的流產生側通道。以這種方式，中央通道被配置成距分級通道221的側壁預定距離，該預定距離與在通道221的總寬度的從10％至25％的範圍中的值對應。

有利地，第一終端部251至第三終端部241可以是弧形。根據本發明，術語「弧形」是大致的。因此，終端部可以具有符合弧形輪廓的任意輪廓。這些輪廓為例如尖頭形(cusp-shaped)、v字形或u字形、或者半圓形或多邊形輪廓。

儘管與所建議的流量組合的上述構造在細胞分離和細胞回收方面顯示出了良好的結果，但是中央通道和側通道的大小以及限制流體和洗脫流體的流量可以具有與以上表明的值不同的值。這些值取決於分級裝置的用途和注入該裝置的樣品的性質。在分離生物材料的應用中，能夠將中央流量選擇在0.5毫升每分鐘至3毫升每分鐘的範圍中，並且合理地，中央流量能夠隨著分級裝置的大小而增大，其中該大小能夠在如下範圍中：寬度為從4毫米至6毫米，長度為從20毫米至40毫米，厚度為從0.1毫米至0.7毫米。另外，終端部241、251能夠具有與以上解釋的輪廓不同的輪廓。例如，在不意味著本發明的不同構思的情況下，終端部241、251可以具有多邊形輪廓。

根據圖1所述的構造，可以在將洗脫流體注入分級通道221之前，通過第三注入口將樣品注入分級通道。在這種情況下，樣品置於分級通道221的底面，並且沿著分級通道221始終被洗脫流體洗脫。

圖1所述的分級裝置200不限於關於上述樣品注入的方法。有利地，分級裝置200可以包括通過隔膜(圖1中未示出)實現的樣品注入口，用於將作為懸浮物質的樣品注入必須通過分級通道221分級的流體。配置樣品注入口，以便允許例如將物質與分級通道221的平面垂直地注入洗脫流體的流。更具體地，配置樣品注入口，以便通過分級通道的平面中的流注入樣品。在根據本發明的實施形式中，隔膜可以與第三注入口311對準地配置，有利地，可以配置在由洗脫流體的流限定的中央通道的中央。

通過穿過隔膜的注入，將樣品注入流動中的洗脫流體，以這種方式，注入通道221的物質不會附著到通道221的底面。歸功於與洗脫流體平行地流動的限制流體，通過側流體將被注入的遍及分級通道221的整個長度地擴展到分級通道221的物質限制在中央通道中，使得注入通道221的物質不附著到分級通道221的側壁。

根據本發明的分級裝置還包括至少一個流控制構件441，流控制構件441與第一注入口321至第三注入口311流體連接。流控制構件441允許控制通過第三注入口311注入的洗脫流體的流，用於使洗脫流體具有第三預定流量。流控制構件還與第一注入口321和第二注入口321流體連接，用於控制分別通過第一注入口321和第二注入口321注入分級通道211的第一限制流體和第二限制流體的流。流控制構件441允許控制第一限制流體和第二限制流體的流，以使第一限制流體和第二限制流體具有第一預定流量和第二預定流量，其中第一預定流量和第二預定流量比第三預定流量低。在本發明所披露的情況中，第一預定流量和第二預定流量具有相同的值。可選地，第一預定流量和第二預定流量能夠具有不同的值。

在根據本發明的特定產品形式中，流控制構件441包括通過分離流體通道來對洗脫口311、321進行洗脫的一個泵送系統(未示出)，該泵送系統例如是蠕動泵、注射泵、隔膜泵、hplc泵等。在這種情況下，能夠通過配置在位於泵和其對應的洗脫口之間的流體裝置中的對應的閥控制各第一預定流量至第三預定流量。以上列出的泵僅是示例性的，而非限制性的。特別地，在具有與以上列出的泵相同的效力的情況下，可以使用控制進入根據本發明的分級通道的流體的流的各種泵。

