新的血紅蛋白聚合劑的製作方法

2023-08-05 19:47:56

專利名稱：新的血紅蛋白聚合劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及血紅蛋白聚合劑、它們的應用以及用聚合血紅蛋白製造血液替代品。
由於外科和野戰外科學的發展，輸血醫學已成為綜合性學科，但血液的質和量已不能滿足需要。輸血主要存在的問題是1．血液的安全性由於目前的檢測技術仍不能完全檢出血液中的病毒，因此不能避免C肝病毒(HCV)、B肝病毒(HBV)、庚肝病毒(HGV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、嗜T淋巴細胞病毒(HTLV)、單純皰疹病毒(CMV,EB)、細小病毒B19等所致的血源性疾病的感染和傳播；2．血型不合的風險；3．血源緊張；4．目前血液消毒、保存和運輸不能滿足野戰輸血的需要。戰時輸血要求急、數量大，往往難以找到合適的血液配型，以至於失血性休克成為戰場死亡的主要原因。在現代戰爭中，傷後4小時失血致死的人數佔傷員死亡總數的50％。因此，安全有效的血液替代品研究已成為當今世界的熱門課題之一。血液替代品研究的目標是獲得具有攜氧、釋氧、維持血容量及電解質平衡能力，無病原微生物汙染、無致熱原、無免疫原性、貯存期長、來源充足的血容量擴充劑，作以下幾方面的應用1．出血性休克的復甦；2．特定的圍手術期血液稀釋；3．在紅細胞血型不合時替代輸血；4．冠脈成形術中的灌注液；5．離體器官的保存；5．增強腫瘤放療的療效。
血液替代品研究迄今已有近百年的歷史，目前世界各國的政府、軍方及大型醫藥公司競相增加此項目的投資，取得了大量有價值的研究成果。其研究方向主要有兩個氟碳化合物和血紅蛋白(Hb)製品。氟碳化合物通過對氧的高溶解度而發揮作用，能有效地攜氧釋氧、維持血容量和電解質平衡。氟碳化合物的保存條件特殊、在使用前必須乳化、在空氣中溶氧量不足和要求吸入高濃度的氧等，是其在應用中的不便利之處。單核巨噬細胞系統吞噬大量的乳化顆粒引起功能阻斷等毒副作用是目前難以克服的困難，阻礙了其進一步應用。目前國外正開發新一代的氟碳化合物。
由於Hb具有獨特的氧結合特性和正常的生理代謝途徑，因此Hb類血液替代品比氟碳化合物更符合人體生理需要。而且Hb來源廣泛，可以從過期的庫血和牛血中提取。但是，天然的無紅細胞基質的人Hb(SFHb)溶液不能直接作為血液替代品使用，這是因為1．失去紅細胞內2,3-DPG調節，Hb氧親和力升高，不能向組織有效供氧。2．Hb在血漿中膠體滲透壓高，並迅速從其在紅細胞內的α2β2四聚體形式解聚為αβ二聚體，從腎濾過而產生強烈腎毒性，在循環中的半壽期僅為2-4小時。3．失去胞內還原酶系統調節，Hb易氧化成高鐵血紅蛋白(MetHb)，失去攜氧能力並產生自由基。所有以Hb為基礎的血液替代品的研究都集中於降低Hb的氧親和力、穩定α2β2四聚體結構和延長其循環半壽期，通常採用化學修飾、交聯、聚合和脂質體包封等方法來達到此目的。
雖然人們通常採用人Hb作為血液替代品的原料，但人Hb有來源有限及病原體汙染等缺點。1983年，Feola等發現牛Hb在輸入其它種屬的動物體內後不會導致抗體的迅速產生，隨後一些研究者探討了用牛Hb作為人血液替代品的原料的可能性。
牛Hb的基本結構也是α2β2四聚體，但由於其NA1(1)β缺失，NA2(2)β為Met〖人的NA1(1)β為Val,NA2(2)β為His〗，不能與2,3-DPG形成鹽橋，故不受2,3-DPG調節。β亞基的親水性N端趨向分子內親水區，帶動A螺旋向分子內移動，從而使牛Hb趨向於緊張態(T態)。另一方面，在從鬆弛態(R態)向T態的構象轉變中，由於R態結合O2導致牛Hb中央裂隙變寬，有利於Cl-內流，中和了裂隙中的正電荷，使裂隙變窄，促進O2的釋放從而轉變為T態。牛Hb在生理條件的Cl-濃度下，具有比人Hb(P50=26mmHg)更低的氧親和力(P50=31.6mmHg)，因而更容易向組織供氧。另一方面，由於牛Hb的氧親和力受Cl-調節，故在對牛Hb進行化學修飾後即可保持較正常的氧親和力，而不用象人Hb一樣需再加入共價調節劑，所以，用牛Hb作為血液替代品的原料可簡化製備工藝。
將Hb聚合是血液替代品研究的重要途徑之一。長期以來，人們一直在尋找合適的聚合劑，以便能穩定α2β2(64KD)四聚體並產生α2β2的寡聚體(∠500KD)。穩定四聚體結構可阻止Hb裂解為αβ二聚體從而防止腎損傷。α2β2的血漿半壽期只有2-4h，形成寡聚體則可將半壽期延長至25-46h並可降低膠體滲透壓和粘度。通常使用的聚合劑是戊二醛，已有數種聚合的Hb產品進入了臨床試驗，其中包括Biopure公司製備的polyHb。但在對戊二醛聚合的Hb進行大量研究後發現1．聚合反應不易控制；2．性質不穩定，保存兩個月後，凝膠過濾的洗脫曲線即發生變化；3．進入體內後會發生逆反應，由此生成的醛基有很大的毒性等。因此，需要研究新的聚合劑。
1983年，Acharya報導用乙醇醛成功聚合了RNase，隨後又有報導用乙醇醛可聚合羥甲基Hb和天然人Hb。乙醇醛聚合的人Hb比戊二醛聚合的穩定，在動物體內不會發生逆反應。但未見有關乙醇醛聚合的人Hb的進一步研究報導。
