自組裝肽和高強度肽凝膠的製作方法

2023-08-05 08:21:21

專利名稱：自組裝肽和高強度肽凝膠的製作方法
技術領域：
本發明是關於可形成高強度肽凝膠的自組裝肽和由該自組裝肽所形成的肽凝膠。
背景技術：
在再生醫療領域的研究和實際治療中使用的支架(scaffold)(細胞的立足點)， 一般使用膠原蛋白凝膠。但是，這些膠原蛋白凝膠來自動物體，因而可能導致未知傳染疾病。作為消除感染未知疾病顧慮的一種手段，可使用由化學合成的材料製成的支架。作為這樣的材料，例如可以列舉專利文獻1或專利文獻2中公開的自組裝肽。但是，由專利文獻 1或2的自組裝肽得到的支架(肽凝膠)由於力學強度不夠，所以例如當用鑷子夾取時，有被捏碎等的操作性問題。而且，專利文獻1中的自組裝肽凝膠，在中性區域中，存在透明度不夠的問題。現有技術文獻專利文獻專利文獻1 :US5670483專利文獻2 :W02007/000979號公報

發明內容
發明所要解決的課題本發明旨在解決上述問題，其目的在於提供實用上具有足夠力學強度的肽凝膠以及可形成該肽凝膠的自組裝肽。用於解決課題的方法根據本發明，提供自組裝肽。該自組裝肽由下述胺基酸序列構成。胺基酸序列:a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4(該胺基酸序列中，B1 &為鹼性胺基酸殘基辦 b6為無電荷極性胺基酸殘基和/或疏水性胺基酸殘基，但其中至少5個為疏水性胺基酸殘基；Cl及C2為酸性胺基酸殘基；d為疏水性胺基酸殘基。)在優選實施方式中，上述胺基酸序列中，b3和b4為疏水性胺基酸殘基。在優選實施方式中，上述胺基酸序列中，Id1 b6全部為疏水性胺基酸殘基。在優選實施方式中，上述胺基酸序列中，h b6分別獨立，為丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基或異亮氨酸殘基。在優選實施方式中，上述胺基酸序列中，d為丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基、或異亮氨酸殘基。在優選實施方式中，上述自組裝肽由RLDLRLALRLDLR(序列編號1)、 RLDLRLLLRLDLR (序列編號 2、、RADLRLALRLDLR (序列編號 6)、RLDLRLALRLDAR (序列編號 7)、 RADLRLLLRLDLR (序列編號幻、RADLRLLLRLDAR (序列編號幻、RLDLRALLRLDLR (序列編號 10) 或RLDLRLLARLDLR(序列編號11)胺基酸序列構成。
在優選實施方式中，上述自組裝肽由RLDLRLALRLDLR(序列編號1)或 RLDLRLLLRLDLR(序列編號2)胺基酸序列構成。根據本發明的另一個方面，提供修飾肽。該修飾肽是通過修飾上述自組裝肽的N 末端氨基和/或C末端羧基而得到的，並且具有自組裝能力。在優選實施方式中，在上述N末端氨基和/或C末端羧基上，添加含有RGD的胺基酸序列。根據本發明的又一個方面，提供肽凝膠。該肽凝膠由含有上述自組裝肽和/或上述修飾肽的水溶液所形成。在優選實施方式中，上述水溶液還含有添加物。在優選實施方式中，上述添加物為選自pH調節劑、胺基酸類、維生素類、糖類、多糖類、醇類、多元醇類、色素、生理活性物質、酶、抗體、DNA和RNA中的至少一種。在優選實施方式中，上述肽凝膠，在22°C的溫度條件下，使用前端為直徑3. 2mm、 曲率半徑1. 6mm的球狀的夾具，以0. 05mm/s的壓縮速度進行壓縮試驗時，從壓縮開始到8 10秒後為止的測量值的近似直線中，每單位時間負荷變化量的絕對值L(g/s)為 0. 03g/s 以上。根據本發明的又一個方面，提供一種細胞培養用基材。該細胞培養用基材包含選自上述自組裝肽、上述修飾肽和上述肽凝膠中的至少一種。根據本發明的又一個方面，提供一種無菌肽的製造方法。該無菌肽的製造方法，包括加壓條件下，在100°c以上，將上述自組裝肽和/或修飾肽滅菌的工序。根據本發明的又一個方面，提供一種由肽凝膠包被物品的製造方法。由該肽凝膠包被物品的製造方法，包括冷凍上述肽凝膠的工序；融解該冷凍物製得肽溶膠的工序；用該肽溶膠將包被物品表面的至少一部分包被的工序；以及用肽溶膠再形成肽凝膠的工序。發明的效果根據本發明的具有特定胺基酸序列的自組裝肽，可獲得具有實用的力學強度的肽凝膠。


圖1是說明由n-RADARAAARADAR-c序列構成的肽間距離的示意圖。圖中的連接N 末端和C末端主鏈中的粗線表示肽鍵。圖2是表示實施例1中肽凝膠的壓縮試驗結果的圖。圖3 (a)是實施例1的肽凝膠用鑷子夾住時的照片，(b)是實施例2的肽凝膠用鑷子夾住時的照片，(c)是比較例1的肽凝膠用鑷子夾住時的照片。圖4是表示實施例2的肽凝膠的壓縮試驗結果的圖。圖5是表示實施例3的肽凝膠的壓縮試驗結果的圖。圖6是表示比較例1的肽凝膠的壓縮試驗結果的圖。圖7是表示比較例2的肽凝膠的壓縮試驗結果的圖。圖8是表示實施例4的肽凝膠的壓縮試驗結果的圖。