在根據本發明的不同產品中，流控制構件441包括與第一注入口321和第二注入口321流體連接的第一泵和第二泵(未示出)，以及與第三注入口311流體連接的第三泵(未示出)。在這種情況下，可以獨立地控制第一泵至第三泵，以便產生分別具有第一預定流量和第二預定流量的第一限制流體和第二限制流體，以及具有第三預定流量的洗脫流體。

顯然地，本領域技術人員可以想到流控制構件的其它構造。例如，在第一限制流體和第二限制流體具有相同流量的情況下，如果第一注入流量和第二注入流量具有相同的值，則流控制構件可以包括用於給送第一限制流體和第二限制流體的第一泵，以及用於給送洗脫流體的第二泵。根據該不同的構造，分級裝置的設計和產品形式是較容易且較便宜的。

在圖2中，根據本發明的作為參照圖1表述的概念的產品的產品形式，示出了分級裝置的細節。

分級裝置200的有利實施形式包括至少三層塑料材料，包括：至少一層底層101，其用作分級裝置的積聚壁，並且最終設置有被洗脫物的收集口；一層中間層，其用於固定毛細管通道的側壁外形；以及一層頂層301，其中配置有流動相和細胞樣品的注入口，並且最終配置有被洗脫物的收集口。

塑料材料層以可去除或永久的方式彼此配合；製成層的材料考慮到裝置的重複使用的可能性以及一次性使用的可能性兩者。分級裝置200包括通道221。通道進而包括底層或積聚壁101。積聚壁可以由例如聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚苯乙烯或聚甲基丙烯酸甲酯等的塑料材料製成。可選地，積聚壁101能夠由如玻璃等的無機材料製成。玻璃比塑料材料更具極性，所以在裝置用於分離諸如聚苯乙烯等的塑料顆粒的情況下，可以有利地使用該材料。該底層是這種類型的分級裝置的積聚壁。底層101可以具有從5mm至15mm的範圍的厚度，並且優選地，底層101為10mm厚。清楚地，這些是非限制性的值，並且清楚的是，本領域技術人員可以根據設計要求和分級裝置的用途選擇具有與所表明的厚度不同的厚度的底層。

分級裝置200包括頂層或供給壁301，其中配置有分級通道的流動相的第三注入口或中央注入口311、流動相的第一注入口和第二注入口或側注入口321。圖2示出了根據圖1所述的包括樣品注入口331的分級裝置的產品形式。

分級裝置200還包括一個收集口341，用於收集被洗脫物。頂層301具有與底層101大致相同的特徵；頂層301由厚度在從5mm至15mm的範圍中的、優選為10mm的板構成。供給壁301可以由諸如聚氯乙烯或聚碳酸酯等的塑料材料製成。可選地，積聚壁可以由聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等製成。配置於頂層301的口具有大約5mm的截面，但是該截面是變化的，並且取決於與因不是本發明的主題而在這裡未示出的注入通道、注入通道和收集通道的接合截面。與積聚壁101類似，以上表明的厚度和直徑的值是非限制性的，並且清楚的是，本領域技術人員能夠根據設計要求和分級裝置的用途選擇不同的供給壁厚度和具有與所表明的直徑不同的直徑的注入口。

在積聚壁101與供給壁之間存在一層中間層201，中間層201固定分級通道221的外周輪廓。能夠通過適當的製造在中間層中獲得毛細管通道的輪廓。中間層201和毛細管通道221可以參見在圖3中繪出的分解圖。中間層201可以由諸如聚苯二甲酸乙二醇酯等的塑料材料製成，並且具有在從0.2mm至0.5mm的範圍中的、優選為0.25mm的厚度。分級通道211的外周輪廓包括：長度方向壁；尖頂(ogive)231，其與收集口341對應地配置；以及三個終端部241、251，其分別與注入口、或者中央注入口311和側注入口321對應。在本文獻所述的產品形式中，終端部是弧形的。第一終端部251和第二終端部251將還由術語側終端部表示，同時第三終端部241將由術語中央終端部表示。毛細管通道的中央注入口311和側注入口321引導到終端部241、251。

