一種甘薯黑斑病菌的檢測方法
2023-08-05 08:31:21 2
一種甘薯黑斑病菌的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種甘薯黑斑病菌的檢測方法，屬於生物工程【技術領域】。具體步驟為：設計合成一對甘薯黑斑病菌特異性引物SPCPF和SPCPR；提取待檢測樣品的總DNA，以提取的總DNA作為模板，利用引物CSPCPF和SPCPR進行PCR擴增；用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。本發明方法簡便、快速、靈敏，不僅能對病菌菌絲體進行檢測，也能對感病的薯苗和薯塊進行檢測；本發明的檢測方法能實現對甘薯黑斑病的早期檢測，還能有效區分甘薯上的相似病害黑痣病、軟腐病、幹腐病；對甘薯黑斑病的早期預警和防控，防治病害的擴散蔓延具有重要意義。
【專利說明】一種甘薯黑斑病菌的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程【技術領域】，涉及病菌檢測方法，具體涉及一種甘薯黑斑病菌的檢測方法。
【背景技術】
[0002]甘薯黑斑病由甘薯長_殼菌fimbriataEllis and Halsted)侵染甘薯引起，是嚴重危害甘薯生產的三大病害之一，每年由於該病造成的產量損失一般為5%~10%，危害嚴重時造成的損失高達20%~50%，甚至更高。此外，病薯還可產生甘薯黑斑黴酮(ipomeama rone)和甘薯黑斑黴二酮(ipomeanine)等有毒物質,人和家畜食用後可引起中毒，甚至死亡。甘薯長_殼菌屬子囊菌亞門，核菌綱，球殼目，長_殼科，長_殼屬。侵染甘薯主要從傷口侵入，也可從薯塊上芽眼、皮孔、根眼侵入。
[0003]甘薯黑斑病在甘薯苗期、大田期和貯存期均可發生。常規檢測和診斷甘薯黑斑病的方法是根據病害的症狀和病菌形態的觀察。但這些方法不能用於病害的早期診斷，而且病菌的形態觀察需要進行病原菌的分離培養，費時費力，不能用於病害的快速檢測。因此，建立一種簡便、快速、靈敏的甘薯黑斑病菌的檢測方法，對於該病的早期診斷、預警和防治具有重要意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在於提供一種簡便、快速、靈敏的甘薯黑斑病菌的檢測方法。
[0005]為實現上述目的，本發明通過以下技術方案實現:
一種甘薯黑斑病菌的檢測方法，包括以下步驟:
(1)設計合成一對甘薯黑斑病菌特`異性引物，引物序列是:
SPCPF:5』 CATGATTGCCAGCGCCAT 3』，
SPCPR:5』 GACACGGCCAGCTTC 3』 ；
(2)提取待檢測樣品的總DNA;
(3)將SPCPF和SPCPR引物置於PCR反應體系中，以步驟(2)總DNA作為PCR模板，進行PCR擴增；
(4)用瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(3)擴增產物。
[0006]步驟(2 )的提取方法為CTAB方法或總DNA提取試劑盒方法；
所述的CTAB方法具體步驟為:
①稱取待檢測的植物組織或病殘體0.1g,置入滅菌後的研缽，加入液氮，充分研磨成粉
末；
②向步驟①粉末中加入600μ L CTAB緩衝液，60-65°C水浴60 min ；
③向步驟②水浴處理溶液中加等體積的氯仿/異戊醇混合溶液(氯仿與異戊醇的體積比24:1),溫和搖動,接著室溫下8000 r/min離心10 min,吸取上清液,重複步驟(3)—次，合併兩次上清液；④將步驟③上清液轉移至另一離心管，加入RNAaseA至終濃度100 μ g/mL,混勻後，37°C 孵育 30 min ；
⑤逐滴向步驟④處理後的上清液加入2倍體積的預冷的無水乙醇，-20°C條件下放置l-3h，4°C條件下，以2000r/min低速離心lOmin，收集核酸沉澱；
⑥向步驟⑤沉澱中加1-2mL 70%乙醇衝洗液,輕搖幾分鐘,接著在4°C條件下，以8000r/min離心IOmin,收集沉澱，晾乾；
⑦向步驟⑥晾乾沉澱中加50μ L TE緩衝液，4°C溶解沉澱，得到總DNA溶液，_20°C保存備用。
[0007]所述的總DNA提取試劑盒方法參照試劑盒說明書進行操作。
[0008]所述的PCR擴增的反應體系25 μ L，組成為:2.5μ L IOXPCR buffer，0.5 μ L濃度為 2.5mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 μ mol/L 的 SPCPF 和 SPCPR 各 0.5 μ L，0.2 μ L 濃度為 5U/μ L的Taq酶，2 μ L DNA模板，餘量為ddH20。
[0009]所述PCR擴增反應程序為:94 V預變性2min，94 V變性30s，58 V退火30s，72 °C延伸40s，完成35個循環，最後72°C延伸IOmin0
[0010]所述的步驟(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(3)擴增產物的步驟為:取步驟(3)中3-8 uL PCR擴增產物，用 質量濃度1.0%瓊脂糖電泳分離PCR擴增產物，經溴化乙錠染色後於紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定檢測結果，如果能特異性擴增出392bp的產物，則可判定存在甘薯黑斑病菌。