圖9是表示實施例7中細胞增殖率的圖。圖10(a)是滅菌處理前的肽水溶液的質譜分析結果，(b)是滅菌處理後的肽水溶液的質譜分析結果。圖11 (a)為滅菌處理前的商品名「Pura Matrix " (3D Matrix公司制)的質譜分析結果，(b)為滅菌處理後的商品名「Pura Matrix " (3D Matrix公司制)的質譜分析結果圖12(a)、(b)和(C)分別為凝膠移至培養皿時的照片、冷凍的凝膠照片和及肽凝膠均勻包被在整個表面的培養皿照片。圖13 (a)、(b)及(c)分別為凝膠移至載玻片時的照片、冷凍的凝膠照片、及肽凝膠均勻包被整個表面的載玻片照片。
具體實施例方式A.用語的定義(1)本說明書中，所謂「自組裝肽」，指在溶劑中通過肽分子之間相互作用而自發集合的肽。作為相互作用，並沒有特別限定，例如可以列舉氫鍵、離子間相互作用、範德華力等的靜電性相互作用、疏水性相互作用。在一個實施方式中，自組裝肽在室溫的水溶液(例如，的肽水溶液)中，自組裝可以形成納米纖維或凝膠。(2)本說明書中，所謂「凝膠」，指兼具粘性性質和彈性性質的粘彈性物質。(3)在本說明書中，「親水性胺基酸」包括精氨酸(Arg/R)、賴氨酸(Lys/K)、組氨酸 (His/H)等鹼性胺基酸，天冬氨酸(Asp/D)、穀氨酸(Glu/E)等酸性胺基酸，酪氨酸(Tyr/Y)、 絲氨酸(Ser/S)、蘇氨酸(Thr/T)、天冬醯胺(Asn/N)、穀氨醯胺(Gln/Q)、半胱氨酸(Cys/C) 等無電荷極性胺基酸。上述括號內的字母分別為胺基酸的三字母標記和單字母標記。(4)本說明書中，「疏水性胺基酸」包括丙氨酸(Ala/A)、亮氨酸(Leu/L)、異亮氨酸 (Ile/I)、纈氨酸(Val/V)、甲硫氨酸(Met/M)、苯丙氨酸(Phe/F)、色氨酸(Trp/W)、甘氨酸 (Gly/G)、脯氨酸(ftx)/P)等非極性胺基酸。上述括號內的字母分別為胺基酸之三字母標記和單字母標記。B.自組裝肽本發明的自組裝肽由下述胺基酸序列構成胺基酸序列:a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4(上述胺基酸序列中，B1 &為鹼性胺基酸殘基辦 b6為無電荷極性胺基酸殘基和/或疏水性胺基酸殘基，但其中至少5個為疏水性胺基酸殘基；Cl和C2為酸性胺基酸殘基；d為疏水性胺基酸殘基。)一般情況下，認為自組裝肽在水溶液中形成由配置親水性側鏈的面和配置疏水性側鏈的面所構成的β片層結構，並且認為通過在親水性面之間作用的氫鍵、離子間相互作用和在疏水性面間作用的疏水性相互作用等的相互作用，大量肽分子進行自發集合。因此， 在以往的自組裝肽中交替且等比例具有親水性胺基酸與疏水性胺基酸非常重要(例如，參照專利文獻1)。相對於此，如上所述，本發明的自組裝肽，由以第7位疏水性胺基酸殘基作為中心，每隔一個殘基在N末端方向和C末端方向上對稱的位置具有鹼性胺基酸殘基(第1、5、
69和13位)和酸性胺基酸殘基(第3和11位)的13個殘基的胺基酸序列構成。即，本發明的自組裝肽的特徵之一是沒有交替的親水性胺基酸與疏水性胺基酸。另外，本發明的自組裝肽的另一個特徵是不以等比例具有親水性胺基酸殘基和疏水性胺基酸殘基。此外，本發明的自組裝肽的再一個特徵是，以第7位疏水性胺基酸殘基作為中心，在特定的對稱位置具有4個鹼性胺基酸殘基和2個酸性胺基酸殘基，且N末端與C末端的胺基酸殘基均為鹼性胺基酸殘基。一般而言，可以認為第7位設為疏水性胺基酸殘基，對於β片層結構的形成是不利的，另外因為親水性胺基酸與疏水性胺基酸的比例不均等，故對於肽的自組裝能力造成不良影響。但是，本發明的自組裝肽具有優異的自組裝能力，而且可形成比以前的力學強度更優異的肽凝膠。儘管達到這種效果的理由不明確，但可以認為是由於除了將第 7位設為疏水性胺基酸，而且鹼性胺基酸殘基比酸性胺基酸殘基多2個，並在特定位置上具有各個的胺基酸殘基，從而維持形成β片層結構的能力的同時，在肽分子間靜電引力和靜電斥力還以極優異的平衡發揮作用。構成上述自組裝肽的胺基酸可為L-胺基酸，也可為D-胺基酸。另外，可為天然胺基酸，也可為非天然胺基酸。從價格低廉且肽合成容易出發，優選天然胺基酸。上述胺基酸序列中，％ &為鹼性胺基酸殘基。鹼性胺基酸優選精氨酸、賴氨酸或組氨酸，更優選為精氨酸或賴氨酸。這是因為這些胺基酸具有很強的鹼性。％ &可為相同的胺基酸殘基，也可為不同的胺基酸殘基。上述胺基酸序列中，Id1 b6為無電荷極性胺基酸殘基和/或疏水性胺基酸殘基， 其中至少5個為疏水性胺基酸殘基。疏水性胺基酸優選為丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甘氨酸或脯氨酸。