圖4是圖1至圖3的裝置的組成部件的俯視平面圖。特別地，圖4示出了中間層201的一部分的平面圖。在圖4所述的特定實施中，與第三終端部241對應的中央終端部在其基部寬度為2d，寬度2d為側終端部241的寬度d的大致兩倍。在圖中，用虛線代表注入口331和流動相的注入口311和321。注入口331與中央注入口311配置在同一長度軸線上，並且配置在所述終端部的基線的正下方。特別地，注入口331可以有利地配置在通道的如下點處：在該點處，中央流和側流排列起來且穩定。終端部241、251還被定向成使得它們的從各終端的基線的末梢向中間延伸的長度方向軸線與分級通道221的長度方向軸線平行，並且更普遍地，與分級裝置200的長度方向軸線平行。該幾何結構允許平行的層流。另外，通過將第一限制流體和第二限制流體注入分別與第一終端部251和第二終端部251對應的第一注入口321和第二注入口321而產生的流具有比通過第三注入口311注入第三終端部241以及分級通道221的洗脫流體的注入流量低的注入流量。以這種方式，洗脫流體流入中央通道，洗脫流體限制在第一限制流體與第二限制流體之間且具有允許正確的樣品分離的寬度。

在圖5中，示出了根據本發明的提供了存在能夠並行獨立工作的多條分級通道212、222的分級裝置的第二產品形式。圖5示出了包括兩條分級通道的分級裝置400。總之，意味著本發明不限於該構造，並且意味著分級裝置還能夠包括多於兩條的分級通道。為了簡化，將參照具有兩條分級通道212、222的分級裝置說明多條通道構造。多層分級裝置400包括：底層102；中間層202，兩條毛細管通道的外周輪廓被製造在中間層202中，圖5示出了這兩條毛細管通道，並且將稍後對它們進行更好地說明；以及頂層或注入壁302。頂層302配置在中間層202上，並且被分成其它三層底基層(underlayer)，分別為與中間層接觸的第一底基層312、配置在第一底基層312上且與第一底基層312接觸的第二底基層322以及配置在第二底基層322上且與第二底基層322接觸的第三底基層332；第三底基層332包括用於給送限制流體342的限制口和用於給送洗脫流體的洗脫口352。第三底基層還包括用於將待分離的樣品注入分級通道的樣品注入口362和用於樣品輸出收集的口112。該構造不必被視作是限制性的，而是意味著輸入和輸出口可以配置在裝置的與上述層不同的層中。例如，用於樣品輸出收集的口112可以可選地配置於底層102。

在圖6中，通過分解立體的方式示出了形成多層毛細管通道400的不同的層和底基層。底層102與稍早說明的毛細管通道200的底層類似地由塑料材料製成。

中間層202是塑料材料層、優選具有與對毛細管通道200說明的中間層相同的特徵，其中通過收集管道232使兩條通道212和222的外周輪廓連接到第一端部。分級管道212和222可以具有例如與稍早說明的毛細管通道400相同的外周輪廓。

頂層302包括先前提及的底基層；第一底基層312包括：用於分級通道的各一個中央注入口372，其用於洗脫流體注入；用於毛細管通道的各兩個側注入口382；口392，其用於待洗脫的樣品的注入；以及樣品輸出口。該底基層優選由聚氯乙烯、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯製成，其具有例如從1mm至5mm的範圍中的厚度，優選具有3mm的厚度。

第二底基層322由例如pet或petg或具有相似性能的材料製成，其具有例如從0.2mm至0.7mm的範圍中的厚度，優選具有0.5mm的厚度。在該底基層中，製造有第一底基層312的側注入口382的注入管道402、中央注入口372的注入管道412、樣品注入口392的注入管道422以及口112的注入管道232。