研究還發現，對現有的戊二醛和乙醇醛等聚合劑而言，它們的聚合反應程度是很難控制的，在反應時間延長和/或聚合劑量增加的時候，聚合程度會持續增加，從而形成聚合程度很大的聚合Hb，最終使Hb的聚合反應體系凝膠化。
多年以來，血液替代品研究者們在如何才能恰當地、更好地對Hb進行修飾這條路上艱難跋涉。若聚合反應進行得不充分，就意味著原材料的浪費和成本過高；若聚合程度過高，則不僅引起Hb結構和功能改變，還可由於這些改變在體內引起複雜的病理生理過程。要將聚合控制在一定程度是非常困難的，因為聚合必然要用雙功能或多功能交聯劑，這些交聯劑的活性基團隨機地與Hb表面的氨基發生親核加成反應，使聚合持續進行。在目前已知的交聯劑中，最成功的是BAXTER公司的雙阿斯匹林，由於它是聚陰離子，可特異地與Hb亞基界面之間的正電荷區域結合，因此成功實現了定位交聯，但此反應只發生在分子內。這種只有分子內交聯的Hb分子雖然不再從腎濾出，但其血漿半壽期只為4h左右，不足以持續地向機體供氧。增加Hb的分子量可有效延長其循環半壽期，但聚合反應的難以控制使人們在這一方向的研究進展緩慢。
對血液替代品的基本要求是應該具有與血液相類似的攜氧供氧能力，這需要polyHb具有適當的氧親和力。聚合反應往往導致Hb氧親和力的升高，使其失去在組織中的氧分壓下釋氧的能力，因此對聚合產物的氧親和力的評價是血液替代品研究中首要而又關鍵的一個環節。
為了探索新的聚合途徑，本發明從聚合反應動力學和熱力學入手，在降低雙功能交聯劑單基團親電性的同時，引入空間位阻，從而顯著提高了聚合反應的能壘、降低了聚合反應的速度，反應體系的凝膠化被完全抑制，大分子聚合物的形成被降到很低的水平，產物以低聚態的Hb為主，基本實現了Hb聚合反應的可控制。同時，反應產物的氧親和力保持在與血液接近的很合適的水平。丙酮醛及其結構類似物這一類新聚合劑的提出，在國際上處於領先水平。
本發明的化合物作為血紅蛋白聚合劑具有如下結構。 其中R』代表H-或1-10個碳的支鏈或支鏈烷基。
R代表 或 或 A代表H-或1-10個碳的支鏈或支鏈烷基，n為1至7的阿拉伯數字。
這些化合物包括丙酮醛、2,3-丁二酮、1-羥基-2-丁酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-己二酮、2,4-己二酮、2,5-己二酮、3-乙基-2,4-戊二酮、6-甲基-2,4-庚二酮、丙酮醇。
用本發明的化合物將天然牛或人血紅蛋白進行適當化學修飾後，即可製成有適當氧親和力(P50為28-34mmHg)的大分子聚合血紅蛋白，將其溶於溶液中(此溶液所含的電解質和pH值與血漿近似)即可製成血液替代品。
本發明的化合物作為血紅蛋白聚合劑製備聚合血紅蛋白的方法，包括用式(Ⅰ)化合物與人或牛的血紅蛋白反應。
本發明化合物可聚合血紅蛋白以用來製備血液替代品。
本發明的血液替代品的製備方法，包括將聚合血紅蛋白溶解於電解質和pH值與血漿近似的溶液，此溶液含有還原型穀胱甘肽(GSH)或其他巰基(-SH)供體。
通過下面的反應可將牛或人的血紅蛋白進行化學修飾。化學修飾包括在牛或人血紅蛋白分子內的不同亞基間形成分子內交聯，同時也在不同的血紅蛋白分子間形成分子間聚合。1)反應類型之一 R、R″可為H或烷基，R′可為-(CH2)n-，或可預設。2)反應類型之二 R、R』可為H或烷基上述兩類反應所用的聚合劑為反應類型1為在烷鏈上有兩個羰基(-CO-)的本發明化合物。
反應類型2為在烷鏈上有一個羰基(-CO-)，在其鄰位的碳原子上有一個羥基的化合物本發明化合物。
本發明通過以下實施例來描述本發明的化合物，應用，製備以及血液替代品的製備、組成。
實施例1用丙酮醛(Pyruvic aldehyde,CH3COCHO)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入36ml脫氣的10％丙酮醛(Pyruvic aldehyde)貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實施例2用2,3-丁二酮(2,3-Butanecdione,CH3COCOCH3)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入43ml脫氣的10％2,3-Butanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實旄例3用1-羥基-2-T酮(1-Hydroxy-2-butanone,C2H5COCH2OH)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入44ml脫氣的10％1-Hydroxy-2-butanone貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實施例4用3-羥基-2-丁酮[3-Hydroxy-2-butanone,CH3COCH(OH)CH3]聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