一種核酸適配體及其篩選方法、在檢測前列腺癌細胞株中的應用的製作方法

2023-07-24 17:20:46 1

一種核酸適配體及其篩選方法、在檢測前列腺癌細胞株中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種核酸適配體，其序列包含序列1、序列2、序列3中任意一條序列所示的DNA片段。本發明的核酸適配體還可以是各種同源性較高的類似序列或由本發明序列得到的衍生物。本發明還公開了該核酸適配體的篩選方法，先合成隨機單鏈DNA文庫和引物，再SELEX篩選，PCR擴增文庫，製備DNA單鏈文庫，最後經重複篩選、陰性篩選和多輪篩選得到核酸適配體。本發明的核酸適配體及其衍生物可在識別前列腺癌細胞株PC-3或者製備檢測前列腺癌的試劑盒、分子探針、靶向介質中應用，以及在設計和製備治療前列腺癌藥物中應用。本發明的核酸適配體具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性、無免疫原性、能夠化學合成、分子量小、穩定、易於保存和標記等優點。
【專利說明】一種核酸適配體及其篩選方法、在檢測前列腺癌細胞株中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種核酸適配體及其篩選和應用，尤其涉及一種可用於檢測前列腺癌細胞的核酸適配體及其篩選方法和應用。
【背景技術】[0002]前列腺癌(prostate cancer, PCa)是歐美國家男性最常見的惡性腫瘤之一,死亡率僅次於肺癌。近年來，隨著人口老齡化比例的上升和飲食結構的改變，我國PCa的發病率呈現明顯的上升趨勢，國內研究報告顯示上海地區PCa發病率已躍居男性泌尿系腫瘤首位。由於前列腺癌起病隱匿，大多數前列腺癌得到確診時，已經是進展期或晚期，目前在臨床上對發展到此階段的前列腺癌採取內分泌治療，儘管內分泌治療起初對大部分病人有效，但無法完全抑制癌細胞，病人會最終進展為激素非依賴型前列腺癌(hormone-refractory prostate cancer,HRPC),並且癌細胞發生轉移。但是臨床發現早期局限性前列腺癌手術根治效果好，國外文獻報導5年生存率為99 %，10年生存率為95 %。因此，如果可以早期準確評估前列腺癌是否發生轉移及侵襲，轉移的部位和大小，侵襲的範圍和程度，對於臨床醫生合理選擇手術及治療方案有著重大的意義。轉移性HRPC治療非常棘手，成為前列腺癌的主要死因。目前就前列腺癌晚期患者而言，治療手段有限，效果較差，其原因在於藥物用量高，毒副作用大，而解決辦法除了開發新的藥物外，靶向治療成為了最主要的方法。此外，對於前列腺癌根治術後生化復發的病人，目前缺乏有效的靶向診斷措施，難以判斷腫瘤復發的部位和位置，使臨床醫生選擇合理的治療方案非常困難。目前，缺乏高度特異性的靶向介質，是制約前列腺癌的靶向診斷和治療發展的瓶頸。
[0003]核酸適配體，是與抗體功能類似的單鏈寡核苷酸分子。可特異性識別包括金屬離子、有機小分子、多肽、蛋白質、細胞等多種靶標，其親和力與抗體相當甚至高於抗體。而且。適配體分子小，不攜帶遺傳信息，無免疫原型，化學性質穩定，合成方便且批次差異小等優點是抗體無法取代的。因此核酸適配體在生物檢測、疾病的診斷和靶向治療方面具有廣闊的前景。

【發明內容】

[0004]為了克服現有技術的不足，本發明要解決的技術問題是提供一種具有高度特異性、無免疫原性、分子量小、化學性質穩定、易於保存和標記的可用於檢測前列腺癌細胞株PC-3的核酸適配體及其衍生物，還相應提供所述核酸適配體的篩選方法和應用。
[0005]為了解決上述技術問題，一方面，本發明提供了一種核酸適配體，該核酸適配體的核苷酸序列包含以下序列1、序列2、序列3中任意一條序列所示的DNA片段:
[0006]序列1:
[0007]5，-ACGCTCGGATGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3』 ；[0008]序列2:
[0009]5』 -TGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3』 ；
[0010]序列3:
[0011 ] 5 』 -TGCCACTAAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3，。 [0012]作為對上述技術方案的改進，可選擇地，上述核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。
[0013]作為對上述技術方案的改進，可選擇地，前述核酸適配體的核苷酸序列上連接有螢光物質、放射性物質、治療性物質、生物素、地高辛、納米發光材料或酶標記。
[0014]以上不論是經部分取代或者經過修飾後的核苷酸序列，都具有原核酸適配體基本相同或類似的分子結構、理化性質和功能，都可用於檢測前列腺癌。
[0015]作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種:
[0016](I)與前述所有技術方案中所述核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60%以上(例如可將前述核酸適配體序列刪除或增加部分互補的核苷酸);
[0017](2)與前述所有技術方案中所述核酸適配體的核苷酸序列進行雜交的序列；
[0018](3)與前述所有技術方案中所述核酸適配體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。
[0019]作為一個總的技術構思，本發明還提供了一種核酸適配體衍生物，所述衍生物是前述所有技術方案中所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是前述所有技術方案中所述核酸適配體改造成的相應肽核酸。
[0020]以上不論是衍生出的核酸適配體還是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸適配體基本相同或類似的分子結構性質和功能，即都可用於檢測前列腺癌。
[0021]另一方面，本發明還提供了一種如前述核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟:
[0022]( I)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物:
[0023]隨機核酸文庫:
[0024]5-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，
[0025]5，引物:5，-Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，；
[0026]3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，；
[0027](2)核酸適配體篩選:將上述隨機核酸文庫與PC-3細胞株細胞孵育；孵育完成後，收集PC-3細胞株細胞；加熱變性分離結合在PC-3細胞株細胞的適配體，即為篩選所得的核酸適配體一級文庫；
[0028](3)陰性篩選:將步驟(2)所得到的一級文庫與非靶細胞孵育，孵育完成後收集細胞孵育後的上清，即排除掉非特異性結合的核酸序列，得到富集的與靶細胞特異性結合的適配體組文庫；
[0029](4)分別鑑定步驟(3)所得到的適配體組各條序列的選擇性、親和力，最終得到核酸適配體。
[0030]作為對上述技術方案的改進，可選擇地，本發明還提供了一種如前述核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟:
[0031](I)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物:
[0032]隨機核酸文庫:[0033]5』-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3』 ；
[0034]5，引物:5，-Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，；
[0035]3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，；
[0036](2)核酸適配體初級篩選:將上述隨機核酸文庫與PC-3細胞株細胞孵育；孵育完成後，收集PC-3細胞株細胞並洗滌；加熱變性分離結合在PC-3細胞株細胞的適配體，即為篩選所得的核酸適配體一級文庫；
[0037](3)PCR擴增一級文庫:將步驟(2)中篩選得到的一級文庫進行常規PCR擴增，得到擴增產物；
[0038](4)製備DNA單鏈文庫:用鏈黴親和素葡聚糖微球分離生物素標記步驟(3)所得到的擴增產物；然後利用洗脫液使雙鏈DNA變性解鏈，收集標記的DNA單鏈文庫；
[0039](5)反篩:將步驟(4)所得到的DNA單鏈文庫與非靶細胞孵育，孵育完成後收集細胞孵育後的上清，即排除掉非特異性結合的核酸序列，得到與靶細胞特異性結合的適配體組文庫；
[0040](6)正篩:將步驟(5)所得到含有特異性適體組文庫的上清與靶細胞孵育，洗脫結合在靶細胞表面的高親 和力適配體組，PCR擴增後得到富集的與靶細胞特異性結合的適配體組文庫；
[0041 ] (7)核酸適配體循環篩選:以所述步驟(6)所得的富集適配體組文庫取代步驟(3)所得到的擴增產物，並重複步驟(4)~(6)的篩選過程，直到得到的適配體組文庫的親和力選擇性不再上升；
[0042](8)克隆測序步驟(7)所得到的適配體組文庫，分別鑑定各條序列的選擇性、親和力，最終得到核酸適配體。
[0043]作為對上述技術方案的進一步改進，可選擇地，本發明還提供了一種核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟:
[0044](I)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物:
[0045]隨機核酸文庫:
[0046]5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，；
