豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒雙重螢光定量RT‑PCR檢測方法與流程

2023-08-05 13:55:01 1

本發明涉及豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒雙重螢光定量RT-PCR檢測方法，屬於螢光定量RT-PCR
技術領域：
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背景技術：
：豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，簡稱CSFV）和牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus，簡稱BVDV)同屬於黃病毒科、瘟病毒屬，長久以來，它們所引起的傳染病給養牛、養豬和養羊業造成了巨大的經濟損失。BVDV在世界範圍內廣泛分布,山羊、綿羊、豬,鹿及小袋鼠等動物都是BVDV的宿主和傳染源。BVDV與CSFV的核苷酸序列約有60%的同源性，胺基酸約有85%的同源性，多克隆抗體對兩種病毒具有血清學交叉反應。首先，CSFV與BVDV在自然條件下感染豬，其臨床症狀和病理變化相似；其次，在獸用疫苗生產中,常使用牛血清、牛睪丸細胞、胰酶等牛源材料作為原材料，一旦這些原料被汙染了BVDV,則必將導致疫苗產品的汙染，尤其是豬用疫苗被汙染BVDV後，會導致免疫豬感染，造成自身類似豬瘟的臨床症狀，給豬瘟的診斷帶來困難外,還會成為汙染源。CN101058830A公開了「豬瘟病毒螢光定量一診斷試劑盒」，CN101328506A公開了「一種特異檢測豬瘟病毒野毒感染的螢光定量快速診斷試劑盒及其應用方法」；兩篇文獻均只對CSFV進行了單獨檢測。OIE公布了檢測BVDV的引物探針序列，標註不能區分豬瘟病毒；CN103397107A公開了「牛病毒性腹瀉病毒螢光定量一檢測試劑盒」，但只對BVDV進行單獨檢測。臨床檢測結果表明，現有的CSFV或BVDV螢光定量RT-PCR試劑盒無法區分CSFV與BVDV。目前，針對CSFV和BVDV感染的聯合檢測方法還未完善,而對豬源BVDV的檢測也仍然在探索階段；還沒有能夠同時對豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒進行同時檢測的相關試劑。技術實現要素：基於CSFV與BVDV基因序列相似，普通RT-PCR難以區分兩者的事實；本發明的目的在於提供一種具可區分豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的雙重螢光定量RT-PCR的檢測方法。技術方案一組螢光定量RT-PCR檢測用引物和探針，由第一組引物和探針或/和第二組引物和探針組成；所述第一組引物和探針為：CSFV-F：ATACATAAAGCCCGGCCCTG，如SEQIDNO.1所示；CSFV-R：CTTGCCATCACTACCCGTGA，如SEQIDNO.2所示；CSFV探針P：FAM-CCAGGACTACATGGGCCCAGTCTATCAC-BHQ1，如SEQIDNO.3所示；所述第二組引物和探針為：BVDV-F：AGCAACAGTGGTGAGTTCGT，如SEQIDNO.4所示；BVDV-R：CGTGGCATCTCGAGACCTTT，如SEQIDNO.5所示；BVDV探針P：HEX\VIC-ATGGCTTAAGCCCTGAGTACA-BHQ1，如SEQIDNO.6所示。本發明的上述引物和探針：其中第一組引物和探針用於擴增豬瘟病毒特異序列，第二組引物和探針用於擴增牛病毒性腹瀉病毒特異序列。第一組引物和探針的擴增產物的序列唯一與豬瘟病毒基因序列保守區（533bp-671bp）一致；第二組引物和探針的擴增產物的序列唯一與BVDV基因序列保守區（142bp-237bp）一致。採用本發明的上述引物進行螢光定量RT-PCR檢測，能夠將CSFV與BVDV區分開來，解決了現有CSFV或BVDV螢光定量RT-PCR試劑盒無法區分CSFV與BVDV的技術問題。一種豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒雙重螢光定量RT-PCR檢測試劑，含有上述引物和探針。上述檢測試劑，其組成為：DEPCH2O：2.75ul5×Buffer：2.5ul10×Buffer：1.25ul2.5mMdNTP：2ulCSFV-F:0.5ulCSFV-R:1ulCSFV探針P：0.5ulBVDV-F:0.5ulBVDV-R:1ulBVDV探針P：0.5ul20uMMgCl2：1.5ul酶混合物：1ul；所述CSFV-F、CSFV-R、CSFV探針P、BVDV-F、BVDV-R、BVDV探針P的濃度均為10μmol/L。上述檢測試劑，為檢測一份樣品的用量。