一種具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法
2023-08-02 09:48:06 1
專利名稱：一種具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種四氧化三鐵納米粒子的製備方法，尤其是一種具有肝靶向功能的
四氧化三鐵納米粒子的的製備方法，屬於生物醫學工程領域。
背景技術：
20世紀80年代中期，基於肝臟的諸多功能和特殊組成成份，研究人員開始尋找能 在肝組織內滯留時間更長、以肝臟組織細胞為特殊靶器官、同時又不被肝臟生物攝取的肝 髒特異性對比劑。國內武漢大學、蘭州大學、南方醫科大學、華東師範大學、華中科技大學等 單位在這方面做了很多不錯的工作，主要集中在Gd水溶性聚合物的合成和超順磁性氧化 鐵(SPIO， superparamagnetic iron oxide)被動耙向納米粒子表面包覆層的製備。
SPIO對比劑具有很好的肝臟造影效果，商品名叫做菲立磁。SPIO對比劑通過肝臟 吞噬細胞的吞噬作用來實現對肝臟特異性診斷，實現很好的被動靶向作用。SPIO注射劑量 的80X以上可以分布於肝，檢出特異度可高達99X。SPI0不僅有助於提高肝臟微小瘤灶的 MRI檢出水平，也有助於對良性、惡性腫瘤作出定性判斷，還提高了肝炎、肝硬化等彌散性肝 病的檢出敏感性。大量動物實驗和臨床研究表明，SPIO能成功地檢出以往未能檢出的微小 病灶，進一步提高了惡性病灶的檢出率。SPIO粒子可有效地縮短組織的L值，使組織信號 降低，提供較長的掃描時間窗(l-4h)，而且SPI0粒子在被吞噬細胞吞噬後，運送到溶酶體 分解，成為機體內的儲備鐵，釋放的鐵可與血紅蛋白結合。雖然SPIO具有很高的肝臟顯影 效果，但由於其價格昂貴，在快速注射時有很明顯的副反應，臨床試驗報導的副作用發生率 達6. 1%_15%，現在國內使用SPIO的已經很少。SPIO副作用的產生原因尚不清楚，有學者 指出可能與巨噬細胞的調理素有關，需進一步研究。目前關於SPIO的研究仍主要集中在聚 合物包覆方面，通過改變粒子的粒徑和表面電荷來降低其毒副作用，其作用機理仍是被動 靶向作用。有研究者以單克隆抗體或RGD肽為靶向基團，修飾超順磁性氧化鐵進行肝臟疾 病的診斷，研究結果表明，通過抗體或肽類化合物的主動靶向作用，可以明顯降低其毒副作 用。但抗體和肽類化合物修飾效率較低，成本昂貴，難以大規模應用。而且目前的抗體主要 是鼠源性抗體，安全性成為其首要問題。文獻中關於採用小分子化合物受體介導的SPIO肝 靶向的研究報導不多。值得一提的是以上文獻中報導的方法所製備的納米粒子都缺乏對於 病灶部位的特異性，進而限制了他們在動物體內的應用。 隨著人們對肝臟早期病變診斷要求的提高和對現在使用的MRI對比劑毒副作用 的深入了解，MRI對比劑在動物體內的分布規律和肝特異性識別研究顯得尤為重要和迫切， 提高MRI敏感性和特異靶向性是核磁共振對比劑研發中面臨的重大挑戰。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服已有技術的不足，目的在於提供一種具有肝靶
向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法。 本發明通過以下技術方案實現上述目的
—種具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法，是將採用的技術路線是 利用肝靶向化合物和葡聚糖反應製備肝靶向化合物修飾的葡聚糖，並與鐵鹽和亞鐵鹽水溶 液反應製備具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法。 所述肝靶向化合物為單甘草次酸乙二胺、單甘草次酸丙二胺、單甘草次酸丁二胺、