[0047]5』 引物:5』 -Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3』 ；
[0048]3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，；
[0049](2)核酸適配體初級篩選:將上述隨機核酸文庫與PC-3細胞株細胞孵育；孵育完成後，收集PC-3細胞株細胞並洗滌；加熱變性分離結合在PC-3細胞株細胞的適配體，即為篩選所得的核酸適配體一級文庫；
[0050](3)PCR擴增一級文庫:將步驟(2)中篩選得到的一級文庫進行常規PCR擴增，得到擴增產物；
[0051](4)製備DNA單鏈文庫:用鏈黴親和素葡聚糖微球分離生物素標記步驟(3)所得到的擴增產物；然後利用洗脫液使雙鏈DNA變性解鏈，收集標記的DNA單鏈文庫；
[0052](5)反篩:將步驟(4)所得到的DNA單鏈文庫與非靶細胞孵育，孵育完成後收集細胞孵育後的上清，即排除掉非特異性結合的核酸序列，得到與靶細胞特異性結合的適配體組文庫；
[0053](6)正篩:將步驟(5)所得到含有特異性適體組的上清與靶細胞孵育，洗脫結合在靶細胞表面的高親和力適體組；
[0054](7) PCR擴增適配體組文庫:將步驟(6)中篩選得到的適配體組文庫進行常規PCR擴增，得到擴增產物；
[0055](8)製備適配體組單鏈文庫:用鏈黴親和素葡聚糖微球分離生物素標記步驟(7)所得到的擴增產物；然後利用洗脫液使雙鏈DNA變性解鏈，收集標記的適配體組單鏈文庫；
[0056](9)核酸適配體循環篩選:用所述步驟(8 )所得的適配體組單鏈文庫替代步驟(4 )所得到的DNA單鏈文庫，並重複步驟(5)~(8)的篩選過程，直到得到的適配體組文庫的親和力選擇性不再上升；
[0057](10)克隆測序步驟(9)所得到的適配體組文庫，分別鑑定各條序列的選擇性、親和力，最終得到核酸適配體。
[0058]第三方面，本發明還提供了一種前述核酸適配體或者如核酸適配體衍生物在製備檢測前列腺癌試劑盒、分子探針或靶向介質中的應用。
[0059]第四方面，本發明還提供了一種前述核酸適配體或者核酸適配體衍生物在設計和製備治療前列腺癌藥物中的用途。
[0060]與現有技術相比，本發明的優點在於:本發明通過篩選得到的核酸適配體具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性；無免疫原性；能夠體外化學合成，分子量小，可以對不同部位進行修飾和取代，且序列穩定，易於保存；便於標記(不需要標記的二抗)等。採用本發明的核酸適配體進行前列腺癌細胞的檢測時，操作更為簡單、迅速，並且本發明核酸適配體的合成成本較抗體製備成本低，且周期短，重現性好。
[0061]本發明的可識別前列腺癌細胞株PC-3的核酸適配體均能特異性且高親和力的識別前列腺癌細胞株PC-3，且結合能力強。利用本發明的核酸適配體可從分子角度對腫瘤的危險性進行分層；其對腫瘤轉移灶的特異性識別、結合，對靶標的鑑定，可為轉移灶的診斷和治療提供很好的手段，這對於前列腺癌的早期檢測具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0062]圖1為本發明實施例篩選過程中適配體文庫的富集過程:峰形代表PC-3細胞與異硫氰酸螢光素(FITC)標記文庫和第I輪、5輪、10輪、15輪篩選產物結合的情況。
[0063]圖2為本發明實施例中序列2載阿黴素適配體對不同細胞系的抑制作用結果。
[0064]圖3為本發明實施例中序列2適配體與靶細胞及非靶細胞結合能力的流式檢測結
果O
[0065]圖4為本發明實施例中序列2適配體與靶細胞及部分非靶細胞結合能力的Confocal 圖像。
[0066]圖5為本發明實施例中序列2和序列3適配體與靶細胞結合的擬合曲線及解離常數(Kd)。
[0067]圖6為本發明實施例中序列2適配體與前列腺增生組織(BPH)、前列腺癌染色螢光強度差異比較。
【具體實施方式】
[0068]以下的實施例便於更好的理解本發明，但並不限定於本發明。以下實施例中的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下屬實施例中所用的實驗材料如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買所得到的。
[0069]細胞來源:本實驗所用所有細胞均來自中科院上海細胞庫和協和醫學院細胞庫。
[0070]本發明利用核酸適配體的體外篩選技術SELEX技術，以前列腺癌細胞株PC-3為正篩靶標，以多種正常細胞株或其他癌細胞株為反篩靶標，從體外合成的隨機寡聚DNA文庫中篩選出與所述前列腺癌細胞株PC-3特異結合的核酸適配體。
[0071]本發明中，所述的核酸適配體序列可選自天然存在或人工合成的序列，或任何其他來源的同樣的序列。
[0072]本發明中，所述的核酸適配體序列含有與所述特徵序列的核苷酸的全部都相同的序列。[0073]本發明中，可以對核酸適配體進行修飾或改造，得到所述核酸適配體的衍生物，所述核酸適配體的衍生物可為:
[0074]a)將所述核酸適配體刪除部分或增加部分互補的核苷酸，得到的與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物。
[0075]b)將所述核酸適配體進行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體衍生物。
[0076]c)將所述核酸適配體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體衍生物。
[0077]d)將核酸適配體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體的衍生物。
[0078]e)將上述核酸適配體連接上螢光物質、放射性物質、治療性物質、生物素、酶標記等物質後，得到的與所述核酸適配體具有相同功能的核酸適配體衍生物。
[0079]本發明所述序列的靶標在與正常前列腺組織不表達，而在癌組織中有較高表達。本發明實施例中的靶標是前列腺癌細胞株PC-3。
[0080]實施例1:前列腺癌細胞特異性核酸適配體的篩選
[0081]1.隨機核酸文庫的設計與合成
[0082]設計合成兩端包含20個核苷酸(引物)，中間包括45個核苷酸隨機序列的核酸序列文庫如下:
[0083]5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，。
[0084]2.Cell-SELEX篩選獲得核酸適配體
[0085]2.1孵育:用結合緩衝溶液(PBS，含0.45%的葡萄糖，5mM MgCl2,0.lmg/mL鯡魚精DNA)溶解上述的隨機核酸文庫，95°C恆溫振蕩5min，迅速放入冰中；然後與已經培養和預處理好的前列腺癌細胞株PC-3在冰上孵育I小時。
[0086]2.2解離:孵育完成後倒出孵育培養瓶內的液體，用洗滌緩衝液(PBS，含0.45%的葡萄糖，5mM MgCl2)洗滌孵育培養瓶中的細胞；用ImL無菌水刮取孵育培養瓶內細胞，置於EP管中沸水浴加熱lOmin，加熱變性分離結合在PC-3細胞表面的適配體；12000rmp離心取上清，即為篩選所得PC-3細胞的特異核酸適配體文庫。
[0087]3.進行PCR擴增文庫
[0088]取100 μ L篩選所得的PC-3細胞特異核酸適配體文庫進行常規PCR擴增，擴增引物為 5 ' Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG3 '，5 ' Bi0-GTCACCAGCACGTCCATGAG3 ';擴增條件為:94°C 3min,94°C 30sec,58.5°C 30sec，72°C 30sec，經合適循環輪數，72°C 3min ;第一輪篩選後需將全部所得的PC-3細胞特異核酸適體文庫預擴增10個循環，再進行本步驟的擴增，得到擴增產物，用生物素標記擴增產物。
[0089]4.製備DNA單鏈文庫
[0090]將鏈黴親和素葡聚糖微球60 μ L輸入帶有濾膜的200 μ L槍頭，製成微量洗脫柱，150 μ L PBS洗滌兩次，將步驟3中PCR擴增所得的雙鏈DNA完全加壓過柱，通過雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈黴親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面；PBS洗滌兩次，然後加入200mM NaOH溶液100 μ L解離雙鏈DNA，使標記FITC的單鏈隨洗脫液流出並收集完全；除鹽柱用IOmL無菌水洗滌後，加入鹼變性後收集得到的洗脫液，自然滴完。加入ImL無菌水，收集滴下的溶液，此即為DNA單鏈文庫。
[0091]5.反篩
[0092]將步驟4篩選得到的DNA單鏈文庫溶解、恆溫振蕩後與經預處理後的非靶細胞(如人肝癌細胞SMMC-7721)在冰上孵育I小時，孵育完成後收集細胞孵育後的上清，棄去與非靶細胞結合的核酸序列。
[0093]6.正篩
[0094]用步驟5所得到的上清液替代步驟2中的隨機核酸文庫，並重複步驟2、3、4的操作，得到PC-3細胞的特異 核酸適配體單鏈文庫。
[0095]7.多輪篩選
[0096]將步驟6所得到的特異核酸適配體單鏈文庫替代步驟4篩選得到的DNA單鏈文庫，繼續重複進行上述步驟5~6的操作過程，每次操作均以前一次操作中得到的與靶細胞特異結合的核酸序列為起始核酸文庫，直到得到的適配體組文庫的親和力選擇性不再上升。
[0097]所述篩選方法中，可每一輪篩選逐步增加篩選壓力，以增進篩選核酸適配體的富集程度。所述增加篩選壓力可以線性減少核酸序列文庫和靶細胞的孵育時間和相應的線性增加核酸序列文庫與非靶細胞的孵育時間。
[0098]8.分析和鑑定多次篩選後得到的核酸適配體
[0099]將所得產物經克隆測序分析，對測序結果整理分析後，最終可得到富集度高的三條序列，這三條序列即為上述本實施例的可用於檢測前列腺癌細胞株PC-3的核酸適配體。
[0100]序列1:
[0101]5， -ACGCTCGGATGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，
[0102]序列2:
[0103]5』 -TGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3』
[0104]序列3:
[0105]5』 -TGCCACTAAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3』
[0106]將得到的核酸適配體在5』端標記螢光分子製成分子探針，分別取0nM、lnM、2nM、4nM、8nM、16nM、32nM、64nM、128nM、256nM的分子探針溶液，與5X IO5個PC-3細胞進行冰上孵育20min，然後用洗滌緩衝液洗滌兩次，用流式細胞儀測定細胞表面的螢光強度。如細胞能結合螢光標記的核酸適配體，則以螢光強度對探針濃度作圖，用公式Y = BfflaxX/ (Kd+X)計算核酸適配體的平衡解離常數Kd。結果表明，核酸適配體的平衡解離常數均在納摩爾範圍內。
[0107]實施例2:檢測細胞特異性
[0108]共選擇了 12種細胞株進行特異性分析:其中前列腺癌細胞亞系三種，分別為PC-3、LNCap、DU-145、22RV-l ;永生化正常前列腺上皮細胞RWPE-1 ;肝癌細胞SMMC-7721 ;宮頸癌細胞HeLa，肺癌細胞A549、MCF-7 ;結腸癌亞細胞系LoVo ;白血病細胞Jurkat、K562。
[0109]每一種細胞株均進行以下步驟(1)和步驟(2)處理，重複三次。
[0110]1.通過細胞計數，分別取5X105個細胞分散於結合緩衝液中，然後加入標記的核酸適配體，終濃度0.25 μ Mo [0111]2.將細胞和核酸適配體的混合液在冰上孵育20分鐘，離心洗滌兩次後，利用流式細胞儀檢測核酸適配體和上述不同細胞株細胞的結合情況。將細胞與FITC標記的隨機文庫孵育後做流式細胞儀檢測，設定一螢光強度值大於95%的細胞螢光強度作為流式細胞儀背景螢光。以細胞與核酸適配體結合後螢光強度超過這一閾值的細胞百分數作為衡量核酸適配體與細胞結合能力的強弱(O:< 15%；+:15-30%；++: 85%)。
[0112]不同細胞株細胞與核酸適配體結合的流式細胞儀測定結果如圖3所示。不同細胞株細胞與核酸適配體結合結果見表1。
[0113]表1:序列2適配體對不同腫瘤細胞的親和力
[0114]
【權利要求】
1.一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包含以下序列1、序列2、序列3中任意一條序列所示的DNA片段: 序列1:
5』 -ACGCTCGGATGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3』 ； 序列2:
5，-TGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3，； 序列3:
5，-TGCCACTAAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3，。
2.如權利要求1所述的核酸適配體，其特徵在於:所述核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。
3.如權利要求1或2所述的核酸適配體，其特徵在於:所述核酸適配體的核苷酸序列上連接有螢光物質、放射性物質、治療性物質、生物素、地高辛、納米發光材料或酶標記。
4.一種核酸適配體，其特徵在於:所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種: (O與權利要求1或2或3中所 述核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)與權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列進行雜交的序列； (3)權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列轉錄的RNA序列。
5.一種核酸適配體衍生物，其特徵在於:所述衍生物是權利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是權利要求1或2或3中所述核酸適配體改造成的相應肽核酸。
6.一種如權利要求1所述的核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟: (1)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物: 隨機核酸文庫:
5-ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3』 ；
5』 引物:5』 -Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3』 ； 3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，； (2)核酸適配體篩選:將上述隨機核酸文庫與PC-3細胞株細胞孵育；孵育完成後，收集PC-3細胞株細胞；加熱變性分離結合在PC-3細胞株細胞的適配體，即為篩選所得的核酸適配體一級文庫； (3)陰性篩選:將步驟(2)所得到的一級文庫與非靶細胞孵育，孵育完成後收集細胞孵育後的上清，即排除掉非特異性結合的核酸序列，得到富集的與靶細胞特異性結合的適配體組文庫； (4)分別鑑定步驟(3)所得到的適配體組文庫各條序列的選擇性、親和力，最終得到核酸適配體。
