Pat蛋白的親和層析－酶聯免疫檢測方法及其專用試劑盒的製作方法
2023-08-06 02:34:06
專利名稱：Pat蛋白的親和層析－酶聯免疫檢測方法及其專用試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬免疫學檢測領域，涉及一種檢測PAT蛋白的親和層析-酶聯免疫檢測方法及其專用試劑盒。
背景技術：
目前，轉基因作物涉及的食品原料有大豆、玉米、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、西葫蘆、番木瓜、甜椒等。2000年轉基因大豆、玉米、油菜、棉花佔轉基因作物種植面積的99.99％以上，佔全球種植面積的16％。在轉基因作物農藝性狀上表現出抗除草劑轉基因作物所佔比例最大，其次是抗蟲，再次是雙抗(抗除草劑和抗蟲)。
Bar基因和pat基因均是抗除草劑基因，二者只在核酸序列上稍有差別，它們編碼的蛋白是相同的，都是PAT蛋白(膦絲菌素乙醯轉移酶phosphinthricin acetyl transferase)，且胺基酸序列完全相同。Bar基因和pat基因作為抗性基因已被廣泛應用。此外，在作物中轉入其它外源基因時，bar基因和pat基因還可作為標記基因，目前也已被廣泛應用。
目前將Bar基因和/或pat基因作為抗性基因和/或標記基因的轉基因作物約佔總轉基因作物的70％，轉入bar基因和/或pat基因的作物已經有水稻，小麥，玉米，番茄，棉花，油菜等20多種。
隨著轉基因食品的快速發展，如何正確的評價轉基因食品，不僅關係到我國人民的身體健康，而且也關係到我國生物技術在食品工業中的可持續發展。特別在我國加入WTO以後，國外轉bar和/或pat基因的作物和食品大量進入我國，轉bar基因和/或pat基因的食品檢測技術是轉基因食品安全性評價的重要技術平臺，其研究具有重要的意義。
目前在我國還沒有見到有關轉bar基因和/或pat基因食品檢測技術的研究報導。在國際上轉bar基因和/或pat基因食品檢測最常用的技術是PCR技術，但在PCR反應中，許多因素會影響反應的進行，導致反應效率下降、非特異性片段的擴增、假陽性和陰性的出現等。
發明內容
本發明目的在於提供一種樣品前處理簡單，靈敏度高，特異性強，快速高效，適於大批量樣品篩選的PAT蛋白檢測方法；並開發出結構簡單，使用方便，價格便宜，便於攜帶的PAT蛋白檢測試劑盒；從而解決了對轉bar基因和/或pat基因作物及其加工產品從蛋白水平上進行定量檢測的需求。
本研究將免疫親和層析(IAC)技術與酶聯免疫吸附(ELISA)技術結合起來實現了對轉基因農作物中PAT蛋白的特異性檢測，完成了本發明。
本發明提供了一種檢測PAT蛋白的方法，其特徵在於，先用免疫親和層析方法將待測樣品中的PAT蛋白富集純化，再通過酶聯免疫吸附方法來定量檢測PAT蛋白。
所述方法包括如下步驟(1)樣品前處理；(2)製備酶標抗原將活化的辣根過氧化物酶與純化的PAT蛋白混合，製備酶標抗原；(3)製備PAT抗體；(4)製備偶聯PAT抗體的凝膠；(5)包被酶標板；(6)免疫親和層析純化將偶聯抗體的凝膠裝柱，加入樣品過柱，洗脫，收集洗脫液；(7)酶聯免疫吸附檢測將洗脫液加入經抗體包被的酶標板上，溫育後洗滌拍幹；加入酶標抗原，溫育後洗滌拍幹；顯色、終止；用酶標儀讀取OD值；(8)繪製標準曲線；(9)根據標準曲線對洗脫液中的PAT蛋白含量進行定量計算。