單甘草次酸己二胺、單膽酸乙二胺、單膽酸丙二胺、單膽酸丁二胺和單膽酸己二胺中的任意 一種； 所述葡聚糖的分子量為2000 4X 104 ; 所述鐵鹽為氯化鐵和醋酸鐵中的任意一種； 所述亞鐵鹽為氯化亞鐵和醋酸亞鐵中的任意一種； 所述亞鐵鹽和鐵鹽的配料比為1 : 2 3，mol/mo1。 具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法包括下述步驟 1.在2 10X的葡聚糖的水溶液中，加入高碘酸鈉水溶液，攪拌下反應4 6h，冷
卻後，將反應液在蒸餾水中透析2 12h，得到氧化的葡聚糖溶液；將肝靶向化合物的水溶
液滴加到氧化的葡聚糖溶液中，在25 6(TC反應4 6小時，冷卻後，加入硼氫化鈉的水溶
液，繼續攪拌反應2 4h，將反應液在蒸餾水中透析2 12h後，加入乙醚沉澱，真空乾燥，
得到肝靶向化合物修飾的葡聚糖。 所述肝靶向化合物修飾的葡聚糖的合成步驟中的物料配比為葡聚糖高碘酸
鈉硼氫化鈉為ioo. o : 3. o 20. o : o. 50 3.60， g/g ;肝靶向化合物硼氫化鈉為
1 : 1 3， mol/mo1 。 2.將鐵鹽和亞鐵鹽的水溶液混合均勻，加入肝靶向化合物修飾的葡聚糖的水溶 液，通入N2攪拌並加入氨水和去離子水，在50 80°C反應1 4h，加入醋酸調節pH值至 7，將反應液透析，超聲振蕩，用磁鐵分離得到四氧化三鐵納米粒子；把得到的四氧化三鐵納 米粒子分散到去離子水中，超聲振蕩5 20min，過450nm微濾膜，得到具有肝靶向功能的四 氧化三鐵納米粒子。 所述肝靶向化合物修飾的葡聚糖與鐵鹽和亞鐵鹽水溶液反應製備具有肝靶向功 能的四氧化三鐵納米粒子的過程中的物料配比為肝靶向化合物修飾的葡聚糖鐵鹽為 100. 0 : 5. 0 27. 0， g/g。 本發明的效果可以顯著提高四氧化三鐵納米粒子在肝臟內的累積。
具體實施例方式
為了進一步了解本發明的內容、特點，詳細說明如下
實施例1單甘草次酸乙二胺修飾的葡聚糖的合成 在1000ml 5%的葡聚糖的水溶液中，加入含有10. 02g高碘酸鈉的水溶液，攪拌下 反應5h，冷卻後，將反應液在蒸餾水中透析4h，得到氧化的葡聚糖溶液；將含有5. 24g單甘 草次酸乙二胺的水溶液滴加到氧化的葡聚糖溶液中，在5(TC反應5小時，冷卻後，加入含有 0. 81g硼氫化鈉的水溶液，繼續攪拌反應3h，將反應液在蒸餾水中透析4h後，加入200ml乙 醚沉澱，真空乾燥，得到52. 71g單甘草次酸乙二胺修飾的葡聚糖。
實施例2單膽酸己二胺修飾的葡聚糖的合成 在1000ml 5%的葡聚糖的水溶液中，加入含有10. 02g高碘酸鈉的水溶液，攪拌下反應5h，冷卻後，將反應液在蒸餾水中透析4h，得到氧化的葡聚糖溶液；將含有7. 12g單膽 酸酸己二胺的水溶液滴加到氧化的葡聚糖溶液中，在5(TC反應5小時，冷卻後，加入含有 0. 81g硼氫化鈉的水溶液，繼續攪拌反應3h，將反應液在蒸餾水中透析4h後，加入200ml乙 醚沉澱，真空乾燥，得到55. 48g單膽酸己二胺修飾的葡聚糖。 實施例3 單甘草次酸乙二胺修飾的葡聚糖與FeCl3和FeCl2水溶液反應製備具 有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子 將含有1. 10g FeCl3和0. 35g FeCl2的水溶液混合均勻，加入含有5. 02g單甘草 次酸乙二胺修飾的葡聚糖的水溶液，通入N2攪拌並加入30ml 3M氨水和100ml去離子水， 在50 8(TC反應1 4h，加入醋酸調節pH值至7，將反應液透析，超聲振蕩，用磁鐵分離得 到四氧化三鐵納米粒子；把得到的四氧化三鐵納米粒子分散到去離子水中，超聲振蕩5 20min，過450nm微濾膜，得到修飾單甘草次酸乙二胺的四氧化三鐵納米粒子。動態光散射 測定其粒徑為37nm，分散指數為0. 17，透射電鏡觀測粒子為規則的圓球形。