第三底基層332由聚氯乙烯、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯製成，並且具有從1mm至5mm的範圍中的厚度，優選具有3mm的厚度。在該底基層中，製造有如稍早說明的頂注入孔342、352、362和112。

通過以下說明，根據本發明的分級裝置的操作和實施細胞材料分級的方法會變得明顯。如已經解釋過地，從背景技術部分已知的分級方法的一個缺點與輸送流體的長度方向速度相關，該長度方向速度為從中央至側壁的拋物線形遞減。與該缺點部分相關的另一問題是細胞傾向於首先集中在通道的中央部，隨後細胞沿著洗脫通道的整個前部擴展。由於細胞材料輸送流體的速度在側壁附近趨近於零，所以細胞可能會減速，從而使分級效率和細胞回收惡化。代替地，本發明使得樣品不接觸毛細管通道的所有壁，從而使該裝置完全地響應於最少操縱規則。

為了改善分級裝置的性能，根據本發明的方法建議通過用於對分級通道212和222進行供給的幾乎兩種不同且獨立的流量來將流動相加入分級通道，以便在各分級通道中均具有輸送彌散相的與通道的長度方向軸線對應的中央流，以及與分級通道的側壁對應的兩股側流或限制流。相對於中央流具有較低流量的第一側流和第二側流防止樣品中的一部分、如細胞或生物材料附著到側壁，並且同時遍及分級通道的長度地將被洗脫樣品限制在中央通道。在根據本發明的分級裝置的構造中，通道中央部、即洗脫流體的流動相流量在從0.5ml/min至1.5ml/min的範圍中，優選為大約0.8ml/min-1.0ml/min；通道的側部處的第一限制流和第二限制流的流量在中央部流量的5％至15％的範圍中，優選為該流量的10％。

沿著根據本發明的分級通道的側壁始終存在第一限制流和第二限制流，改變了與分級通道的拋物線形長度方向速度相關的運行條件，從而將「流動」側壁發展成分級通道。

另外，通過剛好配置在流動相注入的下遊的注入口將預計要分級的樣品注入流動相的流；該措施允許較好地限制所注入的細胞材料。

已經按照根據本發明的方法的工作步驟測試了分級裝置；將葡萄糖注入裝置，已經完成了初步測試。如能夠從圖7的(a)、圖7的(b)的圖表觀察到地，fem模擬的結果清楚地示出了兩種裝置的不同運行。在圖表中，(圖7的(a))長度方向速度的變化曲線和(圖7的(b))總流的變化曲線與位於通道的前方、而非位於通道的寬度的位置相關。對於模擬，已經為兩裝置選擇了1ml/min的流動相流量和40.0mm的總分級通道寬度。這些值是象徵性的，並且清楚的是，具有不同大小和不同流量的通道與本發明兼容。更普遍地，能夠使用如下分級通道221、212、222實現本發明：這些分級通道使得產生層流，並且遵守上述側流的流量與中央流的流量之間的比。

如果長度方向速度場分布(參見圖7的(a))的差異與根據本發明(虛線)和背景技術部分(連續線)的通道的不同趨勢確切相關，則總長度方向流分布(參見圖7的(b))的變化特別顯著。事實上，流在距側壁預定距離處呈現為大致減小到零，因此顯示出較好的通過根據本發明的裝置限制待洗脫的樣品的能力。

通過作為結果給出表流的趨勢和所注入的細胞樣品的速度場的有限元模擬(fem)來證實該結果，在與以上相同的條件下對該結果進行計算；這些模擬顯示，如應用圖8至圖11所示的圖表以遞色的方式所呈現的，越是確切地宣稱進入根據本發明的裝置的總樣品流和輸送流體的速度場，隨著速度場(圖10的(a)和圖10的(b))和總流(圖8的(a)和圖8的(b))的分別增大遞色越濃，從而確認了被洗脫樣品的集中越高。特別地，圖8的(a)示出了傳統分級通道中的總流的趨勢。該圖示出了傳統分級通道中的流如何向分級通道的側壁延伸，以及如何朝向通道側壁運送待分離的樣品的一部分。圖8的(b)示出了根據本發明的分級通道中的總流。從進入根據本發明的分級通道的總流趨勢，清楚地表明進入分級通道的洗脫流或中央流的集中。洗脫流被限制在分級通道的中央、限制在距分級通道的側壁預定距離處。因此，所注入樣品的材料通過中央流維持在距通道壁一定距離處，並且以這種方式避免了該材料附著到側壁。圖9的(a)和圖9的(b)示出了如參照圖8的(a)和圖8的(b)所述的流的矢量形式的趨勢。