優選地，樣品前處理採用稱取待測植物組織，經超聲波破碎；離心，取上清液過濾；濾過液凍存待測。
優選地，製備酶標抗原採用將活化的辣根過氧化物酶與純化的PAT蛋白混合，在碳酸緩衝體系中進行標記反應，之後加入硼氫化鈉還原未結合位點。
優選地，製備PAT抗體採用將紐西蘭白兔接種免疫，免疫抗原為PAT蛋白，頸動脈放血；分級沉澱血清中雜蛋白和抗體免疫球蛋白，之後將過柱獲得的液體透析，透析液離心後得含有PAT抗體的溶液，凍存備用。
優選地，製備偶聯PAT抗體的凝膠採用先活化凝膠；將活化後的凝膠與PAT抗體振蕩混勻；離心洗滌以洗脫雜蛋白和未結合的抗體；依次用不同pH梯度溶液輪流洗滌封閉未結合的活性基團，再用磷酸緩衝液淋洗，冷藏保存備用。
優選地，包被酶標板採用將PAT抗體包被在酶標板上，冷藏過夜；洗滌拍幹。
優選地，免疫親和層析純化採用將偶聯抗體的凝膠裝柱，加入樣品，循環過柱，用甘氨酸溶液洗脫，收集洗脫液。
優選地，酶聯免疫吸附檢測採用將樣品洗脫液加在經抗體包被的酶標板上，溫育後洗滌拍幹；加入酶標抗原，溫育後洗滌拍幹；繼而加入底物混合液顯色；終止反應；用酶標儀讀取OD值。
本發明還提供了一種用於所述方法的試劑盒，其特徵在於它含有A試劑標準PAT蛋白試劑；C試劑酶標抗原試劑；
K試劑偶聯PAT抗體的凝膠；包被PAT抗體的酶標板。
優選地，所述的試劑盒還含有B試劑稀釋液；D試劑酶標抗原稀釋液；E試劑含吐溫-20的磷酸鹽PBS固體；F試劑鄰苯二胺試劑；G試劑醋酸鈉-檸檬酸緩衝液；H試劑30％H2O2；I試劑硫酸溶液；J試劑甘氨酸溶液。
本發明技術方案詳述如下(1)稱取2g植物組織，加入5ml PBS/0.01M EDTA(pH7.5)，經超聲波破碎；然後12000rpm/min離心30min，重複兩次以去除不溶性的組織碎片，抽取上清液經濾膜過濾。濾過液-20℃凍存待測；整個操作過程要避免過熱導致蛋白變性。
(2)製備酶標抗原將活化的辣根過氧化物酶(HRP)與純化的PAT混合，在碳酸緩衝體系中進行標記反應，之後加入硼氫化鈉還原未結合位點。
(3)製備多克隆PAT抗體a.免疫用抗原免疫劑量每次1mg/ml PAT蛋白，首次免疫用1ml完全福氏佐劑乳化，加強免疫時用1ml不完全福氏佐劑乳化。
b.動物免疫將紐西蘭白兔飼養數周后接種免疫，每次免疫間隔兩周，一共免疫5次；在最後一次直接肌肉注射，一周後從兔耳靜脈採血以檢測抗血清效價；之後頸動脈放血。
c.分離血清以30％-60％的硫酸銨分級沉澱血清中雜蛋白和抗體免疫球蛋白，之後將過柱獲得的液體用Ph7.4含0.15mol/L NaCl的PBS(磷酸鹽緩衝液)連續透析3d，每天換液2次，取出透析液進行離心後得含有多克隆PAT抗體的溶液；-70℃保存備用。
(4)製備偶聯抗體的sepharose-4B凝膠a.活化凝膠用溴化氰CNBr活化sepharose-4B凝膠。並用低濃度HCl溶液反覆洗滌凝膠；在偶聯抗體前先用磷酸緩衝液平衡sepharose-4B凝膠。