實施例4 單膽酸己二胺修飾的葡聚糖與FeCl3和FeCl2水溶液反應製備具有肝 靶向功能的四氧化三鐵納米粒子 將含有1. 10g FeCljP 0. 35g FeCl2的水溶液混合均勻，加入含有5. 88g單膽酸己 二胺修飾的葡聚糖的水溶液，通入N2攪拌並加入30ml 3M氨水和100ml去離子水，在50 8(TC反應2h，加入醋酸調節pH值至7，將反應液透析，超聲振蕩，用磁鐵分離得到四氧化三 鐵納米粒子；把得到的四氧化三鐵納米粒子分散到去離子水中，超聲振蕩10min，過450nm 微濾膜，得到修飾單膽酸己二胺的四氧化三鐵納米粒子。動態光散射測定其粒徑為29nm，分 散指數為0. 14，透射電鏡觀測粒子為規則的圓球形。 實施例5修飾單膽酸己二胺的的四氧化三鐵納米粒子的大鼠體內分布實驗
利用放射性元素標記結合SPECT技術檢測納米粒子在動物體內的分布是一種快 速準確定量的分析檢測方法。我們採用這種方法研究了修飾單膽酸己二胺的的四氧化三鐵 納米粒子在大鼠體內的分布。 1.修飾單膽酸己二胺的的四氧化三鐵納米粒子(DS-SPIO)的製備
修飾單膽酸己二胺的的四氧化三鐵納米粒子製備同實施例4 ;
2.葡聚糖包覆的四氧化三鐵納米粒子(U-SPIO)的製備 將含有1. 10g FeC^和0. 35g FeCl2的水溶液混合均勻，加入含有5. 24g葡聚糖的
水溶液，通入N2攪拌並加入30ml 3M氨水和100ml去離子水，在50 8(TC反應2h，加入醋
酸調節PH值至7，將反應液透析，超聲振蕩，用磁鐵分離得到四氧化三鐵納米粒子；把得到
的四氧化三鐵納米粒子分散到去離子水中，超聲振蕩10min，過450nm微濾膜，得到葡聚糖
包覆的四氧化三鐵納米粒子。 3.納米粒子的cDTPA偶聯 分別取4mL0. lg/L DS-SPIO和U-SPIO納米粒子溶液與80mg 二乙烯三胺五乙酸二 環酐(cDTPA)混合，在室溫下反應lh完成偶聯。混合液用S印hadex G75常規凝膠色譜分離， 去除游離的二乙烯三胺五乙酸(DTPA)，淋洗液為蒸餾水，分別得到cDTPA衍生化的DS-SPIO 和U-SPIO納米粒子納米粒子溶液。
4.納米粒子的放射性標記 分別取cDTPA衍生化的DS-SPIO和U-SPIO的納米粒子溶液(lmg/mL) lmL，亞甲基
5二磷酸錫鹽(MDP-Sn)試劑盒加入lmL生理鹽水，每個樣品取100 y L，分別加入lmCi99mTc和 50 ii L MDP溶液反應lOmin.標記好的溶液用生理鹽水稀釋到3mL供小鼠體內分布實驗使 用。 5.取步驟4的99mTc標記的納米粒子溶液，大鼠(n = 3)尾靜脈注射給藥500 y L， 以大鼠尾靜脈注射500 L生理鹽水為對照。給藥後，分別於0. 25、 l、3h後做SPECT顯像測 試。將大鼠處死，提取大鼠肝臟，定量稱取其他組織和血液，做放射性測試。
DS-SPIO納米粒子在注射15min，在肝臟積累達44X，在腎臟達25%。在注射lh 後，DS-SPI0納米粒子在肝臟富集達到82X。 U-SPIO納米粒子在注射15min，在肝臟積累達 28%，在腎臟達19%。在注射lh後，U-SPI0納米粒子在肝臟累計47X。
權利要求
一種具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法，其特徵在於使用肝靶向化合物和葡聚糖反應製備肝靶向化合物修飾的葡聚糖，並與鐵鹽和亞鐵鹽水溶液反應製備具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子；所述肝靶向化合物為單甘草次酸乙二胺、單甘草次酸丙二胺、單甘草次酸丁二胺、單甘草次酸己二胺、單膽酸乙二胺、單膽酸丙二胺、單膽酸丁二胺和單膽酸己二胺中的任意一種；所述鐵鹽為氯化鐵和醋酸鐵中的任意一種；所述亞鐵鹽為氯化亞鐵和醋酸亞鐵中的任意一種。