[0011 ] 本發明的積極有益效果:
1.本發明的甘薯黑斑病菌檢測方法，不僅能對病菌菌絲體進行檢測，也能對感病的薯苗和薯塊進行檢測。
[0012]2.本發明的檢測方法能實現對甘薯黑斑病的早期檢測，即在病害顯症前進行檢測，可對病害的發生進行早期預警，防治病害的擴散蔓延。
[0013]3.本發明的檢測方法能有效區分甘薯上的相似病害，例如黑痣病、軟腐病、幹腐病，可防治對病害的誤診。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明的甘薯黑斑病菌檢測方法的特異性擴增電泳圖；
圖2為本發明的甘薯黑斑病菌檢測方法對不同樣品的擴增電泳圖；
圖3為本發明的甘薯黑斑病菌檢測方法對田間病苗的檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結合一些具體實施例對本發明進一步描述。
[0016]實施例1甘薯黑斑病菌檢測方法的特異性擴增實驗
1.材料和方法
(I)引物來源:根據GenBank登陸的甘薯長_殼菌(Cferaiocj1Sii1S ZiMriaia)基因序列(GenBank登錄號:ER)17220.1~EF017226.1)設計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴增的目的片段大小為392bp。
[0017](2)病菌材料:甘薯黑斑病菌、甘薯軟腐病菌、甘薯幹腐病菌(2012年5月，採自河南省農業科學院植物保護研究所，採集人張德勝)，甘薯黑痣病菌(2011年10月，取自河北省農林科學院植物保護研究所，提供者陳書龍)。
[0018](3)核酸提取:利用寶生物工程(大連)有限公司的總DNA提取試劑盒，參照試劑盒說明書進行操作，提取待檢測樣品的總DNA。
[0019](4) PCR擴增的反應體系 25μ L，組成為:2.5μ L 10XPCR buffer，。.5 μ L 濃度為
2.5mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 μ mol/L 的 SPCPF 和 SPCPR 各 0.5 μ L，0.2 μ L 濃度為 5U/μ L的Taq酶，2 μ L DNA模板，餘量為ddH20 ；PCR擴增反應程序為:94°C預變性2min，94°C變性30s，58。。退火30s，72。。延伸40s，完成35個循環，最後72°C延伸IOmin0
[0020](5)取3-8 uL PCR擴增產物，用質量濃度1.0%瓊脂糖電泳分離PCR擴增產物，經溴化乙錠染色後於紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定檢測結果，如果能特異性擴增出392bp的產物，則可判定存在甘薯黑斑病菌。
[0021]2.結果與分析 參見圖1，圖中各標號為:1:DL2000 marker ;2_5道依次為:軟腐病菌、幹腐病菌、黑痣病菌、黑斑病菌的菌絲風乾物，6道為清水對照；
由圖1可知:軟腐病、幹腐病、黑痣病的病原菌不能擴增出相應片段，清水對照同樣沒有目標條帶出現，只有甘薯黑斑病的病原菌可被特異性擴增，擴增產物大致在392bp的位置，表明本發明甘薯黑斑病菌的檢測方法可以對甘薯黑斑病菌進行特異性擴增。
[0022]實施例2甘薯黑斑病菌檢測方法對不同樣品的擴增實驗
1.材料和方法
(I)引物來源:根據GenBank登陸的甘薯長_殼菌iCeratocystis fimbriata')基因序列(GenBank登錄號:ER)17220.1~EF017226.1)設計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴增的目的片段大小為392bp。
[0023](2)病樣材料:甘薯黑斑病菌風乾菌絲、各種感染黑斑病的薯苗莖段(2012年5月，採自河南省農業科學院植物保護研究所，採集人張德勝)。
[0024](3)核酸提取:利用寶生物工程(大連)有限公司的總DNA提取試劑盒，參照試劑盒說明書進行操作，提取待測樣品的總DNA。
[0025](4) PCR擴增的反應體系 25μ L，組成為:2.5μ L 10XPCR buffer，0.5 μ L 濃度為
2.5mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 μ mol/L 的 SPCPF 和 SPCPR 各 0.5 μ L，0.2 μ L 濃度為 5U/μ L的Taq酶，2 μ L DNA模板，餘量為ddH20 ；PCR擴增反應程序為:94°C預變性2min，94°C變性30s，58。。退火30s，72。。延伸40s，完成35個循環，最後72°C延伸IOmin0
[0026](5)取3-8 uL PCR擴增產物，用質量濃度1.0%瓊脂糖電泳分離PCR擴增產物，經溴化乙錠染色後於紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定檢測結果，如果能特異性擴增出392bp的產物，則可判定存在甘薯黑斑病菌。
[0027]2.結果與分析