無電荷極性胺基酸優選為酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺、穀氨酸或半胱氨酸。這是因為這些胺基酸易於取得。優選b3及b4各自獨立，為任意合適的疏水性胺基酸殘基，更優選是亮氨酸殘基、 丙氨酸殘基、纈氨酸殘基或異亮氨酸殘基，特別優選是亮氨酸殘基或丙氨酸殘基。在上述胺基酸序列中，當分別位於第6位與第8位的b3與b4為疏水性胺基酸殘基時，第6 8位的三個胺基酸殘基連續為疏水性胺基酸殘基。可以推測這樣在胺基酸序列中心形成疏水性區域，能有助於通過該疏水性相互作用形成強度優異的肽凝膠。優選1^ 136全部為疏水性胺基酸殘基。這是因為自組裝肽適於形成β片結構且可以自組裝。更優選h b6分別獨立地為亮氨酸殘基、丙氨酸殘基、纈氨酸殘基或異亮氨酸殘基，更優選是亮氨酸殘基或丙氨酸殘基。在優選實施方式中，1^ 136之中有4個以上為亮氨酸殘基，特別優選其中5個以上為亮氨酸殘基，最優選全部為亮氨酸殘基。這是因為獲得的自組裝肽有好的水溶性，而且，可形成高強度的肽凝膠。上述胺基酸序列中，C1和C2為酸性胺基酸殘基。酸性胺基酸優選為天冬氨酸或穀氨酸。這是因為這些胺基酸易於取得。C1和C2可以是相同的胺基酸殘基，也可以是不同的
胺基酸殘基。上述胺基酸序列中，d為疏水性胺基酸殘基。如上所述，可以認為通過d為疏水性胺基酸殘基，且具有特定的對稱結構，則上述自組裝肽可以形成比以往肽凝膠力學強度上更加優異的肽凝膠。儘管達到這樣的效果的原因尚不清楚，但推測的可能原因是本發明的自組裝肽，在第7位的胺基酸殘基d為疏水性胺基酸殘基，使得自組裝過程中肽分子之間的重疊保持恆定，能夠形成均勻性高的集合狀態。
d優選為丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基或異亮氨酸殘基。此時，自組裝肽形成的β片層結構的親水性面一側的胺基酸的側鏈長度上變成非互補的，但該自組裝肽可以發揮優良的自自組裝能力，而且可以形成比以往力學強度更優異的肽凝膠。這是與以往看法大為不同的效果，以往看法為了獲得適合於自組裝的靜電引力，優選β片層結構的親水面一側的胺基酸的側鏈長度上互補。此處，所謂「側鏈長度互補」，指構成一對發揮相互作用的胺基酸殘基(例如，鹼性胺基酸殘基和酸性胺基酸殘基)的側鏈長的原子數之和一定。 例如，圖1是說明側鏈長度非互補時的肽間的距離的示意圖。如圖1所示，主要參與用點線圍住的丙氨酸殘基-精氨酸殘基對的側鏈長度的原子數之和(7)，比主要參與用實線圍住的天冬氨酸殘基-精氨酸殘基對的側鏈長的原子數之和(9)小。上述自組裝肽所含的胺基酸殘基在中性區域的電荷總和，實質上為+2。S卩，上述自組裝肽，在中性區域中來自該肽所含的胺基酸殘基的側鏈的正電荷和負電荷沒有相互抵消。加上，由於N末端和C末端的胺基酸殘基均為鹼性胺基酸殘基，因此本發明的自組裝肽， 例如，在肽分子間除了靜電引力還有靜電斥力作用，而且這些相互作用保持了微秒的平衡從而實質上不會產生過度締合，因此在中性區域下，不會沉澱，而可以形成穩定的凝膠。另外，在本說明書中，所謂「中性區域」，指ρΗ為6 8、優選是ρΗ在6. 5 7. 5的區域。各ρΗ中的上述自組裝肽的電荷，例如，可根據Lehninger (Biochimie, 1979)方法計算。Lehninger 方法例如牛艮據 EMBL WffffGateway to Isoelectric Point Service 的網址 (http://www. embl-heidelberg, de/cgi/pi-wrapper. pi)上可禾丨J用的禾呈序進行計算。含有上述自組裝肽的水溶液，可形成力學強度優異的肽凝膠。一個實施方式中，自組裝肽的水溶液(優選為0. 2 5W/v%、更優選為0. 2 2W/v%、特別優選為0. 2 Iw/ v%、最優選為0. 3 0. 8w/v% )，在22°C的溫度條件下，使用前端為直徑3. 2mm、曲率半徑1. 6mm的球狀物的夾具，以0. 05mm/s的壓縮速度進行壓縮試驗，可形成從壓縮開始至初期(8 10秒為止)的測定值的近似直線中每單位時間負荷變化的絕對值L(g/s)優選為 0. 03g/s以上、更優選為0. 035g/s以上、特別優選為0. 04g/s以上的膠。如後述實施例中所述，該壓縮試驗，例如，可使用裝有不鏽鋼製夾具(TA Instrument公司制)的粘彈性測量裝置(TAhstrument公司制，產品編號「RSAIII」)進行。以下例示本發明中優選實施方式的自組裝肽。n-RLDLRLALRLDLR-c (序列編號 1)n-RLDLRLLLRLDLR-c (序列編號 2)