圖10的(a)示出了傳統分級通道中的流速的趨勢。沿著傳統通道的橫向速度的趨勢始終是拋物線形的，並且速度在分級通道的側壁附近為零。圖10的(b)示出了進入根據本發明的分級通道的速度的趨勢。在這種情況下，速度分布在通道的中央處實質上是恆定且平穩的，並且比側通道所宣稱的少。代替地，允許進行材料分離的橫向速度場維持拋物線形，並且速度在積聚和注入壁處為零。圖11的(a)和圖11的(b)示出了如參照圖10的(a)和圖10的(b)說明的矢量形式的速度趨勢。

對不同細胞材料執行了多次分級試驗；圖12的(a)示出了分別通過從背景技術部分已知的分級裝置(連續線)和根據本發明的分級裝置和方法(虛線)對兩種幹細胞進行分級的洗脫圖表。

將來自牙髓的間充質幹細胞(dp-msc)樣品注入這兩裝置；使用等滲pbs+bsa0.1％作為流動相。所注入的樣品每100μl中含有300000個細胞。圖表示出了吸光度(absorbance)相對於時間的函數。

實驗結果強調了在如下條件下使用根據本發明的裝置能夠獲得較好的分離性能和較高的細胞回收：

-相同容積的分離通道(標準形狀為4cm/流體軌為4cm)；

-用於分離的相同流體流量(分離流為0.8ml/min，不包括流體軌的流量)；

-注入相同的樣品。

圖12的(b)示出了類似的實驗，其中分別通過根據背景技術部分的分級裝置和方法(虛線)和根據本發明的分級裝置和方法(連續線)對50μl的全部血液樣品進行洗脫；流動相為生理鹽水和bsa0.1％。

對於為了分離而需要「停流」步驟的種類而言，在回收、效率和靈敏度方面不存在任何顯著差異。分離處理不受所採用的實驗條件的影響；相反地，觀察到了相對於與紅血細胞(hrbc)的保留量(retentionvolume)對應的保留峰(retentionpeak)的原理高斯(theoreticalgaussian)的較好內聚力(cohesion)。

另外，圖片是在背景技術部分已知的裝置中的被洗脫級分收集口附近拍攝的，但是在該裝置中，通過位於流動相的注入口下遊的口來注入細胞材料，並且不具有根據本發明的側流(圖13的(a))和裝置(圖13的(b))。在根據背景技術部分的裝置的情況下，儘管通過該注入口直接注入流動相的細胞較集中在兩幾何結構的入口處，但是這些細胞傾向於遍及截面地擴展和分布，並且與通道的壁接觸。這樣發生的原因是未限制樣品，因此會在側壁附近擴展。因為歸功於側流而使細胞被限制，所以根據本發明的裝置不會發生該效應。

根據本發明的裝置可以被生產成圖1至圖6所示那樣。流動相311、321的注入口有利地配置在毛細管通道的遠端附近。口延伸到終端部241、251的頂點，這使通道外周輪廓211的端被再分。這些終端部促進了進入通道的獨立流動相注入流的建立，以便發展出上述的所謂的「流動壁」。

