一種重組牛腸激酶的生產方法
2023-07-24 22:29:16
專利名稱：一種重組牛腸激酶的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域。更具體地，本發明提供了一種高效生產重組牛腸激酶(Enterokinase or Enteropeptidase，EK)的生產方法，以及有關的工程細胞的構建、重組牛腸激酶的表達和純化工藝。
背景技術：
目前，在生物學領域，很多時候要求切割蛋白，把靶蛋白和運載蛋白切開，因此需要在靶蛋白和運載蛋白的連接區設計特異的蛋白酶解位點，已經有許多商業化載體在其多克隆位點前和編碼運載蛋白序列之間加入了蛋白酶解位點的序列。常見的蛋白酶主要有Xa因子、凝血酶、腸激酶(Enterokinase orEnteropeptidase)等等。但值得指出的是，實際操作中這些酶在很多時候不能夠實現完全切割。另外，蛋白酶的特異性也不是絕對的，如凝血酶的最佳切割位點有兩種，可見其在實際物系中發生非特異切割的可能性很大。
基於以上種種原因，在眾多備選的酶解方法中，腸激酶作為一種對(Asp)4-Lys序列表現出高度特異性的絲氨酸蛋白酶，因其反應條件相對比較寬鬆，在pH4.5-9.5、溫度4℃-45℃之間完全保有活性；有無變性劑也均不影響酶切作用。反應過程中底物蛋白質其他無關部位發生斷裂的可能性低，並且其切割位點在全部識別序列之後，切出的目標蛋白首位胺基酸可完全忠實於天然蛋白等特點，在基因工程製藥領域成為融合表達時下遊純化的首選工具酶之一。
腸激酶是脊椎動物十二指腸壁黏膜分泌的一種司職食物消化的蛋白酶，近年於微生物、血液、昆蟲、海星中也發現有類似物。牛的腸激酶由大小兩個亞基組成，其中小亞基具有酶活中心的基本特徵，因而被命名為催化亞基，由235個胺基酸組成，理論分子量26,262道爾頓，理論等電點(pI)5.1，其保有全酶的酶切活性與對底物的高度特異性，為牛腸激酶在基因工程製藥領域被廣泛研究與應用奠定了基礎。
國外對重組牛腸激酶催化亞基(EKL)的表達研究始於1993年，由美國GI公司LaVallie等在哺乳動物細胞COS中進行了功能性表達，隨後以人工合成的六肽底物Gly-(Asp)4-Lys-β-萘胺和天然底物胰蛋白酶原驗證了這種由705bp編碼的重組蛋白亞基保持著全酶的活性，拉開了以基因工程的方法生產重組牛腸激酶催化亞基(rEKL)的序幕。1995年Lisa在大腸桿菌中融合表達rEKL，並在目標蛋白編碼序列前引入腸激酶識別位點，融合蛋白經自催化切割釋放出活性rEKL。重組蛋白酶活與在COS中的報導基本一致，但產率增至1mg/125mg溼菌。相較於用提純的方法獲得的天然牛腸激酶全酶(EKn)，rEKL對天然底物胰蛋白原的活性要低幾十倍，而相反對人工底物如白介11融合蛋白的酶切活性比EKn要高出上百倍。
1996年Laura等首次嘗試應用酵母表達系統分泌表達rEKL，經離子交換與親和層析純化後，目標蛋白產量達6.3mg/L發酵液上清，其活性也明顯高於大腸桿菌和哺乳動物細胞表達系統。進而，該產品被應用於當時美國正在新藥研發階段的重組人白細胞介素11的下遊純化，取得了令人滿意的結果。隨後，研究小組所屬的Invitrogen公司將此重組酶製劑商品化，廣泛應用於基因工程製藥領域和其他以EK為識別位點的融合蛋白。
2000年南斯拉夫的一個科研小組成功地將EKL在絲狀真菌(filamentousfungus Aspergillus niger)進了高效分泌表達，活性蛋白收率1.9mg/L培養液上清。2001年韓國科學家Seong首次將組氨酸親和標記引入rEKL的3』端，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達並有效地分泌到培養基中。rEKL-(His)6產量為1mg/L發酵液上清，其活性與大腸桿菌表達系統持平。
國內目前對重組腸激酶的研究還很少，僅有的公開報導是2002年YUAN等運用Trx-EKL融合表達體系對腸激酶催化亞基進行了原核表達，純化後酶產量4.3mg/100mL發酵液，酶比活720U/mg蛋白。中國專利2004100148607採用畢赤氏酵母中表達了在末端添加了組氨酸標籤的重組黃牛腸激酶催化亞基，得率5mg/L。
因此目前重組牛腸激酶的生產存在工藝複雜，成本高，產物得率低，活性弱等問題。目前商品化的動物腸組織來源的腸激酶全酶活性不高，且常伴汙染性絲氨酸蛋白酶的出現。而且因進口酶製劑本身的高成本，使得採用此酶的融合表達一向被稱為是「一套昂貴的表達體系」。
隨著越來越多的基因工程產品採用融合表達策略，rEKL具有重要的市場利用價值，而且對進一步促進我國蛋白融合技術的發展與應用也具有極其重要的意義。
本發明提供了一種高效生產重組牛腸激酶的生產方法，採用新型畢赤酵母表達體系分泌表達牛腸激酶催化亞基，通過優化其基因序列，並優化發酵與純化工藝，獲得快速、簡便、穩定、活性高的一種牛腸激酶的生產方法。
發明內容