2. 按照權利要求1所述的具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法，其特徵 在於所述葡聚糖的分子量為2000 4X 104。
3. 按照權利要求1所述的具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法，其特徵 在於所述亞鐵鹽和鐵鹽的配料比為1 : 2 3，mol/mo1。
4. 按照權利要求1所述的具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法，其特 徵在於使用肝靶向化合物和葡聚糖反應製備肝靶向化合物修飾的葡聚糖，包括下述製備步 驟在2 10 %的葡聚糖的水溶液中，加入高碘酸鈉水溶液，攪拌下反應4 6h，冷卻後， 將反應液在蒸餾水中透析2 12h，得到氧化的葡聚糖溶液；將肝靶向化合物的水溶液滴加 到氧化的葡聚糖溶液中，在25 6(TC反應4 6小時，冷卻後，加入硼氫化鈉的水溶液，繼 續攪拌反應2 4h，將反應液在蒸餾水中透析2 12h後，加入乙醚沉澱，真空乾燥，得到肝 靶向化合物修飾的葡聚糖。
5. 按照權利要求4所述具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法，其特徵在 於所述肝靶向化合物修飾的葡聚糖的合成步驟中的物料配比為葡聚糖高碘酸鈉硼氫化鈉為ioo. o : 3. o 20. o : o. 50 3.60， g/g ;肝靶向化合物硼氫化鈉為1 : 1 3， mol/mo1。
6. 按照權利要求1所述的具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法，其特徵在於肝靶向化合物修飾的葡聚糖與鐵鹽和亞鐵鹽水溶液反應製備具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子，包括下述製備步驟將鐵鹽和亞鐵鹽的水溶液混合均勻，加入肝靶向化合物修飾的葡聚糖的水溶液，通入N2攪拌並加入氨水和去離子水，在50 8(TC反應1 4h， 加入醋酸調節pH值至7，將反應液透析，超聲振蕩，用磁鐵分離得到四氧化三鐵納米粒子； 把得到的四氧化三鐵納米粒子分散到去離子水中，超聲振蕩5 20min，過450nm微濾膜，得 到具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子。
7. 按照權利要求6所述具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法，其特徵在 於所述肝靶向化合物修飾的葡聚糖與鐵鹽和亞鐵鹽水溶液反應製備具有肝靶向功能的四 氧化三鐵納米粒子的過程中的物料配比為肝靶向化合物修飾的葡聚糖鐵鹽為ioo. o : 5. o 27. o， g/g。
全文摘要
一種具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子的製備方法，本發明屬於生物醫學領域，使用肝靶向化合物和葡聚糖反應製備肝靶向化合物修飾的葡聚糖，並與鐵鹽和亞鐵鹽水溶液反應製備具有肝靶向功能的四氧化三鐵納米粒子。這種四氧化三鐵納米粒子用於MRI核磁共振造影，可以顯著提高四氧化三鐵納米粒子在肝臟內的累積。
文檔編號A61K49/06GK101766826SQ20101011659
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月3日 優先權日2010年3月3日
發明者查瑞濤, 王立軍, 馬靜 申請人:天津科技大學