微生物菌劑的製備方法及其應用與流程

2023-07-24 19:32:32

本發明涉及微生物肥料領域，尤其涉及一種微生物菌劑的製備方法及其應用。
背景技術：
：花卉栽培肥料是花卉養料的來源，施肥的合理與否直接影響待花卉的生成，關係到花卉的產量和質量。植物在生長發育需要的元素比較多，主要成分為氮，磷，鉀，氮，磷，鉀單純靠培養土供給是不夠的，因此，需要通過施肥來補充。現有的肥料分為有機肥料，無機肥料與微生物肥料，有機肥料又髒又臭，對於花卉的養殖者來說難以接受，無機肥料雖然清潔衛生，但是長期使用容易造成土壤板結。微生物肥料提供的是能固氮、解磷、解鉀等有益微生物，這些活的微生物不僅能固氮、解磷、解鉀，而且分泌有利於植物生長的多種激素，多糖等物質，改良土壤結構，改善花卉產品品質和提高花卉的防病、抗病能力，從而實現花卉植株最佳的觀賞價值。現市售的微生物肥料的類型多種多樣，價格也參差不齊，微生物肥料通過多種微生物菌株混合而成，如中國發明專利(申請公布號cn105567604a申請公布日2016.05.11)公開了一種複合微生物菌劑及其製備方法，其中微生物菌劑是由經過發酵的真菌菌劑和經過發酵的細菌菌劑按照菌數比35～85:15～65的比例混合後形成。該發明的微生物菌劑採用細菌與真菌的混合菌劑，可用於汙水處理系統以及石油汙染突然生物修復中，但是該發明中的微生物菌劑不適用於花卉作物的養植。如中國發明專利(授權公告號cn103332989b，授權公告日2015.07.22)公開了一種利用微生物有益菌種製備溫室花卉專用肥料的方法，其中採用的微生物有益菌種均為購買的固氮菌，解磷菌以及蠟狀芽孢桿菌以及自製的固體微生物，其中固體微生物的製備方法是:將熟化以後的植物澱粉放在山上的陰涼處，並用植物的幹葉將其蓋住，進而採取各種微生物生命體的組合，放置10天後將其取回。採用這種方法採集到的微生物的種類非常複雜，無法進行鑑別微生物的具體種屬，而且這種方式得到的微生物中非常容易感染有害微生物，一旦將這種感染有害微生物的菌劑使用在花卉或作物中時，會造成死苗的嚴重後果。技術實現要素：本發明的目的就是針對以上技術的不足，提供一種微生物菌劑的製備方法及其應用。該方法製得的微生物菌劑中菌株種屬可鑑定、菌株的品種較為單一、製備微生物菌劑的操作簡單且能顯著促進植物生長。為實現上述目的，本發明所設計的一種微生物菌劑的製備方法包括以下步驟：1)材料的選擇：取自長白山原始森林的土壤；2)稀釋塗布：取土壤m克，將m克的土壤用滅菌水稀釋10倍後混勻，採用梯度稀釋分離法製備10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤懸浮液，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤懸浮液各取0.2ml分別塗布於5塊固體培養基平板上，將塗有不同濃度土壤懸浮液的5塊固體培養基平板置於18℃的恆溫箱中培養2～3天，培養後從5塊固體培養基平板中挑選出一塊單菌落較多的平板作為統計平板；所述固體培養基的配方為：10g/l胰蛋白粉、5g/l酵母提取物、10g/l氯化鈉、15g/l瓊脂、5g/l葡萄糖；3)統計：根據統計平板中菌落的形態特徵對統計平板中的菌落進行歸類並統計數量；4)優勢菌株的確定：根據步驟3)的結果確定3株優勢菌株，採用平板劃線法進一步純化3株優勢菌株；5)優勢菌株的鑑定：將純化後的3株優勢菌株分別接種到lb固體培養基上，18℃培養，觀察菌落的形態特徵並採用革蘭氏染色法對細菌的類別進行的判斷，然後利用pcr技術擴增16srdna鑑定菌株的種屬，具體的過程為：挑取單菌落溶於100ul超純水中，在沸水中煮10min裂解菌體，吸取1ul裂解後的菌液作為pcr反應的模板，擴增16srdna基因，將擴增的16srdna基因序列與genebank中16srdna的資料庫進行同源性比對，確定3株優勢菌株的種屬；pcr技術擴增中的引物採用通用引物對27f-1492r；引物對27f-1492r的序列為：5』-agagtttgatcctggctcag-3』與5』-ggttaccttgttacgactt-3』。