Hsv/φc31雜合性擴增子載體系統及其製備方法

2023-07-24 22:13:16

專利名稱：Hsv/φc31雜合性擴增子載體系統及其製備方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，涉及一種新型HSV/OC31雜合性擴增子載體系統及其 製備方法和應用。
背景技術：
基於單純皰疹病毒I型(herpes simplex virus type 1，HSV_1)的載體包括重組 病毒型和重組質粒型兩種類型。後者又稱為複製缺陷性(Iteplication-defective)載體或 擴增子載體(amplicon vectors)。擴增子載體由一個含有HSV DNA複製起點序列oris和 包裝信號 pac 的質粒組成[Spaete RR et al. The herpes simplex virusamplicon :a new eucaryotic defective-virus cloning-amplifying vector. Cell ;1982;30 :295_304]。 在HSV輔助病毒作用下被允許以串聯體形式包裝入HSV病毒，無HSV輔助病毒時，這些載 體可以通過與一組已刪除HSV基因組保留pac信號序列的粘粒或BAC質粒共轉染而得 到包裝[Wade-Martins R，et al. An infectioustransfer and expression system for genomic DNA loci in human and mousecells. Nat Biotechnol. 2001 ;19 :1067-70]。由 於HSV擴增子載體不攜帶任何病毒基因，從而不誘導病毒蛋白的合成，因而，HSV擴增子載 體對感染的細胞或機體來講無毒性和無致病性[Frampton AR, et al. HSV trafficking and development of genetherapy vectors with applications in the nervous system Gene Therapy 2005，12，891-901]。該載體的另一個優點是有較大的轉基因容量，通常 可達 22Kb,最大可達 150kb[Epstein AL HSV-l-based amplicon vectors :design and applications GeneTherapy 2005，12，S154-S158]；此外，該載體包裝成的病毒有相當高的 滴度，能夠有效轉移目的基因到許多不同的靶細胞[Qi J，et al. Functional expression ofATM gene carried by HSV amplicon vector in vitro and in vivo. Gene Ther. 2004, 11 ；25-33.]，因而，HSV擴增子載體已成為在體內外進行基因功能研究和基因治療實驗的 有用工具。然而，HSV擴增子載體系統的主要不足在於轉基因的表達是瞬時的(transient) [Frampton AR,et al. HSV trafficking and development of genetherapy vectors with applications in the nervous system Gene Therapy 2005，12，891-901]，因而，限制了在 基因功能研究上的廣泛應用，尤其在需要長期基因表達的遺傳病基因治療。研究發現，HSV擴增子載體DNA在感染細胞胞核中處於非整合的環狀狀態，該 存在方式是其轉基因瞬時表達的原因[Epstein AL。HSV-l-based amplicon vectors design and applications Gene Therapy 2005，12，S154-S158]。而基於慢病毒載體 (lentivirus-based vector, LV)反轉錄病毒載體，及重組腺相關病毒(recombination adeno-associated virus，rAAV)介導的基因轉移，雖然，外源基因可被整合在染色體上 而得到長期表達，但這些整合是隨機的，易導致插入突變；對於基因功能研究來說，插入 突變的表型常混淆基因功能的分析，而對於基因治療來說，導致安全性問題[Thomas CE, Ehrhardt A and Kay MA. Progress and problems withthe use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genetic，2003，4，246-258]。