n-RADLRLALRLDLR-c (序列編號 6)n-RLDLRLALRLDAR-c (序列編號 7)n-RADLRLLLRLDLR-c (序列編號 8)n-RADLRLLLRLDAR-c (序列編號 9)n-RLDLRALLRLDLR-c (序列編號 10)n-RLDLRLLARLDLR-c (序列編號 11)上述自組裝肽，可根據任何適合的製造方法所製造。可列舉例如Fmoc法等的固相法或液相法等化學合成方法、基因重組表達等的分子生物學的方法。C.修飾肽本發明的修飾肽，只要具有自組裝能力，就可對上述自組裝肽施以任意的修飾。進行修飾的部位，可為上述自組裝肽之N末端氨基，也可為C末端羧基，或者兩者兼有。作為上述修飾，在一定範圍內，可在所得的修飾肽為具有自組裝能力的範圍中，選擇任意的適當修飾。可列舉例如，導入N末端氨基的乙醯化、C末端羧基的醯胺化等的保護基，導入烷基化、酯化或滷化等的官能團，氫化，導入單糖、二糖、寡糖或多糖等的糖化合物， 導入脂肪酸、磷脂質或糖脂質等脂質化合物，導入胺基酸或蛋白質，導入DNA，以及導入其它具有生理活性的化合物等。當導入胺基酸或蛋白質時，導入後的肽為在上述自組裝肽的N 末端和/或C末端添加任意胺基酸的肽。在本說明書中，該添加肽也包含在修飾肽中。修飾可僅進行一種，也可組合進行2種以上。例如，可將期望的胺基酸導入上述自組裝肽的C 末端的添加肽的N末端乙醯化，也可以C末端醯胺化。上述添加肽(修飾肽)，作為一個整體，有時不具有上述自組裝肽的特徵。具體而言，有通過任意的胺基酸的添加，以第7位的疏水性胺基酸序列為中心，N末端方向的序列和C末端方向的序列為非對稱性的情況，以相等比例含有疏水性胺基酸和親水性胺基酸的情況等。即使在這樣的情況，上述自組裝肽也具有極優異的自組裝能力，因此可以形成添加任意胺基酸的添加肽、或力學強度優異的肽凝膠。當導入胺基酸或蛋白質時，構成導入後修飾肽的胺基酸殘基數目，優選為14 200，更優選為14 100，更加優選為14 50，特別優選為14 30，最優選為14 20個。 這是因為如果胺基酸殘基數目超過200個，則有損害自組裝肽的自組裝能力的情況。所導入的胺基酸種類和位點，可根據修飾肽的用途等適當設定。更優選從自組裝肽的N末端和/或C末端的精氨酸殘基(親水性胺基酸)，交替導入疏水性胺基酸與親水性胺基酸。作為導入胺基酸的具體情況，例如，作為細胞黏著因子，可列舉REDV、EILDV、 YEKPGSPPREVVPRPRPGV、KNNOKSEPLIGRK、YIGSR、RNIAELLKDI, RYVVLPRPVCFEKGMNYTVR, IKVAV、PDSGR 和含有 RGD 序列的胺基酸序列(例如，GRGDSPASS、RGDN、RGDF, RGDT, RGDA, RGD和RGDS)等；作為核轉運信號可列舉PH(KKRKV、PAAKRVKLD、PQPKKKP和QRKRQK等；作為內質網轉運信號可列舉MMSFVSLLLVGILFWATEAEQLTLCEVFQ等；作為線粒體轉運信號可列舉MLSLRQSIRFFLPATRTLCSSRYLL等。這些序列可單獨導入，也可作為多個序列的組合導入。 另外，所導入的胺基酸序列和上述自組裝肽，也可通過在其間一個以上任意的胺基酸連結。上述修飾可根據其種類等，可通過任意適合的方法進行。含有上述修飾肽的水溶液，可形成力學強度優異的肽凝膠。在1個實施方式中， 修飾肽的水溶液(優選為0. 2 5W/v%，更優選為0. 2 2W/v%，特別優選為0. 2 Iw/ v%，最優選為0. 3 0. 8w/v% )在22°C的溫度條件下，使用前端為直徑3. 2mm、曲率半徑 1. 6mm的球狀的夾具，以0. 05mm/s的壓縮速度進行壓縮試驗中，可形成從壓縮開始至初期 (壓8 10秒後為止)的測定值的近似直線中，每單位時間的負荷變化量的絕對值L(g/s) 優選為0. 03g/s以上，更優選為0. 035g/s以上，特別優選為0. 04g/s以上的凝膠。D.肽凝膠本發明的肽凝膠，由含有上述自組裝肽和/或上述修飾肽(以下，有時將上述「自組裝肽和/或修飾肽」稱為「本發明的肽」)的水溶液所形成。推測本發明的肽在水溶液中自發集合，形成具有納米尺度寬度的纖維狀分子集合體、所謂的納米纖維，且以該納米纖維間作用的靜電相互作用作為主因形成三維網狀結構，進而形成凝膠。該水溶液中所含的本發明的肽，可僅為1種，也可為2種以上。該水溶液中除了本發明的肽和水之外，還可進一步含有任意適當的添加物。此外，該水溶液還可含有細胞等的不溶物。上述水溶液中的本發明的肽濃度優選為0. 2 5W/V%，更優選為0. 2 2W/V%， 特別優選為0. 2 lW/v%，最優選為0. 3 0. 8W/v%。濃度在此範圍內，可取得力學強度優異的肽凝膠。此外，使用該肽凝膠作為細胞培養用基材時，可取得良好的細胞生存率。上述添加物可根據肽凝膠的用途、所含肽的種類等恰當選擇。