一種豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒雙重螢光定量RT-PCR檢測方法；將待測樣品的核酸10ul與15ul上述檢測試劑配成25ul的反應體系，然後進行螢光定量RT-PCR反應，讀取結果；所述螢光定量RT-PCR反應：第一階段：反轉錄42℃/30min；第二階段：預變性94℃/3min；第三階段：92℃/15sec，45℃/30sec，72℃/60sec，共5個循環；第四階段：92℃/10sec，56℃/60sec，共40個循環；最後40℃/10sec；在第四階段每次循環的退火56℃延伸時收集螢光；所述讀取結果：如果FAM檢測通道出現「S」形擴增曲線，且Ct值小於或等於30，則樣品中含有CSFV；如果HEX\VIC檢測通道出現「S」形擴增曲線，且Ct值小於或等於30，則樣品中含有BVDV。上述檢測方法，用於擴增豬瘟病毒特異序列的引物和探針為：引物CSFV-F、CSFV-R和CSFV探針P；用於擴增牛病毒性腹瀉病毒特異序列的的引物和探針為：BVDV-F、引物BVDV-R和BVDV探針P。對上述檢測方法獲得的擴增產物進行測序，CSFV探針P僅出現在與豬瘟病毒基因序列保守區（533bp-671bp）一致的擴增產物中，BVDV探針P僅出現在與牛病毒性腹瀉病毒病毒基因序列保守區（142bp-237bp）一致的擴增產物中。說明，每組引物和探針能排除另外一組引物和探針的幹擾；因此，本發明的檢測方法能夠同時檢測豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒。有益效果採用本發明的上述引物進行螢光定量RT-PCR檢測，能夠將CSFV與BVDV區分開來。本發明的檢測方法能夠同時檢測豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒。在本發明的檢測方法中，豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重螢光定量RT-PCR檢測方法採用病毒RNA柱式提取試劑盒，提取時間短，整個檢測過程不到3個小時，採取閉管反應，檢測完畢直接處理，避免開蓋造成氣溶膠汙染。過程簡單、檢測時間短、靈敏度高。附圖說明圖1-2為特異性實驗的擴增結果圖；圖1中的「S」型曲線為CSFV的擴增曲線，圖2中的「S」型曲線為BVDV的擴增曲線，圖1、2中的直線均為豬藍耳病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和陰性對照的陰性檢測結果；圖3-4為重複性實驗的擴增結果圖；圖3中的「S」型曲線為豬瘟病毒不同毒株的擴增曲線，圖4中的「S」型曲線為牛病毒性腹瀉病毒不同毒株的擴增曲線，圖3、4中的直線均為陰性對照的檢測結果；圖5-6為靈敏度實驗的擴增結果圖；圖5中的「S」型曲線為不同濃度的豬瘟病毒的擴增曲線，其中，從上到下的四條曲線依次對應稀釋10-1、10-2、10-3、10-4倍後的CSFV的擴增曲線，稀釋10-5、10-6倍後的CSFV的擴增曲線呈直線，陰性對照的檢測結果為直線；圖6中的「S」型曲線為不同濃度的BVDV的擴增曲線，其中，從上到下的5條曲線依次對應稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍後的BVDV的擴增曲線，稀釋10-6倍後的CSFV的擴增曲線呈直線，陰性對照的檢測結果為直線；由此可見，稀釋10-5、10-6倍後的CSFV的檢測結果呈陰性，稀釋10-6倍後的CSFV的檢測結果呈陰性。具體實施方式本具體實施方式中，所涉及的豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus），記載於2015年1月至2016年7月從發病的豬中分離鑑定得到的；現保存在山東省動物疫病預防與控制中心。所涉及的牛病毒性腹瀉病毒(Bovineviraldiarrheavirus)，記載於2013年1月至2014年7月從發病的豬中分離鑑定得到的；現保存在山東省動物疫病預防與控制中心。所涉及的豬藍耳病病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus），記載於2015年1月至2016年7月從發病的豬中分離鑑定得到的；現保存在山東省動物疫病預防與控制中心。所涉及的豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus）記載於2015年1月至2016年7月從發病的豬中分離鑑定得到的；現保存在山東省動物疫病預防與控制中心。所涉及的豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus）記載於2015年1月至2016年7月從發病的豬中分離鑑定得到的；現保存在山東省動物疫病預防與控制中心。