最近，有數個研究小組已發現了 AAV、逆轉錄病毒和慢病毒載體感染體外培養細胞，易插入基因活躍區[Miller DG, PetekLM, RussellDff. Adeno-associated virus vectors integrate at chromosome breakage sites. Nat Genet. 2004 ；36 767-73. ] ；2002年末以來，在法國有10例重症聯合免疫缺 陷(SCID)兒童經逆轉錄病毒載體介導的基因治療成功治癒後，其中有3例相繼發生了類 白血病樣的事件，其中一例已證實與逆轉錄病毒載體隨機插入使LM02癌基因激活有關 [Hacein-Bey-Abina S, etal. . LM02_associated clonal T cell proliferation in two patients after genetherapy for SCID-X1. Science. 2003 ；302 :415_9]。這些研究凸顯了 病毒載體的使用存在著潛在的安全隱患，因而，發展既有效又安全的新型病毒載體已成為 目前國內外遺傳病基因治療領域的重要方向和趨勢。因此，在解決基於HSV擴增子載體介 導基因轉移的轉基因不能長期表達的問題同時，必須要考慮安全性問題，理想的策略則是 對HSV擴增子載體進行遺傳修飾使其實現位點特異性或靶向性整合。目前，國外已有數家實驗室在該領域進行了探索，主要策略是通過HSV與 整合元件的結合所構成的雜合性擴增子載體來介導整合。一方面，利用腺相關病毒 (adenoassociated virus, AAV)編碼的R印蛋白能夠介導攜帶有AAV末端反向重複序列 (inverted terminal repeats, ITR)的轉基因整合於人基因組19號染色體AAVSl位點上 的特性，將AAV-ITR及rep基因克隆到HSV擴增子載體上，建立雜合性HSV/AAV擴增子載 {φ [Bakowska, et al. . Breakefield. Targeted transgene integration intotransgenic mouse fibroblasts carrying the full-length human AAVSl locusmediated by HSV/ AAV rep hybrid ampiicon vector. Gene Ther. 2003 ; 10 :1691—1702]。最初的研究結果顯 示了雜合HSV/AAV擴增子載體介導的轉基因可特異整合在AAVSl位點並穩定表達，然而，病 毒感染效率甚低，僅2-7%，其原因與Rep蛋白對包裝細胞和感染細胞的毒性有關。最近， Liu等在上述策略的基礎上，利用Cre/LoxP位點特異重組酶系統來調控r印基因的表達， 不僅解決了 rep基因不適當表達所致的毒性問題，而且也改善了病毒感染效率。在攜帶有 編碼Cre位點特異重組酶基因的293細胞上，病毒感染效率達到22%，其中，在70%感染細 胞上發生了 AAVSl位點特異性整合[18]。然而，該策略的關鍵是依靠了 Cre重組酶在靶細 胞系上的表達，而Cre重組酶在靶細胞系上的持續表達可引起染色體的不穩定，也就是說 Cre重組酶的引入解決了 Rep蛋白毒性問題，但同時Cre重組酶又帶來了新的安全性問題， 因而，該策略有其局限性.另一方面，利用SB轉座酶系統(Sloping Beautytranspossase system)與HSV擴增子載體結合構成雜合性HSVsb擴增子載體[BowersWJ，et al. Neuronal Precursor-Restricted Transduction via in Utero CNS GeneDelivery of a Novel Bipartite HSV Amplicon/Transposase Hybrid Vector. Mol Ther. 2006，13 :580_588.]，結 果顯示轉座元整合和目的基因的長期表達，但轉座元整合常引起插入性突變，因而，雜合性 HSVsb擴增子載體更有安全性隱患。