7.—種如權利要求1所述的核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟: (I)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物: 隨機核酸文庫:
5』 -ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3』 ；5』 引物:5』 -Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3』 ； 3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，； (2)核酸適配體初級篩選:將上述隨機核酸文庫與PC-3細胞株細胞孵育；孵育完成後，收集PC-3細胞株細胞並洗滌；加熱變性分離結合在PC-3細胞株細胞的適配體，即為篩選所得的核酸適配體一級文庫； (3)PCR擴增一級文庫:將步驟(2)中篩選得到的一級文庫進行常規PCR擴增，得到擴增產物； (4)製備DNA單鏈文庫:用鏈黴親和素葡聚糖微球分離生物素標記步驟(3)所得到的擴增產物；然後利用洗脫液使雙鏈DNA變性解鏈，收集標記的DNA單鏈文庫； (5)反篩:將步驟(4)所得到的DNA單鏈文庫與非靶細胞孵育，孵育完成後收集細胞孵育後的上清，即排除掉非特異性結合的核酸序列，得到與靶細胞特異性結合的適配體組文庫； (6)正篩:將步驟(5)所得到含有特異性適體組文庫的上清與靶細胞孵育，洗脫結合在靶細胞表面的高親和力適配體組，PCR擴增後得到富集的與靶細胞特異性結合的適配體組文庫； (7)核酸適配體循環篩選:以所述步驟(6)所得的富集適配體組文庫取代步驟(3)所得到的擴增產物，並重複步驟(4)~(6)的篩選過程，直到得到的適配體組文庫的親和力選擇性不再上升； (8)克隆測序步驟(7)所得到的適配體組文庫，分別鑑定各條序列的選擇性、親和力，最終得到核酸適配體。
8.如權利要求1所述的篩選方法，其特徵在於: (1)合成以下序列所示的隨機單鏈DNA文庫和引物: 隨機核酸文庫:
5』 -ACGCTCGGATGCCACTACAG- (45N)-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3』 ；
5』 引物:5』 -Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3』 ； 3，引物:5，-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，； (2)核酸適配體初級篩選:將上述隨機核酸文庫與PC-3細胞株細胞孵育；孵育完成後，收集PC-3細胞株細胞並洗滌；加熱變性分離結合在PC-3細胞株細胞的適配體，即為篩選所得的核酸適配體一級文庫； (3)PCR擴增一級文庫:將步驟(2)中篩選得到的一級文庫進行常規PCR擴增，得到擴增產物； (4)製備DNA單鏈文庫:用鏈黴親和素葡聚糖微球分離生物素標記步驟(3)所得到的擴增產物；然後利用洗脫液使雙鏈DNA變性解鏈，收集標記的DNA單鏈文庫； (5)反篩:將步驟(4)所得到的DNA單鏈文庫與非靶細胞孵育，孵育完成後收集細胞孵育後的上清，即排除掉非特異性結合的核酸序列，得到與靶細胞特異性結合的適配體組文庫； (6)正篩:將步驟(5)所得到含有特異性適體組的上清與靶細胞孵育，洗脫結合在靶細胞表面的高親和力適體組； (7)PCR擴增適配體 組文庫:將步驟(6)中篩選得到的適配體組文庫進行常規PCR擴增，得到擴增產物； (8)製備適配體組單鏈文庫:用鏈黴親和素葡聚糖微球分離生物素標記步驟(7)所得到的擴增產物；然後利用洗脫液使雙鏈DNA變性解鏈，收集標記的適配體組單鏈文庫； (9)核酸適配體循環篩選:用所述步驟(8)所得的適配體組單鏈文庫替代步驟(4)所得到的DNA單鏈文庫，並重複步驟(5)~(8)的篩選過程，直到得到的適配體組文庫的親和力選擇性不再上升； (10)克隆測序步驟(9)所得到的適配體組文庫，分別鑑定各條序列的選擇性、親和力，最終得到核酸適配體。
9.一種如權利要求1~4中任一項所述的核酸適配體或者如權利要求5所述的核酸適配體衍生物在製備檢測前列腺癌的試劑盒、分子探針或靶向介質中的應用。
10.一種如權利要求1~4中任一項所述的核酸適配體或者如權利要求5所述的核酸適配體衍生物在設計和製備治療前列腺癌藥物中的用途。
【文檔編號】C12N15/10GK103642810SQ201310590626
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】高新, 上官棣華, 羅雲, 邴濤, 王元元 申請人:中山大學附屬第三醫院, 中國科學院化學研究所