本發明的目的就是提供一種高效簡便的生產重組牛腸激酶的方法。
本發明的另一目的就是提供重組牛腸激酶的編碼序列和用於該方法的表達載體及工程細胞。
在本發明的第一方面，就是提供了一種編碼重組牛腸激酶的核苷酸序列，其特徵在於，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的胺基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區與SEQID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一優選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種表達載體，其特徵在於，所述的表達載體含有權利要求1所述的核苷酸序列。
在另一優選例中，所述的表達載體是pGAPZA/α-EKL。
在本發明的第三方面，提供了一種工程細胞，其特徵在於，它整合有權利要求3所述的表達載體。
在另一優選例中，所述的工程細胞是畢赤酵母。
在本發明的第四方面，提供了一種生產重組牛腸激酶的方法，該方法包括步驟a)在適合的表達條件下，培養如權利要求5所述的宿主細胞，從而分泌表達出重組牛腸激酶；b)分離純化分泌的重組牛腸激酶蛋白。
圖1是融合基因α-EKL的構建示意圖。
圖2是重組質粒pGAPZA/α-EKL構建示意圖。
具體實施例方式
本發明人通過深入而廣泛的研究，通過基因編碼序列的優化設計，在胞外構建了含有釀酒酵母α-因子前導肽序列的重組牛腸激酶融合蛋白基因，使其在畢赤酵母細胞內中高效分泌表達。在此基礎上完成了本發明。
根據重組牛腸激酶催化亞基天然胺基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改變胺基酸序列的條件下，全基因合成重組牛腸激酶催化亞基的目的基因序列，將該基因克隆到pUCl9中測序驗證後，用分子生物學方法，體外構建融合蛋白α-EKL的融合序列，然後克隆入表達載體pGAPZA。轉化、整合入P.pastoris宿主細胞染色體，通過施加不同濃度抗性，篩選抗性最強克隆，進而篩選出高表達工程細胞。搖瓶試驗表明，生長48小時後，表達水平5mg/L以上。
在獲得工程細胞後，便可在適合的條件下培養工程細胞。在本發明中，工程菌表達的重組牛腸激酶發酵條件沒有特別限制。可以採用本領域常規的發酵條件。例如，合適的培養基包括(但不限於)以下組成(i)氮源含有機氮源和無機氮源，其中有機氮源如蛋白腖、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無機氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(ii)無機鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩衝體系濃度20-200mM，pH5-8；Mg2+鹽0-5mM。
(iii)在培養基中添加維生素B1作為補充維生素，濃度1～1000PPM。
(iv)根據M9培養基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是單一碳源，也可以是混合碳源。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-3％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-1.5％。
為大規模獲得重組牛腸激酶，需要在發酵罐中進行優化培養。本發明研究了中試發酵工藝，優化後的表達水平達到30mg/L。
在發酵表達重組牛腸激酶後，對表達的rEKL進行分離。
通常，發酵樣品先以離心、過濾等方式獲得發酵液上清，去除菌體。發酵液上清可通過鹽析、超濾等方法進行初步純化後再進行層析純化，也可直接進行層析純化。
適用於本發明的層析技術包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
經過2-3步純化，可得到rEKL純品，純化得率40％以上，純度95％以上，純品得率約12mg/L發酵液。
純化後rEKL的酶活活性用融合蛋白底物法測定，經測定，其比活約為2.5×106IU/mg。
在本發明的一個實例中，提供了重組牛腸激酶融合蛋白基因的獲得及表達質粒的構建，優化後的基因使得表達重組牛腸激酶的表達量提高。
在本發明的另一個實例中，通過篩選獲得了高表達重組牛腸激酶的菌株，提高了重組牛腸激酶的表達量。
在本發明的另一個實例中，通過不同啟動子之間的比較，選擇合適的表達載體表達重組牛腸激酶蛋白。
在本發明的另一個實例中，經過發酵工藝的優化，進一步提高了重組牛腸激酶的表達量。
在本發明的另一個實例中，經過純化工藝優化，可得到純品12mg/L。
中試研究表明，產品製造工藝穩定，操作簡單，周期短，成本低，每升發酵液可獲得重組牛腸激酶純品12mg。適合產業化生產。