最近，來源於嗜菌體的OC31整合酶系統由於能夠在不需要加任何輔助因子 情況下介導攜帶有位點(attB)外源基因位點特異整合在哺乳細胞基因組假attP位 _t (Thyagarajan B, et al. Site-specific genomic integration in mammalian cellsmediated by phage phiC31 integrase. Mol Cell Biol 2001，21 :3926_3934。 01ivaresEC, et al. Site-specific genomic integration produces therapeutic FactorIX levels in mice. Nat Biotechnol 2002，20 :1124_1128)，因而，OC31 整合酶系統的上述生化和生物學特性使其成為遺傳操作中獨特而有用的工具。但是近來的研究表 明，OC31整合酶也會導致訴諸細胞產生染色體畸形的問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種位點特異整合性的雜合性HSV/c5C31擴增子載體系統， 以克服HSV擴增子載體介導的轉基因不能長期表達的問題，又可大大減少甚至避免了插入 突變的風險，使該載體成為集有效性、安全性和操作簡便性於一體的新型病毒載體系統。本發明的另一個目的是提供上述載體系統的製備方法。本發明的位點特異性整合雜合性HSV/OC31擴增子載體系統，將OC31整合酶系 統與HSV擴增子載體有機結合，不僅解決基於HSV擴增子載體介導的轉基因不能長期表達 的問題，也大大減少甚至避免了插入突變的風險。所獲得的HSV/OC31擴增子載體系統中，OC31整合酶受巨細胞病毒啟動子(CMV) 的調控，當OC31整合酶表達時該酶可特異識別載體上attB序列和哺乳細胞基因組假attP 位點，並介導attBXattP重組，由此導致載體整合在哺乳細胞基因組假attP位點上，因此 可解決基於HSV擴增子載體介導基因轉移不能整合的問題。同時，由於attB位點位於CMV 調控區和編碼OC31整合酶基因之間，因而，一旦ΦC31整合酶介導attBXattP重組後，可 導致OC31整合酶基因失去被CMV的調控，從而使OC31整合酶表達失活，因而，也避免了 長期Φ031整合酶基因對細胞可能毒性，具有安全性特點。本發明提供了一種雜合性HSV/C5C31擴增子載體系統。該載體系統包含雜合 性HSV/OC31擴增子載體及5個無輔助病毒包裝粘粒C0S6Aa、C0S14、C0S28、C0S56和 C0S48 Δ a ；雜合性HSV/OC31擴增子載體質粒由HSV擴增子載體pHSV_GFP、巨細胞病毒啟 動子、attB位點、Φ031整合酶基因編碼序列和多聚腺嘌呤組成，attB位點位於巨細胞病毒 啟動子和Φ031整合酶基因編碼序列之間。PCMV-C31載體由美國史丹福大學Calos教授惠贈。attB序列至少含有34鹼基 GTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCG(SEQ ID NO 1)，文章出自 「Groth，et al. Aphage integrase directs efficient site-specific integration in human cells, PNAS, 2000，97，5995-6000」。野生型OC31位點特異整合酶基因OC31(，簡稱為C31，NCBI登陸 號為AX816372)。編碼OC31位點特異重組酶質粒CMV int,突變體的克隆載體pINT_T，來 源於美國Carlos博士實驗室惠贈，來源於文章Groth AC, Olivares EC, Thyagarajan B， Calos MP. A phage integrase directs efficientsite-specific integration in human cells. Proc Natl Acad Sci USA2000,97 5995-6000 ；Sclimenti CR,Thyagarajan B,Calos MP. Directed evolution ofa recombinase for improved genomic integration at a native human sequence. Nucleic Acids Res. 2001,15 ；29 (24) :5044_51o較好的，attB位點和OC31整合酶基因編碼序列依次相連。