入44ml脫氣的10％3-Hydroxy-2-butanone貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實施例5用2,3-己二酮(2,3-Hexanedione,CH3CH2CH2COCOCH3)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,3-Hexanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實旋例6用2,4-己二酮(2,4-Hexanedione,CH3CH2COCH2COCH3)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,4-Hexanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實施例7用2,5-己二酮(2,5-Hexanedione,CH3COCH2CH2COCH3)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,5-Hexanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實施例8用3-乙基-2,4-戊二酮[3-ethyl-2,4-pentanedion,CH3COCH(C2H5)COCH3]聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入64ml脫氣的10％3-ethyl-2,4-pentanedion貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實施例9用6-甲基-2,4-庚二酮[6-methyl-2,4-heptanedione,(CH3)2CHCH2COCH2COCH3]聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入71ml脫氣的10％6-methyl-2,4-heptanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實施例10用丙酮醇(Acetol,CH3COCH2OH)聚合牛血紅蛋白將1L 15％的純淨牛血紅蛋白(牛Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入37ml脫氣的10％丙酮醇(Aceto1)貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的混合物，最後調pH至7.4。用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合牛Hb的50％氧飽和度(P50)為29mmHg。
實旌例11用丙酮醛(Pyruvic aldehyde,CH3COCHO)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入36ml脫氣的10％丙酮醛(Pymvic aldehyde)貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實施例12用2,3-丁二酮(2,3-Butanedione,CH3COCOCH3)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入43ml脫氣的10％2,3-Butanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實施例13用1-羥基-2-丁酮(1-Hydroxy-2-butanone,C2H5COCH2OH)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入44ml脫氣的10％1-Hydroxy-2-butanone貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實施例14用3-羥基-2-丁酮[3-Hydroxy-2-butanone,CH3COCH(OH)CH3]聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入44ml脫氣的10％3-Hydroxy-2-butanone貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實施例15用2,3-己二酮(2,3-Hexanedione,CH3CH2CH2COCOCH3)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,3-Hexanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實施例16用2,4-己二酮(2,4-Hexanedione,CH3CH2COCH2COCH3)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,4-Hexanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實施例17用2,5-己二酮(2,5-Hexanedi