本發明的優點在於(1)優化了牛腸激酶催化亞基基因序列，並在該序列前導入了釀酒酵母α-因子前導肽序列，該融合蛋白基因非常適合在畢赤酵母中分泌表達，具有高表達、高穩定的特點。
(2)表達工藝簡單，表達載體含有不需要甲醇誘導的啟動子，能組成型的高效表達牛腸激酶，在發酵過程中無需更換培養基或添加誘導劑，簡化了操作工藝，比甲醇作為誘導劑的表達菌具有更高的安全性，有利於規模化生產。
(3)通過控制關鍵的發酵工藝條件，使表達水平進一步提高。
(4)純化工藝簡便，回收率高。由於是分泌蛋白，因此簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規模生產重組牛腸激酶成為可能。
(5)採用畢赤酵母為工程細胞，很好地保持了重組牛腸激酶的活性。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1 融合基因的獲得及表達質粒的構建根據牛腸激酶催化亞基的胺基酸序列，考慮畢赤酵母的密碼子偏愛性，全基因合成編碼重組牛腸激酶催化亞基的目的基因序列，將該基因序列克隆到pUC19中並測序驗證。融合蛋白α-EKL的構建見圖1，以含有rEKL編碼序列的質粒pUC19/rEKL為模板，通過PCR擴增得到可與釀酒酵母α-因子前導肽序列以正確的框架進行融合的EKL基因。同時，以含有釀酒酵母α-因子前導肽編碼序列的質粒pPIC9K(購自Invitrogen公司)為模板，PCR擴增得到α-因子前導肽序列。把純化後的上述兩種PCR產物分別用限制酶XhoI進行消化，對兩種酶切產物進行連接。以連接產物為模板進行PCR擴增，得到可用於分泌表達的融合基因α-EKL。
重組質粒構建線路如圖2所示，將人工合成的α-EKL基因用EcoRI進行酶切處理後，瓊脂糖凝膠電泳回收約1kb片段；同時將質粒pGAPZA(購自Invitrogen公司)用EcoRI進行酶切，回收大片段。將兩個片段用T4 DNA連接酶進行連接，連接產物轉化進入大腸桿菌DH5α(購自Promega公司)。小量製備質粒，通過酶切鑑定含α-EKL的陽性克隆。pGAPZA接入外源基因後可以將其多拷貝整合到宿主菌的染色體上進行高效表達，同時本身攜帶有一個Zeocin抗性基因，可以用於轉化子的篩選。載體pGAPZA多克隆位點前有組成性表達的GAP啟動子，不需誘導劑即可在宿主菌GS115中高效表達外源基因。
實施例2 高表達重組牛腸激酶工程菌株的篩選將構建好的重組質粒pGAPZA/α-EKL大量製備，線性化，電穿孔轉化宿主細胞P.pastorisGS115，塗布含有不同濃度抗生素Zeocin的YPDS平板篩選高抗的陽性克隆，並進行小搖表達實驗篩選得到重組牛腸激酶高表達的工程酵母菌株(含α-EKL)。
實施例3 選擇合適的表達載體在構建重組質粒pGAPZA/α-EKL時，我們同時構建了重組質粒pPIC9K/rEKL，通過與實施例2相似的過程，我們獲得了重組牛腸激酶高表達的工程酵母菌株(含rEKL)。將這兩個工程酵母菌株在表達環境、表達時間等一致的前提下的表達量做了一個比較，發現含α-EKL工程酵母菌株中牛腸激酶的表達量明顯高於含rEKL的工程酵母菌株。根據結果，我們選擇GAP作為表達腸激酶的首選啟動子。
實施例4 添加不同蛋白保護劑對表達水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級種子液中，培養17-20hr；按1∶10的比例二級接種於250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養4~8hr左右，上罐發酵，pH 5.0、溫度20℃、DO＞35％，待溶氧上升後流加50％甘油內含10％CA，或10％Peptone或10％Tryptone的培養液，36hr後取樣。樣品檢測SDS-PAGE和蛋白含量以確定誘導階段的最佳蛋白保護劑。
實施例5 重組腸激酶純化對發酵液進行超濾濃縮，將發酵液的緩衝體系替換為磷酸鹽溶液PB。超濾濃縮及更換緩衝液使用Millipore超濾器，超濾膜截流分子量為10KD，超濾時留取濃縮液(作用是去除小分子雜質和鹽類)。發酵液上清超濾至體積剩下500ml左右，加入PB，繼續超濾；反覆此程序，直至樣品的電導水平和PB緩衝液的電導水平接近。
層析1(陰離子交換層析)層析介質Q Sepharose FF緩衝液溶液APB溶液BPB+1M NaCl上樣將超濾濃縮的hK5溶液上樣。
清洗上樣後用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗後用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集EKL樣品峰。
層析2(疏水層析)層析介質phenyl Sepharose FF緩衝液溶液APB+1M NaCl溶液BPB上樣將層析1的樣品峰上樣。
清洗上樣後用6CV的溶液A清洗層析柱。
梯度清洗後用10CV將溶液B從0％升至100％。
收集收集EKL樣品峰。
層析3(分子篩層析)層析介質Sephadex 75緩衝液PB上樣層析1收集的樣品主分。
樣品經過此三步純化，即陰離子交換層析、疏水層析、分子篩層析以後，純度提高至95％以上，可得蛋白純品12mg/L。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表110上海新生源醫藥研究有限公司120一種重組牛腸激酶的生產方法16022101211705212DNA213人工序列221misc_feature222(1)…(705)223優化的重組牛腸激酶序列4001attgtcggag gaagtgactc cagagaagga gcctggcctt gggtcgttgc tctgtatttc 60gacgatcaac aggtctgcgg agcttctctg gtgagcaggg attggctggt gtcggccgcc 120cactgcgtgt acgggagaaa tatggagccg tctaagtgga aagcagtgct aggcctgcat 180atggcatcaa atctgacttc tcctcagata gaaactaggt tgattgacca aattgtcata 240aacccacact acaataaacg gagaaagaac aatgacattg ccatgatgca tcttgaaatg 300aaagtgaact acacagatta tatacagcct atttgtttac cagaagaaaa tcaagttttt 360cccccaggaa gaatttgttc tattgctggc tggggggcac ttatatatca aggttctact 420gcagacgtac tgcaagaagc tgacgttccc cttctatcaa atgagaaatg tcaacaacag 480atgccagaat ataacattac ggaaaatatg gtgtgtgcag gctatgaagc aggaggggta 540gattcttgtc agggggattc aggcggacca ctcatgtgcc aagaaaacaa cagatggctc 600ctggctggcg tgacgtcatt tggatatcaa tgtgcactgc ctaatcgccc aggggtgtat 660gcccgggtcc caaggttcac agagtggata caaagttttc tacat 705
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1.一種編碼牛腸激酶催化亞基蛋白的核苷酸序列，其特徵在於，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的胺基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.一種表達載體，其特徵在於，它含有權利要求1所述的核苷酸序列。
3.如權利要求2所述的表達載體，其特徵在於，它是含有GAP啟動子。
4.一種工程細胞，其特徵在於，它整合有權利要求3所述的表達載體。
5.如權利要求4所述的工程細胞，其特徵在於，它是畢赤酵母。
6.一種牛腸激酶的生產方法，其特徵在於，該方法包括步驟(a)在適合的表達條件下，培養如權利要求5所述的工程細胞，從而分泌表達出牛腸激酶蛋白；(b)分離純化出表達的牛腸激酶蛋白。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟(a)所示的表達條件為誘導時間為12-120小時，較佳的為24-100小時；誘導pH為3-9，較佳的為5-7。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟(b)所示的表達條件為(1).發酵液通過簡單離心或超濾獲得含有目的蛋白的上清液；(2).通過簡單的離子交換層析、疏水層析等簡單步驟，即可獲得純度在95％以上的純品。
全文摘要
本發明提供了一種重組牛腸激酶的核苷酸序列，高效生產重組牛腸激酶的生產方法，以及有關的表達載體與工程細胞構建、表達和純化的工藝。優化後的重組牛腸激酶蛋白基因非常適合在畢赤酵母中組成型分泌表達，同時通過發酵與純化工藝優化，提高了表達量和純化得率，具有表達高、穩定性好、活性高、生產工藝簡便的優點。本發明可高效、簡便、低成本的獲得重組牛腸激酶純品。
文檔編號C12N9/64GK1869236SQ20051002613
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月24日 優先權日2005年5月24日
發明者孫九如, 任軍, 黃陽濱, 杜碧金, 沈麗麗 申請人:上海新生源醫藥研究有限公司