設計引物和探針用於擴增豬瘟病毒特異序列的引物和探針：上遊引物CSFV-F：ATACATAAAGCCCGGCCCTG，如SEQIDNO.1所示；下遊引物CSFV-R：CTTGCCATCACTACCCGTGA，如SEQIDNO.2所示；CSFV探針P：FAM-CCAGGACTACATGGGCCCAGTCTATCAC-BHQ1，如SEQIDNO.3所示；用於擴增牛病毒性腹瀉病毒特異序列的的引物和探針：上遊引物BVDV-F：AGCAACAGTGGTGAGTTCGT，如SEQIDNO.4所示；下遊引物BVDV-R：CGTGGCATCTCGAGACCTTT，如SEQIDNO.5所示；BVDV探針P：HEX\VIC-ATGGCTTAAGCCCTGAGTACA-BHQ1，如SEQIDNO.6所示。特異性試驗1.2.1選取CSFV和BVDV原毒液，各取200ul於1.5ml離心管中。採用北京森康生物技術開發有限公司的病毒RNA柱式提取試劑盒，參照說明書分別提取病毒液的核酸。同時將實驗室保存的豬藍耳病病毒3株，豬流行性腹瀉病毒3株，豬傳染性胃腸炎病毒3株，共9株病毒液。取這9株病毒液各200ul於1.5ml離心管中，採用北京森康生物技術開發有限公司的病毒RNA柱式提取的試劑盒，參照說明書提取9份病毒液的核酸。將上述3株豬藍耳病病毒、3株豬流行性腹瀉病毒、3株豬傳染性胃腸炎病毒的核酸及豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的核酸進行下述檢測：取配好的反應液15ul，分別加入10ul上述核酸，最終配成25ul的反應體系。反應液配方如表1所示：表1組成量（uL）10μmol/L的CSFV-F0.510μmol/L的CSFV-R110μmol/L的CSFV探針P0.510μmol/L的BVDV-F0.510μmol/L的BVDV-R110μmol/L的BVDV探針P0.5DEPCH2O2.7510×Buffer1.255×Buffer2.5MgCl2（20mmol/L）1.5dNTP（25mmol/L）2酶混合物1將反應體系上機進行螢光定量RT-PCR反應，然後讀取結果。螢光定量PCR的反應參數如下設置：第一階段：反轉錄42℃/30min；第二階段：預變性94℃/3min；第三階段：92℃/15sec，45℃/30sec，72℃/60sec，共5個循環；第四階段：92℃/10sec，56℃/60sec，共40個循環；最後40℃10sec；在第四階段每次循環的退火56℃延伸時收集螢光。結果讀取：對於多通道PCR儀，分別利用FAM（465-510）通道和HEX\VIC（533-580）通道讀取結果；若用ABI儀器，分別選擇FAM螢光素對應的通道和HEX螢光素對應的通道無螢光淬滅基團，讀取結果。本發明採用的是多通道PCR儀（包括ABI儀器）：在FAM（465-510）通道出現一條「S」型擴增曲線，如圖1所示；因為檢測CSFV的探針以FAM螢光素標記的,所以用FAM（465-510）通道接收的螢光信號為標記FAM螢光素探針的擴增產物的擴增曲線，為CSFV的擴增曲線。在HEX\VIC（533-580）通道出現一條「S」型擴增曲線，如圖2所示；因為檢BVDV的探針以HEX螢光素標記的,所以用HEX（533-580）通道接收的螢光信號為標記HEX螢光素探針的擴增產物的擴增曲線，為BVDV的擴增曲線。對反應體系中的擴增產物進行測序；其中，標記有CSFV探針P的擴增產物，其序列為：atacataaagcccggccctgtctactaccaggactacatgggcccagtctatcacagagctcctttagagttctttgatgaggcccagttctgcgaggtgactaagagaataggcagggtcacgggtagtgatggcaag，如SEQIDNO.7所示，該序列唯一與豬瘟病毒基因序列保守區（533bp-671bp）一致；標記有BVDV探針P的擴增產物，其序列為：agcaacagtggtgagttcgttggatggcttaagccctgagtacagggtagtcgtcagtggttcgacgccttggaataaaggtctcgagatgccacg，如SEQIDNO.8所示，該序列唯一與BVDV基因序列保守區（142bp-237bp）一致。說明，引物CSFV-F、CSFV-R和CSFV探針P能特異性擴增CSFV基因序列保守區，圖1的「S」型曲線為CSFV基因序列保守區擴增產物的量的變化曲線。引物BVDV-F、BVDV-R和BVDV探針P能特異性擴增BVDV基因序列保守區，圖2的「S」型曲線為BVDV基因序列保守區擴增產物的量的變化曲線。而引物CSFV-F、CSFV-R和CSFV探針P，引物BVDV-F、BVDV-R和BVDV探針P，均不會對豬藍耳病病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒進行擴增。豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重螢光定量RT-PCR不能檢測出混淆程度比較大的豬藍耳病病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒，具有很好的特異性。