作為添加物的具體例子，可列舉氫氧化鈉、氫氧化鉀、鹽酸、磷酸、碳酸氫鈉、碳酸鈉等的PH調節劑，胺基酸類， 維生素A、維生素B群、維生素C、維生素D、維生素E及其衍生物等的維生素類，單糖、二糖、 寡糖等的糖類，透明質酸、殼聚糖、親水化纖維素等的多糖類，乙醇、丙醇、異丙醇等的醇類， 甘油、丙二醇等的多元醇類，酚紅等的色素，荷爾蒙、細胞因子(造血因子、生長因子等)、肽等生理活性物質，酶，抗體，DNA，RNA，其它一般的低分子化合物。添加物可僅添加1種，也可組合添加2種以上。水溶液中的添加物濃度可根據目的、肽凝膠的用途等恰當設定。作為含有添加物的水溶液的具體例，可列舉磷酸緩衝化生理食鹽水(PBS)、 Tris-HCl等的各種緩衝液、Dulbecco改進的fegle培養基(DMEM)等細胞培養用培養基、由氫氧化鈉、鹽酸、碳酸氫鈉等調整PH的水溶液。上述水溶液可根據目的而為任意適當的pH。例如，溶解本發明肽前後的水溶液的 PH，分別優選為5 9，更優選為5. 5 8，特別優選為6. 0 7. 5。若在此範圍，則可獲得力學強度優異的肽凝膠。而且，上述水溶液含有細胞時，可取得良好的細胞生存率。此外， 若PH值在此範圍內，則在高溫加壓條件下難以發生肽的分解，故可實施高壓滅菌鍋等的高壓蒸汽滅菌處理。其結果，可以簡便地獲得無菌狀態的肽凝膠。作為上述細胞，可根據目的，選擇任何適當的細胞。細胞可為動物細胞，也可為植物細胞。作為細胞的具體例，可列舉軟骨細胞、成肌細胞、骨髓細胞、纖維原細胞、肝細胞、心肌細胞等。本發明的肽凝膠，在22°C的溫度條件下，使用前端為直徑3. 2mm、曲率半徑1. 6mm 的球狀的夾具，以0. 05mm/s的壓縮速度進行的壓縮試驗中，由從壓縮開始至初期(8 10 秒後為止)的測定值的近似直線中，顯示優選為0.03g/s以上、更優選為0.035g/s以上、特別優選為0. 04g/s以上的每單位時間的負荷變化量的絕對值L(g/s)。具有上述力學強度的肽凝膠，例如，可以從以優選為0. 2 5W/v%、更優選為0. 2 2W/v%、特別優選為0. 2 1W/V%、最優選為0. 3 0. 8W/v%的濃度含有本發明的肽的水溶液中形成。在含有IOmm長光路的比色皿中，以380nm 780nm的吸光度測定的可見光透射率，優選為50%以上，更優選為70%以上，特別優選為90%以上。具有上述可見光透射率的肽凝膠，例如，可從含有0. 2 2w/V%濃度本發明肽的水溶液形成。此外，該肽凝膠在室溫下以密封狀態長期間(例如，2個月)放置後的可見光透射率的降低率(％ ) (100-(保存後的可見光穿透率/保存前的可見光穿透率X 100))優選為30%以下，更優選為20%以下， 特別優選為10%以下。具有如此高可見光透射率的肽凝膠，當作為細胞培養用基材時，具有易於通過螢光顯微鏡等觀察細胞等的優點。可見光透射率，例如，可使用UV/VIS測定裝置進行測量。上述肽凝膠可通過任意適合的方法形成。典型方法是上述肽凝膠可通過將含有至少一種本發明的肽的水溶液靜置而形成。靜置時的溫度或時間，只要可將本發明的肽自組裝形成凝膠即可沒有特別限制，可根據凝膠的使用目的，該肽的種類、濃度等適當設定。靜置時間通常為1分鐘以上，優選在3分鐘以上，更優選在5分鐘以上。溫度通常為4 50°C， 更優選為15 45°C。Ε.自組裝肽、修飾肽和肽凝膠的用途作為本發明的自組裝肽、修飾肽和肽凝膠的優選用途，可以列舉例如，細胞培養用基材，護膚用品、護髮用品等的化妝品，褥瘡製劑、骨填充劑、美容形成用注入劑、眼科用手術輔助劑、人工玻璃體、人工水晶體、關節潤滑劑、點眼劑、DDS基材、止血劑等醫藥品，溼潤用保水劑，乾燥劑，隱形眼鏡等的醫療器械的被膜劑。F.細胞培養用基材本發明的細胞培養用基材，包含上述自組裝肽、修飾肽和肽凝膠中的至少一種。本發明的細胞培養用基材，因為由化學合成所得的自組裝肽和/或修飾肽所形成，所以不會混入病原體等，可安全地培養細胞。此外，通過上述本發明的肽形成的凝膠，在中性區域透明、且力學強度優異，因此本發明的細胞培養基材在細胞培養時的辨視性和操作性優異。上述細胞培養基材，在其內部本發明的肽自組裝成纖維狀，進一步形成三維網狀結構。因此，不僅可在細胞培養基材上培養，也可在細胞培養基材中培養。在細胞培養基材上培養時，在已經形成的含有本發明肽的肽凝膠上，載放培養對象的細胞即可培養。在細胞培養基材中培養時，將本發明的肽或肽的水溶液與細胞或細胞懸浮液混合，並從該混合物形成肽凝膠即可培養。肽凝膠的液相，可通過溶劑置換，置換為所需的培養液。溶劑置換，例如，可使用商品名「Cell Culture Insert」等進行。肽凝膠的詳細信息(肽濃度、水溶液(混合物)所含的添加物種類、PH值等)和形成方法如上述D項所記載。培養對象的細胞可根據目的等，選擇任何適當的細胞。細胞可為動物細胞，也可為植物細胞。作為細胞的具體例，可列舉軟骨細胞、成肌細胞、骨髓細胞、纖維原細胞、肝細胞、 心肌細胞等。培養液和培養條件可根據培養細胞的種類、目的等恰當選擇。本發明的細胞培養用基材，具有優異的生物體適應性和安全性，因此，例如，在再生醫療等領域的三維細胞培養中可適當利用。G.無菌肽的製造方法本發明的無菌胜肽製造方法，包括將自組裝肽和/或修飾肽在加壓條件下，在 100°C以上進行滅菌的工序。典型的為，這些肽以肽的水溶液或由該肽的水溶液所形成的肽凝膠形態供給滅菌處理。該肽水溶液的PH優選為5 9，更優選為5. 5 8，特別優選為 6. 0 7. 5。如果為這樣的pH，則即使在100°C以上的溫度條件滅菌，實質上也不會發生肽的分解，因此可獲得無菌狀態的本發明的肽。關於肽的水溶液和肽凝膠，如上述D項所記載。作為滅菌方法，可採用任意適當的滅菌方法。例如，可以優選使用由高溫高壓的飽和水蒸氣進行滅菌(所謂高壓滅菌鍋滅菌)的方法。高壓滅菌鍋滅菌時的壓力優選為 0. 122 0. 255MPa，更優選為0. 152 0. 233MPa。另外，滅菌溫度優選為105 135 °C，更優選為Iio 125°c。此外，滅菌時間優選為1 60分鐘，更優選為3 40分鐘，特別優選為5 30分鐘。高壓滅菌鍋滅菌可使用市售的高壓滅菌鍋裝置進行。H.由肽凝膠包被的物品的製造方法
技術領域：
本發明的由肽凝膠包被的物品的製造方法，包括以下工序冷凍上述肽凝膠的工序(冷凍工序)；融解該冷凍物得到肽溶膠的工序(融解工序)；將包被對象物品表面的至少一部分用肽溶膠包被的工序(包被工序)；以及由該肽溶膠再形成肽凝膠的工序(凝膠化工序)。該方法，根據需要，可進一步含有任意適當的工序。通過冷凍融解本發明的肽凝膠，肽分子間的鍵切斷，從而構成凝膠的三維網狀結構被破壞，因此可獲得肽分子在水溶液中均勻分散的溶膠。以該均勻性高的溶膠包被對象物品表面的至少一部分後，通過凝膠化該溶膠，就可以由肽凝膠均勻包被該物品的表面。H-1.冷凍工序冷凍條件，只要可將肽凝膠冷凍，可採用任意恰當的條件。冷凍溫度，只要為肽凝膠冷凍溫度以下即可。冷凍速度沒有限制，可慢慢冷凍，也可急速冷凍。例如，可將肽凝膠於-10°C以下的溫度條件放置而適當冷凍。作為冷凍手段，可選擇家庭用或商用冰箱、液態氮等任意適當的冷凍手段。另外， 已冷凍的肽凝膠，可在供給融解工序之前的任意期間，直接以冷凍態保存。當冷凍的肽凝膠是由含有添加物的肽水溶液形成的凝膠時，該添加物的濃度，優選為不會對凝膠化工序中凝膠再形成造成不良影響的濃度。該濃度可根據肽的種類、濃度等恰當設定，通常，優選低濃度。例如，在HEPES和Tris-HCl的溶液中，其終濃度優選為50mM 以下，更優選為40mM以下。在碳酸氫鈉溶液和碳酸鈉溶液時，其終濃度優選為5mM以下、更優選為4mM以下。在PBS溶液時，其終濃度優選為0. 5 X PBS以下、更優選為0. 3 X PBS以下。 此外，在藥典生理食鹽水時，其最終濃度優選為0. 5重量％以下、更優選為0. 4重量％以下。H-2.融解工序融解溫度，只要是融解上述冷凍工序所得的冷凍物並形成溶膠的溫度，就可以設定為任何適當的溫度。可以在恆定溫度融解，也可以在不同溫度階段性融解。融解速度和時間並無限制，可慢慢融解，也可急速融解。例如，在5 70°C、優選在15 45°C的溫度條件下放置已冷凍的肽凝膠，可恰當進行融解。融解手段，可選擇任意合適的手段。作為融解手段的具體例，可列舉水浴、油浴、恆
溫槽等。如上所述，通過冷凍融解肽凝膠，則可將形成肽凝膠的肽分子間的各種鍵切斷而得到溶膠。經由冷凍融解製得的溶膠中，因為肽分子間的各種鍵充分斷裂且粘度顯著降低， 故可容易地均勻包被對象物品表面。另外，從進一步提高溶膠均勻性的觀點出發，可以一邊以溶膠內不會發生氣泡的程度提供振動，一邊融解已冷凍的肽凝膠，還可以對所得的溶膠提供振動後再進行包被工序。作為提供振動的方法，可列舉搖動已冷凍的肽凝膠或溶膠，對其照射超聲波等。H-3.包被工序作為包被方法，可採用任意恰當的方法。作為具體例，可列舉分散器塗布方式、浸漬方式、棒塗方式、由離心力在包被對象物品的表面將溶膠展開的方式、傾斜包被對象物品使溶膠流動並在對象物品表面展開的方式。在上述溶膠中，肽分子間的各種鍵完全斷裂且粘度顯著降低，而且肽分子充分分散，因此可在包被對象物品表面形成均勻層。包被對象物品，可採用任意合適的物品。可列舉例如，管、瓶等的容器，多孔培養皿 (multi-well dish)、培養皿等的細胞培養器具，載玻片等的平板。包被對象物品可由玻璃、塑料、金屬等任意材料形成。H-4.凝膠化工序凝膠的再形成條件(溫度、時間等)，只要可再形成肽凝膠就沒有限制，可根據肽的種類和濃度等恰當設定。本發明的肽因為具有自組裝能力，所以通過設定合適的條件，就可自行集合併自發再形成凝膠。作為凝膠的再形成條件，例如，靜置表面經上述肽凝膠包被的物品即可。靜置溫度優選為15°C以上，更優選為25 45°C。靜置時間優選為1分鐘以上，更優選為5分鐘以上。