b.交聯抗體將凝膠與適當稀釋的PAT抗體振蕩混勻，使抗體吸附到活化的sepharose-4B凝膠顆粒上。
c.洗脫雜蛋白離心洗滌以洗脫雜蛋白和未結合的抗體。
d.封閉依次用不同pH溶液輪流洗滌封閉未結合的活性基團，再用磷酸緩衝液(加入NaN3至終濃度0.02％)淋洗，4℃保存備用。
(5)包被酶標板將抗體包被在酶標板上，100ul/孔，放入4℃冰箱過夜；再加入E洗滌液，250ul/孔，洗滌3次，每次3min；放在吸水紙上拍幹。
(6)取5ml偶聯抗體sepharose-4B凝膠，裝柱，先加入含吐溫-20的磷酸鹽PBS洗滌液平衡，直至流出液的OD 280值小於0.5；再加入等體積待測樣品溶液，4℃循環過柱。之後用0.1mol/L、pH2.5甘氨酸溶液洗脫，收集洗脫液。
(7)在酶標板中加入待測樣品洗脫液，37℃溫育0.5h，之後洗滌拍幹；加入100ul酶標抗原溶液，37℃溫育0.5h；洗滌拍幹；每孔加入150ul底物混合液，室溫顯色15min；每孔加入50ul終止液；測定目測後，酶標儀讀取各孔OD值。
(8)繪製標準曲線用PAT蛋白標準品配製PAT蛋白濃度梯度溶液，經步驟(7)，獲取各梯度溶液OD值，繪製標準曲線；(9)根據標準曲線對樣品洗脫液中的PAT蛋白含量進行定量計算。
PAT蛋白檢測試劑盒的組建
A試劑標準PAT試劑；B試劑稀釋液；C試劑酶標抗原試劑；D試劑酶標抗原稀釋液；E試劑含吐溫-20的磷酸鹽PBS固體；F試劑鄰苯二胺試劑；試劑醋酸鈉-檸檬酸緩衝液；H試劑30％H2O2；I試劑硫酸溶液；J試劑甘氨酸溶液；K試劑偶聯抗體sepharose-4B凝膠；包被PAT抗體的酶標板(真空包裝，於4℃保存)。
本試劑盒是以多克隆抗體免疫親和柱為富集純化裝置，再通過酶聯免疫吸附方法來檢測PAT蛋白。
本發明將免疫親和層析技術(IAC)與酶聯免疫技術(ELISA)結合起來實現了PAT蛋白的特異性檢測，從而解決了對轉bar和pat基因作物及其加工產品從蛋白水平上進行定量檢測的需求。本發明是目前國內外首次實現對PAT蛋白的定量檢測技術，該項研究填補了國內外該領域的研究空白。IAC-ELISA試劑盒比普通ELISA試劑盒的檢測限要低一個數量級，且靈敏快速，前處理簡單，回收率高，結果重複性好，適於大批量樣品的篩選。
使用IAC-ELISA檢測技術對轉基因作物PAT蛋白可以達到0.3％的檢測限。對轉基因油菜MS1/RF1可以達到0.5％的檢測限；對轉基因油菜MS3/RF8同樣可以達到0.5％的檢測限。
本發明檢測方法有如下優點1.靈敏度高，檢測限低，回收率高，結果重複性好；2.特異性強IAC和ELISA方法均建立在抗體和抗原的特異性結合，且所得抗體交叉反應率極低；3.檢測成本低廉，無需大型儀器設備，適於推廣；4.樣品預處理簡單，無需無菌化處理，樣品提取方便快捷；5.通過酶標儀判讀，結果具有客觀性和不可更改性；6.簡單易行，操作人員只需最基本的實驗知識，可標準化為產品；
7.檢測時間短，整個操作過程不到2.5個小時；8.可以進行大批量檢測。
圖1PAT蛋白的檢測標準曲線圖。
圖2轉基因玉米Bt11、Bt176和基因油菜MS1/RF1、MS8/RF3的IAC-ELISA檢測結果圖。