更好的，巨細胞病毒 啟動子、attB位點、OC31整合酶基因編碼序列和多聚腺嘌呤依次相連。通常可以將巨細胞病毒啟動子、attB位點、OC31整合酶基因編碼序列和多聚腺 嘌呤均置於pHSV-GFP的酶切位點。巨細胞病毒啟動子、attB位點、OC31整合酶基因編碼 序列和多聚腺嘌呤的插入應當不影響PHSV-GFP其餘元件的功能。例如，本發明的一個實施 例中，將巨細胞病毒啟動子、attB位點、Φ031整合酶基因編碼序列和多聚腺嘌呤插入XbaI酶切位點處。本發明還提供了上述載體系統的製備方法，包括以下步驟(l)attB位點和OC31整合酶克隆到pCMV載體，attB位點位於巨細胞病毒啟動子 和OC31整合酶基因編碼序列之間，獲得重組質粒pCMV-attb-C31 ；(2)以重組質粒pCMV-attb_C31為模版，進行PCR，獲得由CMV調控元件和OC31整 合酶基因及其多聚腺嘌呤元件構成的PCR產物CMV-attb-C31-pA;將CMV-attb-C31-pA克隆 到HSV擴增子載體pHSV-GFP，獲得雜合性HSV/OC31擴增子載體pHSV-GFP-CMV-attB_C31 ；(3)將 pHSV-GFP-CMV-attB-C31 質粒與 5 個無輔助病毒包裝粘粒 C0S6 Δ a、C0S14、 C0S28、C0S56和C0S48 Δ a混合，即形成如權利要求1所述的雜合性HSV/OC31擴增子載體 系統。其中，步驟WattB位點和C31整合酶編碼序列是用PCR方法或者人工合成方法 得到。步驟(1)中，也可以由attb序列插入CMV-C31質粒獲得重組CMV-attb_C31質粒。本發明的製備方法中，克隆序列可以採用PCR，人工合成，酶切等方法實現，拼接序 列則可能採用酶切、退火、連接粘性末端等方法實現。本發明的製備方法(1)中，可以首先將attb序列插入CMV-C31質粒獲得重組 CMV-Attb-C31質粒，然後用PCR方法或者人工合成方法得到Attb_C31整合酶編碼序列。例如，合成帶有KpnI/spel酶切點的attB寡核甘酸序列5-ATAATCGGTACCGGGTGCC AGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCCATACTAGTTT~3(SEQID NO 2)，在該序列中，下劃線 為attb核心序列(44鹼基)，兩端為KpnI/spel酶切點和保護性鹼基。該attB寡核甘酸序列 經退火酶切回收後克隆到CMVC31質粒，得到重組CMV-attb-C31質粒.CMV C31質粒來自美 國 Stanford University 的Michele P. Calos 教授，文章出自"A phage integrase directs efficient site-specificintegration in human cells, PNAS,2000,97,5995-6000，，。步驟(3)中，混合比例按照常規進行。通常5個無輔助病毒包裝粘粒用量大體相 同，pHSV-GFP-CMV-attB-C31質粒的摩爾數稍多。pHSV-GFP-CMV-attB_C31質粒的摩爾數 與5個無輔助病毒包裝粘粒摩爾數量之比可以是2-4 5。例如，各質粒的混合比例可以為 2:1:1:1:1:1 或者 3:2:2:2:2:2。本發明的位點特異性整合雜合性HSV/OC31擴增子載體系統，可用於將目標基因 導入宿主，並長期穩定表達。例如，應用於基因治療或者目標基因的研究。本發明所適用宿主包括各種真核生物。本發明中，新型雜合性HSV/c5C31擴增子 載體系統應用的宿主細胞可以是靜止細胞或者分裂細胞。其中，靜止細胞可以是神經元細 胞、膠質細胞或者成體幹細胞和胚胎幹細胞。本發明中，靜止期細胞也可以是原代細胞。本發明的雜合性HSV/c5C31擴增子載體病毒，其製備及應用方法具體如下①構建雜合性HSV/ Φ C31擴增子載體(pHSV-GFP-CMV-attB_C31)。首先，人工 合成OC31整合酶識別位點attB序列(上海英俊公司合成)，擴增質粒PCMV-C31 (美國 史丹福大學Calos教授惠贈)，attB序列和質粒pCMV_C31經同一酶切後，連接，轉化，克 隆序列分析，獲得重組質粒pCMV-attb-C31。