有利地，用於洗脫的樣品注入口配置在根據本發明的毛細管通道的長度方向軸線上、終端部的基線附近。

圖5和圖6所示的多分級通道裝置還特別適於處理具有大量物質、如在從1百萬至2百萬細胞的範圍中的細胞的樣品。

通過生產具有自身的流分布管道系統的多通道分級裝置來給予用於該裝置的溶液，以便供給配置在多通道2中的兩個或更多個毛細管通道，其中僅具有一個流動相注入管道，並且類似地，僅具有一個被洗脫級分收集口。

構成頂層302的底基層312和322允許注入在中間層202中獲得的以外周輪廓畫出的兩毛細管通道212、222的流動相和樣品的注入流分流。以這種方式，所獲得的多毛細管通道呈現為比根據背景技術部分的多通道裝置緊湊、有效且可靠的產品形式。

多通道分級裝置允許非常高的分級性能，並且基於與圖1至圖3所示的稍早說明的單毛細管通道相同的運行原理，意味著參照圖1至圖3所述的特徵還兼容且適用於圖5和圖6所述的構造，反之亦然。例如，圖1所述的控制構件400還能夠被圖2至圖6所述的裝置使用。以相同的方式，參照圖5和圖6所述的注入壁302還可以可選地用於分級裝置200的注入壁301。

在結構上通過使用過的材料和製造來設計兩裝置，以便具有使用根據本發明的裝置作為一次性用品的可能性。

本發明還涉及用於彌散相的動態分級的方法。根據參照圖1至圖13中的分級裝置所述的分離處理的特徵適用於根據本發明的方法，該方法包括：通過第一注入口將第一限制流體注入毛細管通道，通過第二注入口將第二限制流體注入毛細管通道。分別以第一預定流量和第二預定流量供給第一限制流體和第二限制流體。方法還包括通過配置在第一注入口與第二注入口之間的第三注入口注入洗脫流體，以便供給流動相。洗脫流體具有比第一預定流量和第二預定流量大的第三預定流量，以便將洗脫流體限制在第一限制流體與第二限制流體之間。

根據本發明的產品形式，方法包括如下步驟：

a)製備分散在流動相中的細胞材料樣品；

b)通過生理鹽水和生物相容性溶液(流動相)的連續流與包括差不多一個毛細管通道的適當分級裝置的所處平面垂直地注入樣品；

c)使樣品洗脫液進入裝置；

d)收集由已經從起始樣品起被離析成群落或子群落的不同細胞種類構成的級分。

在樣品注入步驟之後且在樣品洗脫步驟之前，任選地，能夠停止洗脫流體流。可選地，可以在無流動相停止流的情況下實施注入步驟和洗脫步驟，所以防止了與裝置的積聚壁的接觸相互作用。

以預定流量將流動相供給到分級裝置的中央部，並且以比中央部的流量低的流量供給到所述分級裝置的側部附近。

根據本發明的方法，其中第一限制流體的第一注入流量和第二限制流體的第二注入流量可以在洗脫流體的第三預定流動相流量的從5％至25％的範圍中選擇。在有利的形式中，第一預定流量和第二預定流量為第三預定流量的10％。

通過根據分級條件和所注入樣品的類型設定洗脫流體的流量和/或第一限制流體和第二限制流體的流量來實現根據本發明的方法。術語分級條件表示適於儀器運行且適於所注入物質的分級的所有組成部件參數。例如，流動相組合物(具有不同ph、鹽度、離子強度、有無表面活性劑的水溶液或有機溶液)、洗脫流、側流和注入流的流量和速度、一股或多股流停止一定時間、所注入樣品的量和濃度、分析時間、系統準備和調理的步驟。

在上述方法和裝置中，根據本發明，彌散相能夠由生物材料、特別是細胞和/或幹細胞構成。

參照圖1至圖4和圖7至圖13說明的裝置和分級裝置的特徵與根據圖5和圖6所述的裝置和分級裝置兼容，並且能夠在根據圖5和圖6所述的分級元件和裝置中實施。更普遍地，根據參照任意圖說明的實現形式所述的特徵均能夠在參照其餘圖說明的實現形式中實施。