具體實施例方式
下面結合具體實例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
實施例11、樣品前處理分別稱取轉基因玉米Bt11、Bt176和基因油菜MS1/RF1、MS8/RF3的葉片組織2g，加入5ml PBS/0.01M EDTA(pH7.5)，經超聲波破碎。然後12000rpm/min離心30min，重複兩次以去除不溶性的組織碎片，抽取上清液經孔徑為3MM的whatman濾膜過濾。濾過液-20℃凍存待測；整個操作過程要避免過熱導致蛋白變性。
2、製備酶標抗原將活化的辣根過氧化物酶(HRP)與純化的PAT蛋白混合，在碳酸緩衝體系中進行標記反應，之後加入硼氫化鈉還原未結合位點。
3、製備多克隆PAT抗體a.免疫用抗原免疫劑量每次1mg/ml PAT蛋白，首次免疫用1ml完全福氏佐劑乳化，加強免疫時用1ml不完全福氏佐劑乳化。
b.動物免疫將紐西蘭白兔飼養數周后接種免疫，每次免疫間隔兩周，一共免疫5次；在最後一次直接肌肉注射，一周後從兔耳靜脈採血以檢測抗血清效價；之後頸動脈放血。
c.分離血清以30％-60％的硫酸銨分級沉澱血清中雜蛋白和抗體免疫球蛋白，之後將過柱獲得的液體用pH7.4含0.15mol/L NaCl的PBS(磷酸鹽緩衝液)連續透析3d，每天換液2次，取出透析液進行離心後得含有多克隆PAT抗體的溶液；-70℃保存備用。
4、製備偶聯抗體的sepharose-4B瓊脂糖凝膠a.活化凝膠用CNBr活化sepharose-4B凝膠。並用低濃度HCl溶液反覆洗滌凝膠；在偶聯抗體前先用磷酸緩衝液平衡sepharose-4B凝膠。
b.交聯抗體將凝膠與適當稀釋的PAT抗體振蕩混勻，使抗體吸附到活化的sepharose-4B凝膠顆粒上。
c.洗脫雜蛋白離心洗滌以洗脫雜蛋白和未結合的抗體。
d.封閉依次用不同pH溶液輪流洗滌封閉未結合的活性基團，再用磷酸緩衝液(加入NaN3至終濃度0.02％)淋洗，4℃保存備用。
5、配製試劑標準PAT試劑PAT標準品加稀釋液(PBS磷酸緩衝液，pH7.4)混勻，配成梯度溶液。
酶標抗原試劑酶標抗原加10ml酶標抗原稀釋液(PBS磷酸緩衝液含0.1％明膠，pH7.4)溶解，混勻。
洗滌液配製在含有0.1％吐溫-20的磷酸鹽(PBS)固體中加入200ml蒸餾水配製洗滌液，用於酶標板的洗滌。
底物混合液的配製用20ml醋酸鈉-檸檬酸緩衝液稀釋40mg鄰苯二胺，再加入6ul 30％H2O2，配製成底物混合液，現用現配。
6、包被酶標板將抗體包被在酶標板上，100ul/孔，放入4℃冰箱過夜；再加入洗滌液，250ul/孔，洗滌3次，每次3min；放在吸水紙上拍幹。
7、取5ml偶聯抗體sepharose-4B凝膠，裝柱，先加入洗滌液平衡，直至流出液的OD 280值小於0.5；再加入等體積待測樣品溶液，4℃循環過柱。之後用0.1mol/L、pH2.5甘氨酸溶液洗脫，收集洗脫液。
8、在酶標板中加入待測樣品洗脫液及標準PAT試劑，37℃溫育0.5h，之後洗滌拍幹；加入100ul酶標抗原溶液，37℃溫育0.5h；洗滌拍幹；每孔加入150ul底物混合液，室溫顯色15min；每孔加入50ul終止液(硫酸溶液)；酶標儀讀取各孔OD值。