以重組質粒為模板，設計引物進行PCR，獲得 CMV調控元件和OC31整合酶基因及其polyA(pA)元件的PCR產物(CMV-attb_C31-pA)， 並經酶切回收克隆於攜帶有編碼綠色螢光蛋白基因(GFP)的HSV擴增子載體(pHSV-GFP)(由 _ Bl Flim _ ； 貝曾 flimicbm. uam. es, Aboody-Guterman, K. S. et al。 「 Green fluorescent protein as a reporter for retrovirus and helper virus-freeHSV-1 ampIicon vector-mediated gene transfer into neural cells in culture and in vivo" Neuroreport 1997,8 :3801_3808)，克隆經序列分析，獲得雜合性HSV/OC31擴增子 載體 pHSV-GFP-CMV-attB-C31.②「無輔助病毒包裝系統由攜帶有HSV全基因5個粘粒C0S6 Δ a，C0S14, C0S28, C0S56, C0S48Aa 構成(由美國 Fraefel 教授惠贈，Fraefel, C, et al. Helpervirus-free transfer of herpes simplex virus typel plasmid vectors intoneural cells. J.Virol. 1996,70 7190-7197) 產毒細胞為非洲綠腎細胞(Vero) 2-2 細胞，由 Rozanne Sandri-Goldin(University of California, Irvine, CA)提供.③「將雜合性HSV/ Φ C31擴增子載體(pHSV-GFP-CMV-attB_C31)和5個粘粒 C0S6 Δ a, C0S14, C0S28, C0S56, C0S48 Δ a 共轉染 VERO 2-2 細胞(Smith, I etal. Evidence that the herpes simplex virusi mmediate early protein ICP27actspost-transcrip tionally during infection to regulate geneexpression. Virology, 1992,186 :74_86)。 雜合性HSV/C31擴增子載體pHSV-GFP-CMV-attB-C31和5個粘粒轉染質量比可以為 2:1:1:1:1: 1 ；如在 4X105VER02-2 細胞/60CM 培養皿，pHSV-GFP-CMV-attB-C31 和每個粘粒所需轉染質量分別可以是Iug和0. 5ug。共轉染方法可以通過脂質體，磷酸鈣， PEI等。以一般HSV擴增子載體(pHSV-GFP)做對照，並按上述方法製備病毒。④「在上述DNA加入2-2細胞無血清培養基上37°C培養5小時後，再加入2%胎牛 血清，培養2-3天後，將細胞和上清液收集，反覆凍融3次，1500rpm離心5分，收穫病毒上 清。⑤將收穫病毒上清IOul感染2X104人胚腎293細胞或大鼠神經元細胞(96孔板)。 感染2天，4天，6天和8天後，螢光顯微鏡觀察和流式細胞術檢測，分析感染效率。一般 HSV擴增子病毒載體(pHSV-GFP)感染293細胞後，由於不能整合在基因組上，因而，隨著細 胞傳代，表達綠色螢光蛋白陽性細胞比例逐漸減少。而新型雜合性HSV/c5C31擴增子載體 (pHSV-GFP-CMV-attB-C31)在感染人胚胎腎細胞293後，C31整合酶表達可介導攜帶GFP基 因整合在基因組中，因而，隨著細胞傳代，外源基因能長期表達。結果顯示，新型雜合性HSV/OC31擴增子載體(pHSV-GFP-CMV-attB_C31)在感染 人胚胎腎293細胞2天後，即可觀察到GFP表達，流式細胞術檢測顯示在感染2天，4天，6 天和8天後，表達綠色螢光蛋白陽性細胞比例分別為35 %，36. 8 %，36. 9 %，37. 6 %，顯示出 隨著細胞傳代，表達綠色螢光蛋白陽性細胞比例並未改變。而對照pHSV-GFP在感染人胚胎 腎293細胞2天後，同樣可觀察到GFP表達，但流式細胞術檢測顯示在感染2天，4天，6天 和8天後，表達綠色螢光蛋白陽性細胞比例分別為28. 1%,21%,13.9%,9.6%0該結果提 示新型雜合性HSV/C31擴增子載體(pHSV-GFP-CMV-attB-C31)具有長期穩定表達特性。