參見圖2，圖中各標號為:1:DL2000 marker ;2道為病苗的白色未顯證莖段；3道為薯苗的綠色未顯症莖段；4道為黑斑病風乾菌絲；5道為病苗的白色顯症莖段；6道為清水對
昭.從圖2可以看出，第2、4、5泳道可擴增出目的片段。4道為黑斑病的風乾菌絲，擴增的條帶最亮；2道為病苗的白色未顯證莖段，擴增的條帶相對較弱，說明在接近病薯的白色未顯症莖段上已被病菌侵染，但病菌含量相對較少；5道為病苗的白色顯症莖段，也擴增出較弱的條帶；3道為薯苗的綠色未顯症莖段，沒有擴增出相應的條帶，說明薯苗的綠色部位未被病菌侵染。
[0028]實施例3甘薯黑斑病菌檢測方法對田間病苗的檢測結果
1.材料和方法
(I)引物來源:根據GenBank登陸的甘薯長_殼菌iCeratocystis fimbriata')基因序列(GenBank登錄號:ER)17220.1~EF017226.1)設計引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴增的目的片段大小為392bp。
[0029](2)病樣材料:薯苗和薯塊(2012年5月，採自河南省洛陽市農業科學研究院育苗圃，採集人張德勝)，樣品表現典型的黑斑病症狀。
[0030](3)核酸提取:利用寶生物工程(大連)有限公司的總DNA提取試劑盒，參照試劑盒說明書進行操作，提取樣品的總DNA。
[0031](4) PCR擴增的反應體系 25μ L，組成為:2.5μ L 10XPCR buffer，0.5 μ L 濃度為
2.5mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 μ mol/L 的 SPCPF 和 SPCPR 各 0.5 μ L，0.2 μ L 濃度為 5U/μ L的Taq酶，2 μ L DNA模板，餘量為ddH20 ；PCR擴增反應程序為:94°C預變性2min，94°C變性30s，58。。退火30s，72。。延伸40s，完成35個循環，最後72°C延伸IOmin0[0032](5)取3-8 uL PCR擴增產物，用質量濃度1.0%瓊脂糖電泳分離PCR擴增產物，經溴化乙錠染色後於紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定檢測結果，如果能特異性擴增出392bp的產物，則可判定存在甘薯黑斑病菌。
[0033]2.結果與分析
參見圖3，圖中各標號為:1:DL2000 marker ;2~6:田間採集的病苗樣品；7_田間採集的感染甘薯黑斑病菌的薯塊；
從圖3可以看出，2-7道均有明亮的條帶出現，說明河南省洛陽市農業科學研究院育苗圃採集的具有黑斑病症狀的薯苗和薯塊均可擴增出目的片段，採集薯苗和薯塊的育苗圃黑斑病發病非常嚴重，此育苗圃生產的秧苗如果不做高剪苗等無害化處理，將會造成黑斑病蔓延至其他田塊。
【權利要求】
1.一種甘薯黑斑病菌的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)設計合成一對甘薯黑斑病菌特異性引物，引物序列是:
SPCPF:5』 CATGATTGCCAGCGCCAT 3』， SPCPR:5』 GACACGGCCAGCTTC 3』 ； (2)提取待測樣品的總DNA; (3)將SPCPF和SPCPR引物置於PCR反應體系中，以步驟(2)總DNA作為PCR模板，進行PCR擴增； (4)用瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(3)擴增產物。
2.根據權利要求1所述的甘薯黑斑病菌的檢測方法，其特徵在於，步驟(2)的提取總DNA方法為CTAB方法或總DNA提取試劑盒方法。
3.根據權利要求1所述的甘薯黑斑病菌的檢測方法，其特徵在於，PCR擴增的反應體系 25μ L，組成為:2.5μ L IOXPCR buffer，0.5 μ L 濃度為 2.5mmol/L 的 dNTPs，濃度為10μ mol/L 的 SPCPF 和 SPCPR 各 0.5 μ L，0.2 μ L 濃度為 5U/ μ L 的 Taq 酶，2 μ L DNA 模板，餘量為ddH20。
4.根據權利要求1所述的甘薯黑斑病菌的檢測方法，其特徵在於，所述PCR擴增反應程序為:94°C預變性2min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸40s，完成35個循環，最後72°C延伸 lOmin。
5.根據權利要求1所述的甘薯黑斑病菌的檢測方法，其特徵在於，步驟(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟(3)擴增產物的步驟為:取3-8uL PCR擴增產物，用質量濃度1.0%瓊脂糖電泳分離PCR擴增產物，經溴化乙錠染色後於紫外燈下觀察，根據擴增產物的大小判定檢測結果，如果能特異性擴增出392bp的產物，則可判定存在甘薯黑斑病菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667494SQ201310693596
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】張德勝, 張振臣, 王爽, 秦豔紅, 喬奇, 田雨婷, 王永江 申請人:河南省農業科學院植物保護研究所