9、繪製標準曲線用PAT蛋白標準品所獲各梯度溶液OD值，繪製標準曲線；結果見圖1。
10、根據標準曲線對樣品洗脫液中的PAT蛋白含量進行定量計算。
結果判定標準對照孔的OD值隨著PAT濃度的下降而升高，將樣品檢測孔OD值與標準對照孔的OD值比較，為了減少結果判斷的誤差，若檢測樣品的OD值比非轉基因食品的檢測值高出0.3則被判斷為陽性，結果見圖2。
檢測結果轉基因玉米Bt11，Bt176的檢測限達到10％，而轉基因油菜MS1/RF1，MS8/RF3的檢測限達到0.5％。
實施例2PAT蛋白檢測試劑盒的組建A試劑標準PAT試劑；B試劑稀釋液；C試劑酶標抗原試劑；D試劑酶標抗原稀釋液；E試劑含吐溫-20的磷酸鹽PBS固體；F試劑鄰苯二胺試劑；試劑醋酸鈉-檸檬酸緩衝液；H試劑30％H2O2；I試劑1M硫酸溶液；J試劑甘氨酸溶液；K試劑偶聯抗體sepharose-4B凝膠；包被PAT抗體的酶標板。
實施例31、樣品前處理分別稱取轉基因玉米Bt11，Bt176，轉基因油菜MS1/RF1，MS8/RF3葉片組織2g，加入5ml PBS/0.01M EDTA(pH7.5)，經超聲波破碎。然後12000rpm/min離心30min，重複兩次以去除不溶性的組織碎片，抽取上清液經孔徑為3MM的whatman濾膜過濾。濾過液-20℃凍存待測；整個操作過程要避免過熱導致蛋白變性。
2、試劑的配製標準PAT試劑PAT標準品加B試劑混勻，配成梯度溶液。
酶標抗原試劑C試劑加10ml D試劑溶解，混勻。
E洗滌液配製在E試劑中加入200ml蒸餾水配製E洗滌液，用於酶標板的洗滌。
底物混合液的配製用20ml G試劑稀釋40mg F試劑，再加入6ul H試劑，配製成底物混合液，現用現配。
3、IAC富集取5ml K試劑裝柱，先加入E洗滌液平衡，直至流出液的OD 280值小於0.5。再加入等體積待測樣品溶液，4℃循環過柱。之後用J試劑洗脫，收集洗脫液。
4、加樣包被PAT抗體的酶標板中加入待測樣品洗脫液和PAT標準溶液。37℃溫育0.5h。之後洗滌拍幹。
酶標板上，第1排標準對照，在前11孔加入PAT梯度溶液，第12孔加入空白對照，加入量為100ul。其餘各孔則加入待測的樣品洗脫液，加入量100ul。
5、加酶加入100ul酶標抗原溶液，37℃溫育0.5h；洗滌拍幹；顯色每孔加入150ul底物混合液，室溫顯色15min；終止每孔加入50ul I試劑；測定目測後，酶標儀讀取各孔OD值。
6、結果判定標準對照孔的OD值隨著PAT濃度的下降而升高，第12孔OD值應最高；將樣品檢測孔OD值與標準對照孔的OD值比較，為了減少結果判斷的誤差，若檢測樣品的OD值比非轉基因食品的檢測值高出0.3則被判斷為陽性。見圖2。
7、檢測結果轉基因玉米Bt11，Bt176的檢測限達到10％，而轉基因油菜MS1/RF1，MS8/RF3的檢測限達到0.5％。
權利要求