另外，上述病毒感染神經元細胞後，也觀察到表達GFP陽性細胞，但兩者並不隨著 時間延伸陽性細胞數而減少，其原因為大鼠神經元細胞屬於非分裂細胞，而人胚胎腎293 細胞屬於分裂細胞，隨著細胞傳代，整合的病毒並不會丟失如新型雜合性HSV/c5C31擴增 子載體，而非整合病毒將隨細胞分裂而會丟失如一般HSV擴增子載體。為了檢測新型雜合性HSV/ Φ C31 擴增子載體(pHSV-CMV-attb_C31-UB-EGFP)長期穩定表達是否與C31整合酶介導的位點特異性整合有關，本發明將從上述病毒感 染8天細胞中抽提基因組DNA，基因組DNA抽提試劑盒由碧雲天生產，產品貨號D0061。 研究證明OC31整合酶在哺乳細胞上介導位點特異性整合，主要整合在哺乳細胞基因 組假 attP 位點 A 點上(psA site, NCBI sequence ID AF333429) (Thyagarajan B, et al.Site-Specific Genomic Integrationin Mammalian Cells Mediated by PhageC31 Integrase.MOLECULARAND CELLULAR BIOLOGY,2001,21.3926-3934).引物 psaF : 5，-GATATGGGAGGCCACAGTTG-3' ； OC31R 5' -ATGCCCGACGAACCTGAACCGGC-3，。PCR 反應參數 為95°C變性 5min 後 30 個循環，94°C 45s, 55°C 40s, 72°C 50s，最後一循環再 72°C IOmin0 PCR產物進行測序並進行生物信息學分析。結果顯示，新型雜合性HSV/c5C31擴增子載體病毒感染293系細胞，能擴增出 287bp的條帶。生物信息學分析顯示該序列包括宿主基因組假attP位點序列、attB序列和 C31序列的一部分。說明新型雜合性HSV/ΦC31擴增子載體病毒感染細胞後特異整合在假 attP位點上，從而導致外源基因長期表達。本發明的位點特異整合性雜合性HSV/c5C31擴增子載體系統，不僅在哺乳動物細 胞中證實了該載體系統具有感染神經元細胞、膠質細胞、巨噬細胞、肝細胞、心肌細胞和各 種幹細胞等在內的多種非分裂或靜止期細胞能力，而且，病毒載體攜帶的轉基因在OC31 整合酶介導下可穩定整合在基因組假attP位點上；但由於Φ031整合酶基因整合使其失去 LTR的調控作用而失活，因而，可避免Φ031整合酶過表達對細胞的毒性。本發明的位點特 異整合性雜合性HSV/c5C31擴增子載體系統感染細胞後進行整合分析，其結果顯示本發明 的位點特異整合性慢病毒載體可插入在基因組假attP位點上。本發明對現有HSV擴增子載體系統進行了遺傳改造，獲得了位點特異整合性雜合 性HSV/c5C31擴增子載體。經該病毒載體攜帶的轉基因可穩定整合在宿主基因組特定位點 上，克服了 HSV擴增子載體系統不能整合導致外源基因不能長期表達的不足。本發明一方 面可用於鑑定外源基因的功能，尤其是在原代細胞等非分裂細胞中的作用；另一方面本發 明為抑制腫瘤和抗病毒等領域的基因治療提供了新的更安全更高效的途徑。


圖1. HSV擴增子載體結構示意圖。圖2. PCR方法進行基因整合檢測結果圖。M為DNA分子量標準；1，為新型雜合性 HSV/OC31擴增子載體感染人胚胎腎293細胞8天後，抽提基因組DNA，PCR產物凝膠電泳 圖，顯示大約290bp陽性電泳條帶；2，為一般HSV擴增子載體感染人胚胎腎293細胞8天 後，抽提基因組DNA，PCR產物凝膠電泳圖，未顯示陽性電泳條帶；3，為陰性對照。圖3.新型雜合性HSV/OC31擴增子載體結構示意圖。圖4.新型雜合性HSV/c5C31擴增子載體感染人胚腎293細胞結果圖。為了便於 紙質文本列印，將圖片進行去色，那麼綠色螢光處顯示為高亮白色處即為感染成功的細胞。圖5新型雜合性HSV/OC31擴增子載體感染大鼠神經元細胞結果圖。圖6為圖5同一視野的黑白圖。高亮白色處即綠色螢光處。為了便於紙質文本打 印清晰，將綠色螢光暗場圖片進行去色，那麼綠色螢光處顯示為高亮白色處即為感染成功 的細胞。
圖7.HSV/OC31擴增子載體系統設計策略示意圖。首先，合成OC31整合酶識 別位點attB序列，並將該位點序列克隆於巨細胞病毒啟動子(CMV)調控的編碼Φ031整 合酶的質粒PCMV-C31 (美國史丹福大學Calos教授惠贈)，克隆位點位於CMV與其調控編 碼(DC31整合酶之間，獲得重組質粒pCMV-attb-C31。然後，以pCMV-attb_C31為模板，設 計引物進行PCR，獲得CMV調控元件和OC31整合酶基因及其polyA(pA)元件的PCR產物 (CMV-attb-C31-pA)，並經酶切回收克隆於攜帶有編碼綠色螢光蛋白基因(GFP)的HSV擴增 子載體(PHSV-GFP)，最後，獲得雜合性HSV/OC31擴增子載體pHSV-GFP-CMV-attB_C31。