凝膠化工序中再形成的肽凝膠厚度，即，物品表面的包被膜厚度，例如在IymW 上，優選在1 μ m Icm0實施例以下，根據實施例具體說明本發明，但本發明不被這些實施例所限定。[實施例1]根據Fmoc固相合成法，合成出由表1列出的序列編號1的胺基酸序列構成的自組裝肽。其次，通過常規方法，將N末端乙醯化，並將C末端醯胺化，獲得修飾肽 1 ([CH3CO] -RLDLRLALRLDLR- [NH2])。將獲得的修飾肽1以0. 2,0. 4、和0. 6W/V%濃度，分別溶解於0. 1重量％的碳酸氫鈉溶液中，獲得肽溶液。獲得的肽溶液，使用PH試紙(商品名pH Indicator Papers, Whatman International Ltd.制，測定範圍 pH = 6. 0 8. l，Cat. No.洸四990)測定pH值， 結果PH值在6. 9 7. 8的範圍內。通過在商品名「Nunc Tissue Culture Inserts」(膜直徑:10mm，孔徑:8. 0 μ m，膜材料聚碳酸酯)(Nalge Nunc International公司制，產品編號 "Cat. No 136862」)中加入300 μ 1該肽溶液，並在22°C條件下靜置2小時，形成凝膠。凝膠厚度大約為2mm。通過對所得凝膠由DMEM進行12小時溶劑置換，獲得0. 2,0. 4、及0. 6w/
的肽凝膠1 (液相DMEM)。所得各濃度的肽凝膠1供給下列的壓縮試驗使用，測定力學強度。[壓縮試驗]在22 °C的條件下，使用前端為球狀(直徑3. 2mm,曲率半徑1. 6mm)的不鏽鋼製夾具(TAhstrument公司制)的粘彈性測定裝置(TAhstrument公司制，產品編號「RSA III」)，通過以0.05mm/s(s =秒)的速度壓縮凝膠，測定力學強度。壓縮試驗的結果在圖2中表示。圖2表示夾具逐漸擠壓樣品時裝置所受的負荷與時間的關係，近似直線的斜率越大說明力學強度越高。因此，將從壓縮開始後初期(8 10 秒鐘後為止)的測定值的近似直線斜率(每單位時間的負荷變化量)的絕對值定義為L，L 值越大則力學強度越高。如圖2所示，0.的肽凝膠1在上述壓縮試驗中的從壓縮開始後約10秒鐘位置的每單位時間的負荷變化量的絕對值L為0. 0476g/s。由鑷子夾住0.肽凝膠1搬運時，其結果如圖3(a)所示，該肽凝膠1具有用於夾持的足夠強度，且操作性優異。[實施例2]除了採用序列編號2的胺基酸序列代替序列編號1的胺基酸序列以外，同實施例 1 一樣處理，獲得修飾肽2 ([CH3CO]-RLDLRLLLRLDLR-[NH2])。除了用修飾肽2代替修飾肽1 以外，同實施例1 一樣處理，從而獲得0. 2、0. 4和0. 6w/v%的肽凝膠2 (液相DMEM)。
關於所得的肽凝膠，與實施例1同樣測定力學強度。結果示於圖4中。如圖4所示， 在0. 的肽凝膠2的上述壓縮試驗中，每單位時間的負荷變化量絕對值L為0. 0423g/
So由鑷子夾住0.的肽凝膠2搬運時，結果如圖3(b)所示，肽凝膠2具有用於夾持的足夠強度，且操作性優異。[實施例3]除了採用序列編號3的胺基酸序列代替序列編號1的胺基酸序列以外，同實施例 1 一樣處理，獲得修飾肽3 ([CH3CO] -RLDLRLALRLDLRL- [NH2])。除了使用修飾肽3代替修飾勝1以外，同實施例1 一樣處理，從而獲得0. 2和0.的肽凝膠3 (液相DMEM)。關於所得的肽凝膠，與實施例1同樣測定力學強度。結果示於圖5。如圖5所示，在 0. 的肽凝膠3的上述壓縮試驗中，每單位時間的負荷變化量的絕對值L為0. 0336g/So[比較例1]除了採用序列編號4的胺基酸序列代替序列編號1的胺基酸序列以外，同實施例 1 一樣處理，獲得修飾肽cl ([CH3CO]-RASARADARADARASA-[NH2])。除了使用修飾肽cl代替修飾肽1以外，同實施例1 一樣處理，形成0. 2、0. 4和0. 6W/V%的肽溶膠cl (液相DMEM)。關於所得的肽凝膠，與實施例1同樣測定力學強度。結果示於圖6。如圖6所示，在 0. 的肽凝膠cl的上述壓縮試驗中，每單位時間的負荷變化量的絕對值L為0. 0143g/So由鑷子夾住0.的肽凝膠cl搬運時，結果如圖3(c)所示，該肽凝膠cl力學強度不夠充分，操作性方面有問題。[比較例2]除了採用序列編號5的胺基酸序列代替序列編號1的胺基酸序列以外，同實施例 1 一樣處理，獲得修飾肽c2 ([CH3CO] -RASARADARASARADA- [NH2])。除了使用修飾肽c2代替修飾肽1以外，同實施例1 一樣處理，形成0. 2和0.的肽凝膠c2 (液相DMEM)。關於所得的肽凝膠，與實施例1同樣測定力學強度。結果示於圖7。如圖7所示，在 0. 的肽凝膠c2的上述壓縮試驗中，每單位時間的負荷變化量的絕對值L為0. 0167g/
So[實施例4]除了採用序列編號12的胺基酸序列代替序列編號1的胺基酸序列以外，同實施例 1 一樣處理，獲得修飾肽4(