one,CH3COCH2CH2COCH3)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入57ml脫氣的10％2,5-Hexanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實施例18用3-乙基-2,4-戊二酮[3-ethyl-2,4-pentanedion,CH3COCH(C2H5)COCH3]聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入64ml脫氣的10％3-ethyl-2,4-pentanedion貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實施例19用6-甲基-2,4-庚二酮[6-methyl-2,4-heptanedione,(CH3)2CHCH2COCH2COCH3]聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入71ml脫氣的10％6-methyl-2,4-heptanedione貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mM NaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
實施例20用丙酮醇(Acetol,CH3COCH2OH)聚合人血紅蛋白將1L 15％的純淨人血紅蛋白(人Hb，溶於生理鹽水，pH6.4)放入3L二口圓底燒瓶中，燒瓶的二口分別與真空泵和N2鋼瓶相聯，將燒瓶內抽真空至-0.075MPa後，通入N2至與大氣等壓，輕搖燒瓶10min。重複抽氣和通N2後，監測Hb溶液中O2Hb的濃度降到2％以下。加入脫氣的30ml 1M NaCO3將Hb溶液的pH值調至8.5，再加入37ml脫氣的10％丙酮醇(Acetol)貯存液，升溫至30℃並用磁力攪拌器攪拌90min後，緩慢加入85.7ml的1.56％NaBH4(溶於10mMNaOH)以終止聚合反應。反應終止後保持脫氧狀態於60℃水浴10h，然後於4℃將反應混合物對生理鹽水透析，並用500KD和100KD的中空纖維柱去除聚合產物中大於500KD和小於100KD的成分，所得產物為分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的混合物，最後調pH至7.4。向溶液中加入2,3-DPG或2,3-二磷酸吡哆醛等調節人Hb氧親和力的共價調節劑後，用ABL520血氣分析儀(Radiometer)檢測，此分子量分布在100KD至500KD之間的聚合人Hb的50％氧飽和度(P50)為26mmHg。
上述各實施例中，聚合劑與人或牛血紅蛋白的分子數之比為21.3∶1，此比例變化時聚合反應仍可進行。
保護上述各聚合劑與人血紅蛋白和牛血紅蛋白的聚合反應。
這些聚合反應的產物可作以下幾方面的應用1．出血性休克的復甦；2．特定的圍手術期血液稀釋；3．在紅細胞血型不合時替代輸血；4．冠脈成形術中的灌注液；5．離體器官的保存；5．增強腫瘤放療的療效。
本發明的血液替代品的實例如下(注PolyHb為聚合牛Hb或聚合人Hb)
權利要求
1．式(Ⅰ)化合物作為血紅蛋白聚合劑的應用。 其中R』代表H-或1-10個碳的支鏈或支鏈烷基。R代表 或 或 A代表H-或1-10個碳的支鏈或支鏈烷基，n為1至7的阿拉伯數字。
2．權利要求1中的化合物是丙酮醛、2,3-丁二酮、1-羥基-2-丁酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-己二酮、2,4-己二酮、2,5-己二酮、3-乙基-2,4-戊二酮、6-甲基-2,4-庚二酮、丙酮醇。
3．用權利要求1中的化合物作為血紅蛋白聚合劑製備聚合血紅蛋白的方法，其特徵是用式(Ⅰ)化合物與人或牛的血紅蛋白反應。
4．用權利要求3中的聚合血紅蛋白製備血液替代品。
5．權利要求4中用聚合血紅蛋白製備出的血液替代品。
6．權利要求5中的血液替代品的製備方法，其特徵在於將聚合血紅蛋白溶解於電解質和pH值與血漿近似的溶液，此溶液含有還原型穀胱甘肽(GSH)或其他巰基(-SH)供體。
全文摘要
本發明公開了新的血紅蛋白(Hb)聚合劑,他們的製備及應用,本發明的Hb聚合劑顯著提高了聚合反應的能壘、降低了聚合反應的速度,反應體系的凝膠化基本被完全抑制,大分子聚合物的形成被降到很低的水平,產物以低聚態的聚合Hb為主,基本實現了Hb聚合反應的可控制。
文檔編號A61K38/42GK1306858SQ0010064
公開日2001年8月8日 申請日期2000年1月25日 優先權日2000年1月25日
發明者王鶴堯 申請人:王鶴堯