具體實施例方式實施例1新型雜合性HSV/OC31擴增子載體製備方法人工合成Φ C31整合酶識別位點的寡核甘酸核心序列attB (44bp)，退火併經 KpnI/Spel酶切後克隆於質粒pCMV_C31，獲得重組質粒pCMV_attb_C31。以重組質粒為模 板，設計引物進行PCR，獲得由CMV調控元件和OC31整合酶基因及其polyA (pA)元件的 PCR產物(CMV-attb-C31-pA)，並經XbaI酶切回收克隆於攜帶有編碼綠色螢光蛋白基因 (GFP)的HSV擴增子載體(pHSV-GFP)，克隆經序列分析，最終獲得雜合性HSV/C31擴增子載 體 pHSV-GFP-CMV-attB-C31.實施例2新型雜合性HSV/c5C31擴增子載體病毒的製備將雜合性HSV/OC31擴增子載體或一般HSV擴增子載體分別與5個粘粒C0S6 Δ a, C0S14，C0S28，C0S56，C0S48Aa 以 2 1 1 1 1 1 質量比例混合。利用脂質體 LipofectamineTM在VERO 2-2細胞上進行轉染。在轉染5小時後，再加入2%胎牛血清，培 養2-3天後，將細胞和上清液收集，反覆凍融3次，1500rpm離心5分，收穫病毒上清。實施例3新型雜合性HSV/c5C31擴增子載體病毒系統感染細胞分析將上述IOul雜合性HSV/OC31擴增子載體病毒感染96孔板上293細胞系.在感 染人胚胎腎293細胞2天後，即可觀察到GFP表達，流式細胞術檢測顯示在感染2天，4天， 6天和8天後，表達綠色螢光蛋白陽性細胞比例分別為35 %，36. 8 %，36. 9 %，37. 6 %，顯示 出隨著細胞傳代，表達綠色螢光蛋白陽性細胞比例並未改變。而對照PHSV-GFP在感染人胚 胎腎293細胞後，同樣可觀察到GFP表達，但流式細胞術檢測顯示在感染2天，4天，6天和8 天后，表達綠色螢光蛋白陽性細胞比例逐漸減少。該結果提示新型雜合性HSV/c5C31擴增 子載體(pHSV-GFP-CMV-attB-C31)具有長期穩定表達特性。實施例4新型雜合性HSV/c5C31擴增子載體病毒感染細胞後位點特異整合分析抽提上述被感染細胞基因組DNA，用PCR和序列分析方法鑑定是否病毒基因組 位點特異整合假 attP 位點，引物 psaF :5，-GATATGGGAGGCCACAGTTG-3，(SEQ ID NO 3)； OC31R 5' -GCCTTGTCTTCGTTGGCGCTACGCT-3' (SEQ ID NO 4)。結果顯示，新型雜合性 HSV/ OC31擴增子載體病毒感染293系細胞，能擴增出227bp的條帶。序列分析見SEQ ID N01, 其中包括宿主基因組假attP位點序列(見SEQ ID NO 5中ntl_97)、attB序列(見SEQ ID NO 5中nt98-127)和部分OC31序列(見SEQ ID NO 5中自ntl28以後序列)。這說明新 型雜合性HSV/c5C31擴增子載體病毒感染細胞後特異整合在假attP位點上。
gatatgggag gccacagttg agatgccttc caatcagagg cttggtgaga ttccaagagg 60
tggtttcaaa tacagcaata gtacttgggt ttccctt^gg ctccccgggc. gcgtactcca 120
180
tactagt atg acacaagggg ttgtgaccgg ggtggacacg tacgcgggtg cttacgaccgtcaRtcRcgc gaRCRCRaRa attcRaRcgc agcaaRccca gcgacac 227
加框標出為宿主基因組假attP位點序列ntl-97，波浪線標出為attB序列(nt98-127)，下劃線為部分OC31序列。
序列表
1
34
DNA
人工合成
1
gtgccagggc gtgcccttgg gctccccggg cgcg 34
2
64
DNA
人工合成
2
ataatcggta ccgggtgcca gggcgtgccc ttgggctccc cgggcgcgta ctccatacta 60