-1 0殿0)1^1^1^0)1^-[冊2])。除了使用修飾肽4代替修飾肽1以外，同實施例1 一樣處理，形成0. 2、0. 4和0. 6W/V%的肽溶膠4 (液相DMEM)。關於所得的肽凝膠，與實施例1同樣測定力學強度。結果示於圖8。如圖8所示，在 0. 的肽凝膠4的上述壓縮試驗中，每單位時間的負荷變化量的絕對值L為0. 0618g/[表1]
權利要求
1.一種自組裝肽，其特徵在於由下列胺基酸序列構成，胺基酸序列:a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4該胺基酸序列中，％ &為鹼性胺基酸殘基辦 b6為無電荷極性胺基酸殘基和/或疏水性胺基酸殘基，但其中至少5個為疏水性胺基酸殘基；Cl及C2為酸性胺基酸殘基；d為疏水性胺基酸殘基。
2.如權利要求1所述的自組裝肽，其特徵在於所述胺基酸序列中，b3和b4為疏水性胺基酸殘基。
3.如權利要求1或2所述的自組裝肽，其特徵在於所述胺基酸序列中，h b6全部為疏水性胺基酸殘基。
4.如權利要求1 3中任一項所述的自組裝肽，其特徵在於所述胺基酸序列中，1^ 136分別獨立地為丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基或異亮氨酸殘基。
5.如權利要求1 4中任一項所述的自組裝肽，其特徵在於所述胺基酸序列中，d為丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基或異亮氨酸殘基。
6.如權利要求1 5中任一項所述的自組裝肽，其特徵在於其是由 RLDLRLALRLDLR (序列編號 1)、RLDLRLLLRLDLR (序列編號 2)、 RADLRLALRLDLR (序列編號 6)、RLDLRLALRLDAR (序列編號 7)、RADLRLLLRLDLR (序列編號 8)、 RADLRLLLRLDAR (序列編號幻、RLDLRALLRLDLR (序列編號 10)或 RLDLRLLARLDLR (序列編號 11)的胺基酸序列構成的肽。
7.如權利要求1 6中任一項所述的自組裝肽，其特徵在於其是由RLDLRLALRLDLR(序列編號1)或RLDLRLLLRLDLR(序列編號2)的胺基酸序列構成的肽。
8.一種具有自組裝能力的修飾肽，其特徵在於其由權利要求1 7中任一項所述的自組裝肽的N末端氨基和/或C末端羧基經修飾後得到的肽。
9.如權利要求8所述的具有自組裝能力的修飾肽，其特徵在於在所述N末端氨基和/或C末端羧基上添加含有RGD的胺基酸序列。
10.一種肽凝膠，其特徵在於由含有權利要求ι 7中任一項所述的自組裝肽和/或權利要求8或9所述的修飾肽的水溶液所形成。
11.如權利要求10所述的肽凝膠，其特徵在於所述水溶液還含有添加物。
12.如權利要求11所述的肽凝膠，其特徵在於所述添加物選自PH調節劑、胺基酸類、維生素類、糖類、多糖類、醇類、多元醇類、色素、 生理活性物質、酶、抗體、DNA和RNA中的至少一種。
13.如權利要求10 12中任一項所述的肽凝膠，其特徵在於在22°C的溫度條件下，使用前端為直徑3. 2mm、曲率半徑1. 6mm的球狀夾具，以0. 05mm/ s的壓縮速度進行壓縮試驗時，從壓縮開始至8 10秒鐘後為止的測定值的近似直線中，每單位時間的負荷變化量的絕對值L(g/s)為0. 03g/s以上。
14.一種細胞培養用基材，其特徵在於其含有選自權利要求1 7中任一項所述的自組裝肽、權利要求8或9所述的修飾肽和權利要求10 13中任一項所述的肽凝膠中的至少一種。
15.一種無菌肽的製造方法，其特徵在於，包括將權利要求1 7中任一項所述的自組裝肽和/或權利要求8或9所述的修飾肽，在加壓條件下，在100°C以上滅菌的工序。
16.一種以肽凝膠包被的物品的製造方法，其特徵在於，包括 冷凍權利要求10 13中任一項所述的肽凝膠的工序； 融解該冷凍物而得肽溶膠的工序；將包被對象物品的表面的至少一部分用肽溶膠包被的工序；以及由該肽溶膠再形成肽凝膠的工序。
全文摘要
本發明旨在提供實用上具有足夠力學強度的肽凝膠和可形成該肽凝膠的自組裝肽。本發明的自組裝肽由下列胺基酸序列構成。胺基酸序列a1b1c1b2a2b3db4a3b5c2b6a4(該胺基酸序列中，a1～a4為鹼性胺基酸殘基；b1～b6為無電荷極性胺基酸殘基和/或疏水性胺基酸殘基，但其中至少5個為疏水性胺基酸殘基；c1和c2為酸性胺基酸殘基；d為疏水性胺基酸殘基)。
文檔編號C07K7/00GK102348717SQ20108001113
公開日2012年2月8日 申請日期2010年2月12日 優先權日2009年3月9日
發明者上杉晃司, 成瀨惠治, 橫井秀典, 永井祐介 申請人:國立大學法人岡山大學, 株式會社美你康