1.一種利用免疫親和層析和酶聯免疫吸附檢測樣品中PAT蛋白的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)製備酶標抗原將活化的辣根過氧化物酶與純化的PAT蛋白混合，製備酶標抗原；(3)製備PAT抗體；(4)製備偶聯PAT抗體的凝膠；(5)包被酶標板；(6)免疫親和層析純化將偶聯抗體的凝膠裝柱，加入樣品過柱，洗脫，收集洗脫液；(7)酶聯免疫吸附檢測將洗脫液加入經抗體包被的酶標板上，溫育後洗滌拍幹；加入酶標抗原，溫育後洗滌拍幹；顯色、終止；用酶標儀讀取OD值；(8)繪製標準曲線；(9)根據標準曲線對洗脫液中的PAT蛋白含量進行定量計算。
2.根據權利要求1所述的方法，其中樣品前處理採用稱取待測植物組織，經超聲波破碎；離心，取上清液過濾；濾過液凍存待測。
3.根據權利要求1所述的方法，其中製備酶標抗原採用將活化的辣根過氧化物酶與純化的PAT蛋白混合，在碳酸緩衝體系中進行標記反應，之後加入硼氫化鈉還原未結合位點。
4.根據權利要求1所述的方法，其中製備PAT抗體採用將紐西蘭白兔接種免疫，免疫抗原為PAT蛋白，頸動脈放血；分級沉澱血清中雜蛋白和抗體免疫球蛋白，之後將過柱獲得的液體透析，透析液離心後得含有PAT抗體的溶液，凍存備用。
5.根據權利要求1所述的方法，其中製備偶聯PAT抗體的凝膠採用先活化凝膠；將活化後的凝膠與PAT抗體振蕩混勻；離心洗滌以洗脫雜蛋白和未結合的抗體；依次用不同pH梯度溶液輪流洗滌封閉未結合的活性基團，再用磷酸緩衝液淋洗，冷藏保存備用。
6.根據權利要求1所述的方法，其中包被酶標板採用將PAT抗體包被在酶標板上，冷藏過夜；洗滌拍幹。
7.根據權利要求1所述的方法，其中免疫親和層析純化採用將偶聯抗體的凝膠裝柱，加入樣品，循環過柱，用甘氨酸溶液洗脫，收集洗脫液。
8.根據權利要求1所述的方法，其中酶聯免疫吸附檢測採用將樣品洗脫液加在經抗體包被的酶標板上，溫育後洗滌拍幹；加入酶標抗原，溫育後洗滌拍幹；繼而加入底物混合液顯色；終止反應；用酶標儀讀取OD值。
9.一種用於權利要求1-8所述之任一方法的試劑盒，其特徵在於它含有A試劑標準PAT蛋白試劑；C試劑酶標抗原試劑；K試劑偶聯PAT抗體的凝膠；包被PAT抗體的酶標板。
10.根據權利要求9所述的試劑盒，其特徵在於它還含有B試劑稀釋液；D試劑酶標抗原稀釋液；E試劑含吐溫-20的磷酸鹽PBS固體；F試劑鄰苯二胺試劑；G試劑醋酸鈉-檸檬酸緩衝液；H試劑30％H2O2；I試劑硫酸溶液；J試劑甘氨酸溶液。
全文摘要
本發明涉及一種PAT蛋白檢測方法，更確切地說它是利用免疫親和層析柱及酶聯免疫吸附方法來檢測轉bar和pat基因作物及其加工產品中的PAT蛋白，屬於免疫學和食品安全檢測技術領域。本發明的方法是以PAT蛋白為抗原進行動物免疫，獲得了特異性的多克隆抗體；將此抗體交聯到瓊脂糖凝膠上，製備免疫親和層析柱。被檢樣品經處理後，通過親和柱以富集其中的PAT蛋白；收集親和柱的洗脫液進行酶聯免疫吸附檢測，以確定其中的PAT蛋白含量。本發明還提供了所述方法的專用試劑盒。
文檔編號G01N33/543GK1696698SQ20051001174
公開日2005年11月16日 申請日期2005年5月19日 優先權日2005年5月19日
發明者許文濤, 黃崑崙, 鄧愛科, 羅雲波 申請人:中國農業大學