gttt 64
3
20
DNA
人工合成
3
gatatgggag gccacagttg 20
4
25
DNA
人工合成
4
gccttgtctt cgttggcgct acgct 25
5
227
DNA
人工合成
5
gatatgggag gccacagttg agatgccttc caatcagagg cttggtgaga ttccaagagg 60
tggtttcaaa tacagcaata gtacttgggt ttcccttggg ctccccgggc gcgtactcca 120
tactagtatg acacaagggg ttgtgaccgg ggtggacacg tacgcgggtg cttacgaccg 180tcagtcgcgc gagcgcgaga attcgagcgc agcaagccca gcgacac22權利要求
1.一種雜合性HSV/C5C31擴增子載體系統，其特徵在於，該載體系統包含雜合性HSV/ OC31擴增子載體及5個無輔助病毒包裝粘粒C0S6Aa、C0S14、C0S28、C0S56和C0S48 Δ a ； 雜合性HSV/OC31擴增子載體質粒由HSV擴增子載體pHSV-GFP、巨細胞病毒啟動子、attB 位點、OC31整合酶基因編碼序列和多聚腺嘌呤組成，attB位點位於巨細胞病毒啟動子和 OC31整合酶基因編碼序列之間。
2.如權利要求1所述的載體系統，其特徵在於，attB位點和Φ031整合酶基因編碼序 列依次相連。
3.如權利要求1所述的載體系統，其特徵在於，巨細胞病毒啟動子、attB位點、Φ031 整合酶基因編碼序列和多聚腺嘌呤均位於pHSV-GFP的酶切位點。
4.如權利要求1所述的載體系統，其特徵在於，巨細胞病毒啟動子、attB位點、Φ031 整合酶基因編碼序列和多聚腺嘌呤依次相連。
5.如權利要求1所述的載體系統的製備方法，其特徵在於，該製備方法包括以下步驟(1)attB位點和OC31整合酶克隆到pCMV載體，attB位點位於巨細胞病毒啟動子和 OC31整合酶基因編碼序列之間，獲得重組質粒pCMV-attb-C31 ；(2)以重組質粒pCMV-attb-C31為模版，進行PCR，獲得由CMV調控元件和OC31整合 酶基因及其多聚腺嘌呤元件構成的PCR產物CMV-attb-C31-pA ；將CMV_attb-C31-pA克隆 到HSV擴增子載體pHSV-GFP，獲得雜合性HSV/OC31擴增子載體pHSV-GFP-CMV-attB_C31 ；(3)將pHSV-GFP-CMV-attB-C31質粒與5個無輔助病毒包裝粘粒C0S6Aa、C0S14、 C0S28、C0S56和C0S48 Δ a混合，即形成如權利要求1所述的雜合性HSV/OC31擴增子載體 系統。
6.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)attB位點和C31整合酶編碼序 列是用PCR方法或者人工合成方法得到。
7.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)中，將attb序列插入CMV-C31 質粒獲得重組CMV-attb-C31質粒。
8.如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於，步驟(3)中，混合比例為 2:1:1:1:1:1 或者 3:2:2:2:2:2。
全文摘要
本發明屬於基因工程領域，涉及一種單純皰疹病毒(HSV)與phiC31整合酶(ΦC31)雜合擴增子載體系統及其製備方法。該載體系統包含雜合性HSV/ΦC31擴增子載體及5個無輔助病毒包裝粘粒COS6Δa、COS14、COS28、COS56和COS48Δa；雜合性HSV/ΦC31擴增子載體質粒由HSV擴增子載體pHSV-GFP、巨細胞病毒啟動子、attB位點、ΦC31整合酶基因編碼序列和多聚腺嘌呤組成，attB位點位於巨細胞病毒啟動子和ΦC31整合酶基因編碼序列之間。本發明的載體系統具備位點特異整合性的功能，能夠在多種宿主細胞中長期表達外源目的基因，可用於研究外源基因的功能或者基因治療。
文檔編號C12N15/64GK102002514SQ200910201360
公開日2011年4月6日 申請日期2009年12月17日 優先權日2009年12月17日
發明者孔垂瑾, 朱煥章 申請人:復旦大學