另外，CSFV探針P僅出現在與豬瘟病毒基因序列保守區（533bp-671bp）一致的擴增產物中，BVDV探針P僅出現在與牛病毒性腹瀉病毒病毒基因序列保守區（142bp-237bp）一致的擴增產物中，說明，每組引物和探針能排除另外一組引物和探針的幹擾。重複性試驗選取經鑑定的豬瘟病毒毒株10株，選取經鑑定的豬源牛病毒性腹瀉病毒毒株3株。取10株CSFV病毒液各200ul於10個不同的1.5ml離心管中；取3株BVDV（BVDV-1型2株、BVDV-2型1株）200ul於1.5ml離心管中；採用北京森康生物技術開發有限公司的病毒RNA柱式提取的試劑盒，參照說明書分別提取13份病毒液的核酸。將10株豬瘟病毒的核酸與3株牛病毒性腹瀉病毒的核酸混合後分成30份，最後形成30份兩種病毒液混合的核酸；把兩種病毒液的混合核酸當作螢光定量RT-PCR反應的模板。螢光定量RT-PCR反應採用15ul反應液，10ul模板，共25ul的體系；反應液配方如表1所示。取配好的反應液15ul，加入混合好的兩種病毒液的核酸10ul，最終配成25ul的反應體系，同時設定陰性對照（反應液15ul+DEPC水10ul），採用多通道PCR儀進行螢光定量RT-PCR反應，然後讀取結果。螢光定量RT-PCR的反應參數如下設置：第一階段：反轉錄42℃/30min；第二階段：預變性94℃/3min；第三階段：92℃/15sec，45℃/30sec，72℃/60sec，共5個循環，第四階段：92℃/10sec，56℃/60sec，共40個循環；最後40℃10sec；在第四階段每次循環的退火56℃延伸時收集螢光。結果讀取：利用FAM（465-510）通道讀取結果，如圖3所示；利用HEX\VIC（533-580）讀取結果，如圖4所示。由圖3可知,10株不同的豬瘟病毒都能檢測出陽性，結果在可控的範圍之內；可見，此雙重螢光定量RT-PCR對於豬瘟病毒的檢測比較穩定。由圖4可知：3份牛病毒性腹瀉病毒都能檢測出陽性，結果在可控的範圍之內，可見此雙重螢光定量RT-PCR對於牛病毒性腹瀉病毒的檢測比較穩定。靈敏度試驗選取經鑑定純化的豬瘟病毒和豬源牛病毒性腹瀉病毒毒株各1株，應用病毒RNA柱式提取試劑盒操作流程提取核酸，全波長酶標儀(SpectraMax®i3x)測定OD260，OD260/280計算核酸濃度為40.748ng/ul(CSFV)、39.803ng/ul（BVDV），做10-1，10-2，10-3，10-4,10-5，10-6十進位倍比稀釋。將稀釋濃度相同的病毒液的核酸各取10ul後充分混合，最後形成6份不同稀釋度的兩種病毒液混合的核酸，把不同稀釋度的兩種病毒液的混合核酸當作螢光定量RT-PCR反應的模板。螢光定量RT-PCR反應採用15ul反應液，10ul模板，共25ul的體系；反應液配方如表1所示。取配好的反應液15ul，加入混合好的三種細菌的核酸10ul，最終配成25ul的反應體系；同時設定陰性對照（反應液15ul+DEPC水10ul），採用多通道PCR儀進行螢光定量PCR反應，然後讀取結果。螢光定量PCR的反應參數如下設置：第一階段：反轉錄42℃/30min；第二階段：預變性94℃/3min；第三階段：92℃/15sec，45℃/30sec，72℃/60sec，共5個循環；第四階段：92℃/10sec，56℃/60sec，共40個循環；最後40℃10sec；在第四階段每次循環的退火56℃延伸時收集螢光。結果讀取：利用FAM（465-510）通道讀取結果，如圖5所示；圖5顯示，CSFV的檢測極限是40.748pg/ul。利用HEX\VIC（533-580）讀取結果，如圖6所示；圖6顯示，BVDV的檢測極限是3.9803pg/ul。與現有無法區分CSFV與BVDV的螢光定量RT-PCR檢測試劑相比，本發明的雙重螢光RT-PCR試劑盒的靈敏性並沒有降低。山東省動物疫病預防與控制中心豬瘟病毒、牛病毒性腹瀉病毒雙重螢光定量RT-PCR檢測方法8120DNA人工合成1ATACATAAAGCCCGGCCCTG20220DNA人工序列2CTTGCCATCACTACCCGTGA20328DNA人工序列3CCAGGACTACATGGGCCCAGTCTATCAC28420DNA人工序列4AGCAACAGTGGTGAGTTCGT20520DNA人工序列5CGTGGCATCTCGAGACCTTT20621DNA人工序列6ATGGCTTAAGCCCTGAGTACA217139DNA人工序列7atacataaagcccggccctgtctactaccaggactacatgggcccagtctatcacagagc60tcctttagagttctttgatgaggcccagttctgcgaggtgactaagagaataggcagggt120cacgggtagtgatggcaag139896DNA人工序列8agcaacagtggtgagttcgttggatggcttaagccctgagtacagggtagtcgtcagtgg60ttcgacgccttggaataaaggtctcgagatgccacg96當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp