一種快速定量檢測hcg的試紙條及檢測方法

2023-08-05 19:30:46 1

專利名稱：一種快速定量檢測hcg的試紙條及檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物應用技術領域，特別涉及一種快速定量檢測HCG的試紙條及檢測方法。
背景技術：
當受精卵植入子宮後，孕婦體內就會分泌一種新激素，稱為人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotrophin,簡稱 HCG)。HCG 於 1927 年被 Aschheim 和 zondek 在孕婦尿中首次發現。HCG是細胞滋養層及合體滋養層分泌的一種激素，它首先存在於胎盤中，通過血液循環而排洩到尿中。在胎盤、血液和尿中均存在HCG及其代謝產物。在受孕後10天左右，就可以在孕婦的晨尿中檢測到HCG。正常妊娠婦女血清中，HCG濃度在黃體達到峰值後的7 10天或受精卵植入子宮後的4 7天後開始增加，並以指數形式增長，平均每I. 5 2天濃度就翻倍，不過增加速率也因人而異。妊娠7 10周後HCG濃度就可達 20，000 100，000IU/L，在妊娠13 15周時濃度有所降低，之後又開始緩慢增加直至妊娠30 33周，接著又緩慢降低直至妊娠結束。異位妊娠HCG上升則較緩慢，或懷孕的3 6周，HCG不能持續翻倍增加，應考慮異位妊娠或先兆流產的可能。HCG是早期妊娠中的主要信號，特異性標誌，已成為臨床上診斷早期妊娠的常用指標。定量動態監測HCG量也作為異位妊娠的監控指標。早期檢測妊娠的方法主要有三種超聲檢測、基礎體溫測定和免疫層析檢測。超聲檢測由於只能檢測妊娠6周後子宮的情況，而通常被用於臨床上胎兒的監測。基礎體溫測定雖然簡單易行卻又比較繁瑣。免疫層析檢測由於它的操作簡便、具有直觀、快速、檢測效率高、方法簡便、無汙染、費用低廉、靈敏度高、特異性強等優點，被廣泛應用於臨床診斷、野外現場及家庭自我檢測。免疫層析檢測HCG的試劑運用雙抗體夾心法。當測試液浸泡或滴入試紙條的樣品墊後，通過吸水纖維的毛細作用，測試液迅速溼透金標結合墊，金標結合墊上的膠體金結合物被溶解，並隨測試液一起沿層析材料向前移動。若測試液中存在待測抗原Ag，則它就會和膠體金結合物中的抗體發生特異性免疫反應，形成膠體金結合物-待測抗原的免疫複合物。然後隨測試液一起流經固定在Ne膜上T線的捕獲試劑。T線的捕獲試劑捕獲膠體金結合物-待測抗原免疫複合物，即與該免疫複合物發生特異性免疫反應，形成膠體金結合物-待測抗原-捕獲試劑的免疫複合物，從而使膠體金結合物-待測抗原免疫複合物滯留在T線處。測試液繼續前移，在流經Ne膜上固定有羊抗鼠IgG抗體的C線時，未與待測抗原Ag發生反應的膠體金結合物與C線上羊抗鼠抗體發生免疫反應，從而使得游離的膠體金結合物滯留在C線處。此時T線和C線處均有膠體金結合物滯留，即T線和C線處均能觀察到顏色(紅色或紫色)，則表示檢測結果為陽性結果，即測試液中有待測抗原；若僅C線處觀察到顏色，而T線處未觀察到顏色，則表示檢測結果為陰性結果，即測試液中無待測抗原；待測液中HCG含量不同，所產生的T線顏色深淺也不相同，隨著HCG含量的增加，T線顏色就會越深。然而，在一些樣品中高濃度HCG則可導致高水平的「鉤狀效應(hook effect)」，即HCG濃度遠遠大於膠體金試紙條的檢測上限時，HCG測得結果反而隨濃度的增加而下降，T線顏色反而變淺，在臨床診斷中造成HCG低水平的假象，使診斷結果出現不真實的問題。

發明內容
本發明的目的在於提供一種快速定量檢測HCG的試紙條及檢測方法，尤其是提供一種能快速定量檢測尿液或血液中HCG的試紙條。實現本發明的技術方案為，一種快速定量檢測HCG的試紙條及檢測方法，包括上樣墊、標記物墊、NC膜、吸樣墊和塑料板，所述試紙條與免疫層析判讀儀配套使用進行HCG的定量檢測，對待測樣品進行稀釋後定量檢測範圍為10 15000mIU/ml。所述的上樣墊(I)、標記物墊(2)、NC膜(3)和吸樣墊(4)依次粘附於塑料板(8)，標記物墊(2)上包被有膠體金標記的鼠抗HCG-β單克隆抗體，NC膜(3)上分別包被有鼠抗 HCG- α抗體構成的檢測線T線(6)和羊抗鼠IgG抗體構成的質控線C線(7)，同時在NC膜
(3)上檢測線T線(6)靠近標記物墊(2) —側劃有用於標示加樣位置的加樣指示線(5)。所述的試劑條通過以下的步驟進行製備(I)膠體金標記鼠抗HCG-β單克隆抗體標記物墊的製備用氯金酸-檸檬酸三鈉還原法製備直徑為40nm的膠體金溶液，製備完成後取三份膠體金溶液，分別用O. 2MK2C03將溶液PH調到pH7. 5、pH8. 5、pH9. 5、然後將溶液置於磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液O. 5mg、I. Omg, I. 5mg鼠抗HCG- β單克隆抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續攪拌I小時，再加入終濃度為O. 2% BSA, O. I %聚乙二醇20000進行封閉30分鐘，12000轉離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復溶至76. 5ml，按Iml溶液鋪16cm2的比例均勻地鋪在無紡布上，再置於溫度20 25°C、溼度小於30%的乾燥間乾燥2 4小時，製成標記物墊，備用；
(2)鼠抗HCG- α抗體包被用O. OlM pH7. 2PBS將鼠抗HCG- α抗體分別稀釋成1.011^/1111、1.51^/1111、2.01^/1111，然後用噴膜儀將鼠抗!^-(1抗體包被液在NC膜上按I. 3ul/cm劃線包被，構成檢測線T線；同時包被羊抗鼠IgG抗體作為C線，同時在NC膜上檢測線T線靠近標記物墊一側劃有用於標示加樣位置的加樣指示線，包被完成後將NC膜置於乾燥間乾燥3 4小時，備用；(3)試紙條的裝配在溫度20 25°C、溼度小於30%的乾燥室內，取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接標記物墊，在標記物墊另一側搭接粘貼上樣墊，在NC膜C線一側距邊緣搭接吸樣墊；然後用裁剪機將貼好的塑料板切成適當寬度的試紙條。一種定量檢測HCG的方法，所述方法包括以下步驟(I)儀器內存標準曲線的繪製以國家參考品為參比，將HCG標準品溶液用正常人尿液(陰性)或牛血清稀釋成濃度為 OmIU/ml、10mIU/ml、50mIU/ml、250mIU/ml、IOOOmIU/ml、2500mIU/ml、5000mIU/ml、lOOOOmlU/ml、15000mIU/ml 系列標準品，平衡至室溫，將製備好的試劑條平放，在NC膜標示線上加入3 5ul待檢標準品，然後向上樣墊上加入60 80ml樣本稀釋液，靜止10分鐘後放入配套的免疫層析判讀儀中進行讀數，以測得GOD值(X)作為橫坐標，以HCG含量(y)作為縱坐標，繪製儀器內存標準曲線；(2)按照步驟(I)的方法檢測待測樣品，並通過標準曲線獲得所述待測樣品的HCG濃度。
所述的免疫層析判讀儀綜合應用機械、電子、光學、微機以及心理物理學的原理和方法，達到智能人眼識別判讀功能，對免疫層析試劑反應線的視覺信號自動定位，背景剔除，顏色分辨，量化處理，通過一個量化的GOD值表現出來。即在一定的範圍內，線條顏色的深淺與被測物的濃度可以呈現出一定的關係，在測試反應過程中只要做一條標準曲線儲存在儀器自帶IC卡中，就能夠對免疫層析試劑條進行定量測試。所述試紙條不但能夠克服現有檢測試劑因HCG含量過高而產生的鉤狀效應，而且能夠對血液或尿液中的HCG定量監測，避免了樣本稀釋所帶來的麻煩和誤差。簡便、準確、快速定量、靈敏度和特異性高、經濟實用且與其它激素無交叉，可以更好的滿足臨床要求。與現有技術相比，本發明涉及的快速定量檢測HCG的試紙條具有如下優點和顯著的進步(I)多功能性本發明既可定性，又可定量檢測出尿液或血液中HCG的含量；(2)快速定量配套的免疫層析判讀記錄儀將人肉眼觀察到檢測區反應顯色的顏·色深淺程度進行了量化，根據儀器內存標準曲線，在一定的範圍內，反應線條顏色的深淺與被測物的濃度可以呈現出一定的關係，可準確對樣本中HCG濃度進行定量；(3)克服了鉤狀效應本發明不但能夠克服現有檢測試劑因HCG含量過高而產生的鉤狀效應，而且能夠對血液或尿液中的HCG定量監測，具體為，檢測時加樣方式為先在NC膜上加入3 5ul被檢樣本，然後向上樣墊上加入適量稀釋液，既克服了現有檢測試劑因HCG含量過高而產生的鉤狀效應，避免了由此產生的誤判、假陰性結果，又提高了試劑的檢測靈敏度，靈敏度可達10mIU/ml ；(4)可保存和追溯數據和圖片目前市場用於檢測HCG的快速試劑由於本身的特點即在一定時間內顯示的顏色有效，所以大多數都是看完結果後就把試劑卡扔棄了，本試劑配套的判讀記錄儀不僅能保存產品有效測試時間內判定結果的圖像資料，也能保存原始的整個圖像信息。


圖I為快速檢測HCG的膠體金試紙條結構示意圖；I、上樣墊；2、標記物墊；3、硝酸纖維素(NC)膜；4、吸樣墊；5、加樣指示線；6、檢測線T線；7、質控線C線；8、塑料板。
具體實施例方式以下是本發明涉及的快速定量檢測血液中毒品的方法的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步作描述，但是本發明的保護範圍並不限於這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護範圍之內。實施例IHCG檢測試紙條的製備及檢測應用(I)膠體金標記鼠抗HCG-β單克隆抗體標記物墊的製備用氯金酸-檸檬酸三鈉還原法製備直徑為40nm的膠體金溶液，製備完成後取三份膠體金溶液，分別用O. 2MK2C03將溶液pH調到pH7. 5、pH8. 5、pH9. 5、然後將溶液置於磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液O. 5mg、I. Omg> I. 5mg鼠抗HCG- β單克隆抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續攪拌I小時，再加入終濃度為O. 2% BSA, O. I %聚乙二醇20000進行封閉30分鐘，12000轉離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復溶至76. 5ml，按Iml溶液鋪16cm2的比例均勻地鋪在無紡布上，再置乾燥間溫度20 25°C，溼度小於30%乾燥2 4小時，製成標記物墊，備用。(2)鼠抗HCG-α抗體包被用O. OlM pH7. 2PBS 將鼠抗 HCG-α 抗體分別稀釋成 I. Omg/ml、I. 5mg/ml、2. Omg/ml，然後用噴膜儀將鼠抗HCG-α抗體包被液在NC膜上按I. 3ul/cm劃線包被，構成檢測線T線；同時包被羊抗鼠IgG抗體作為C線，同時在NC膜上檢測線T線靠近標記物墊一側劃有用於標示加樣位置的加樣指示線。包被完成後將NC膜置於乾燥間乾燥3 4小時，備用。(3)試紙條的裝配在乾燥室內溫度20 25°C，溼度小於30 %，取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接標記物墊，在標記物墊另一側搭接粘貼上 樣墊；在NC膜C線一側距邊緣搭接吸樣墊。然後用裁剪機將貼好的塑料板切成適當寬度的試紙條。切好的試紙條也可以裝入塑料卡內，形成檢測試劑卡。(4)儀器內存標準曲線的繪製以國家參考品為參比，將HCG標準品溶液用正常人尿液(陰性)或牛血清稀釋成濃度為 0mIU/ml、10mIU/ml、50mIU/ml、250mIU/ml、1000mIU/ml、2500mIU/ml、5000mIU/ml、10000mIU/mlU5000mIU/ml系列標準品，平衡至室溫，將製備好的試劑條平放，在NC膜標示線上加入3 5ul待檢標準品,然後向上樣墊上加入60 80ml樣本稀釋液，靜止10分鐘後放入配套的免疫層析判讀儀中進行讀數，以測得GOD值(X)作為橫坐標，以HCG含量(y)作為縱坐標，繪製儀器內存標準曲線。(5)臨床樣本檢測按照上述檢測方法檢測臨床樣本30份，以奧普HCG定量試劑為對照，結果表明本產品靈敏度達10mIU/ml，特異性100%，和奧普HCG定量試劑結果符合率為98. 1%。
權利要求
1.一種快速定量檢測HCG的試紙條，包括上樣墊(I)、標記物墊(2)、NC膜(3)、吸樣墊(4)和塑料板(8)，其特徵在於，所述試紙條與免疫層析判讀儀配套使用進行HCG的定量檢測，對待測樣品進行稀釋後定量檢測範圍為10 15000mIU/ml。
2.根據權利要求I所述的試紙條，其特徵在於，所述的上樣墊(I)、標記物墊(2)、NC膜(3)和吸樣墊(4)依次粘附於塑料板(8)，標記物墊⑵上包被有膠體金標記的鼠抗HCG-β單克隆抗體，NC膜(3)上分別包被有鼠抗HCG-α抗體構成的檢測線T線(6)和羊抗鼠IgG抗體構成的質控線C線(7)，同時在NC膜(3)上檢測線T線(6)靠近標記物墊(2) —側劃有用於標示加樣位置的加樣指示線(5)。
3.根據權利要求I所述的試劑條，其特徵在於，所述的試劑條通過以下的步驟進行製備 (1)膠體金標記鼠抗HCG-β單克隆抗體標記物墊的製備用氯金酸-檸檬酸三鈉還原法製備直徑為40nm的膠體金溶液，製備完成後取三份膠體金溶液，分別用O. 2MK2C03將溶液PH調到pH7. 5、pH8. 5、pH9. 5、然後將溶液置於磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液O.5mg、I. Omg> I. 5mg鼠抗HCG- β單克隆抗體緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續攪拌I小時，再加入終濃度為O. 2% BSA, O. I %聚乙二醇20000進行封閉30分鐘，12000轉離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復溶至76. 5ml，按Iml溶液鋪16cm2的比例均勻地鋪在無紡布上，再置於溫度20 25°C、溼度小於30%的乾燥間乾燥2 4小時，製成標記物墊，備用； (2)鼠抗HCG-α抗體包被用O.OlM pH7. 2PBS將鼠抗HCG-α抗體分別稀釋成I. Omg/ml、I. 5mg/ml、2. Omg/ml，然後用噴膜儀將鼠抗HCG-α抗體包被液在NC膜上按I. 3ul/cm劃線包被，構成檢測線T線；同時包被羊抗鼠IgG抗體作為C線，同時在NC膜上檢測線T線靠近標記物墊一側劃有用於標示加樣位置的加樣指示線，包被完成後將NC膜置於乾燥間乾燥3 4小時,備用； (3)試紙條的裝配在溫度20 25°C、溼度小於30%的乾燥室內，取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側搭接標記物墊，在標記物墊另一側搭接粘貼上樣墊，在NC膜C線一側距邊緣搭接吸樣墊；然後用裁剪機將貼好的塑料板切成適當寬度的試紙條。
4.一種定量檢測HCG的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟 (1)儀器內存標準曲線的繪製以國家參考品為參比，將HCG標準品溶液用正常人尿液(陰性)或牛血清稀釋成濃度為 OmIU/ml、10mIU/ml、50mIU/ml、250mIU/ml、1000mIU/ml、2500mIU/ml、5000mIU/ml、10000mIU/ml、15000mIU/ml 系列標準品，平衡至室溫，將製備好的試劑條平放，在NC膜標示線上加入3 5ul待檢標準品，然後向上樣墊上加入60 80ml樣本稀釋液，靜止10分鐘後放入配套的免疫層析判讀儀中進行讀數，以測得GOD值(X)作為橫坐標，以HCG含量(y)作為縱坐標，繪製儀器內存標準曲線。
(2)按照步驟(I)的方法檢測待測樣品，並通過標準曲線獲得所述待測樣品的HCG濃度。
全文摘要
本發明涉及一種快速定量檢測HCG的試紙條及檢測方法，該試紙條包括上樣墊、標記物墊、NC膜、吸樣墊和塑料板，所述的上樣墊、標記物墊、NC膜和吸樣墊依次粘附於塑料板，標記物墊上包被有膠體金標記的鼠抗HCG-β單克隆抗體，NC膜上分別包被有鼠抗HCG-α抗體構成的檢測線T線和羊抗鼠IgG抗體構成的質控線C線，同時在NC膜上檢測線T線靠近標記物墊一側劃有用於標示加樣位置的加樣指示線。本發明的試紙條通過膜上加樣方式不但能夠克服現有檢測試劑因HCG含量過高而產生的鉤狀效應，且通過配套的免疫層析判讀儀能夠對血液或尿液中的HCG定量監測。
文檔編號G01N33/76GK102890157SQ20111020302
公開日2013年1月23日 申請日期2011年7月20日 優先權日2011年7月20日
發明者李洲, 許俊豔 申請人:天津中新科炬生物製藥有限公司