pcr的反應體系為：10×pcrbuffer5μl、dntp5μl、mg2+2μl、10μm引物對27f-1492r各1μl、koddnapolymease1μl、模板1ul，用超純水定容至50μl；其中，koddnapolymease(高保真性pcr酶)購自東洋紡生物科技有限公司，10×pcrbuffer、dntp、mg2+、引物對27f-1492r均購自takara公司。pcr反應程序為95℃5min；95℃1min、52℃30s、68℃2min，30個循環；68℃10min，15℃10min；(pcr儀購自bio-bad公司)6)優勢菌株的保存：將3株優勢菌株分別接種於5mllb液體培養基中培養，待od600達到1.8～2.2時，取0.5ml菌液與0.5ml質量百分比為40％的滅菌甘油混合均勻，液氮預凍，-80℃保存待用；7)微生物菌劑的製備：從液氮中取出3株優勢菌株，分別接種在3瓶50mllb液體培養基中培養，控制3瓶菌液的od600為0.5～0.7時，將3瓶菌液按適宜的體積比混合，將混合的菌液離心懸浮於質量百分比為0.9％的滅菌鹽水中，即製得微生物菌劑。進一步地，所述步驟1)中m為10，將10克的土壤投入裝有90ml滅菌水的錐形瓶中放入搖床中搖動1小時混勻，搖床的轉速為100rpm；採用梯度稀釋分離法製備10-4、10-5、10-6的土壤懸浮液。採用這種混合方式，可以將土壤更好的混勻，使其中土壤中的菌株在土壤液中分布均一，優選製備10-4、10-5、10-6的土壤懸浮液，因為10-2、10-3土壤懸浮液濃度較高，後期塗平板會產生較多的菌苔，不利於判斷優勢菌株。進一步地，步驟5)中鑑定3株優勢菌株分別為假單胞菌、檸檬酸桿菌和喜冷桿菌；所述步驟7)中3瓶菌液混合的體積比為，假單胞菌：檸檬酸桿菌：喜冷桿菌為1:2～4:4～6。假單胞菌：檸檬酸桿菌：喜冷桿菌為1:2～4:4～6是根據原始森林土壤中的菌株的比例，製備的微生物菌劑中菌株的比例與原始森林土壤中的菌株的比例儘可能保持一致，這樣才能達到促進植物生長的效果。更進一步地，所述喜冷桿菌保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址是中國武漢武漢大學，保藏日期為2016.10.31，保藏號為cctccm2016604，命名為cryobacteriumbaishanse02；所述3瓶菌液混合的體積比為，假單胞菌：檸檬酸桿菌：喜冷桿菌為1:3:5；採用該混合體積比更能促進植物生長。一種微生物菌劑的應用，所述微生物菌劑在促進花卉生長的應用。進一步地，所述花卉為蘆薈，仙人掌，虎尾蘭；由於蘆薈，仙人掌，虎尾蘭這三種花卉生長速度較慢，將微生物菌劑應用在這三種花卉中可使其生長的速度明顯加快。本發明的優點在於：1、從長白山原始森林是最接近原始生態的環境，在森林內有豐富的微生物，原始森林土壤沒有經過人為破壞，因此微生物在該環境中經過長期的進化，與長期生活的綠色植物共同生長會對植物生長具有促進作用。通過篩選長白山原始森林土壤中的主要優勢菌群來製備微生物菌劑應用在花卉植株中，促進花卉植株的生長。2、採用梯度稀釋分離法塗布平板，通過分類法統計菌落的類型與數量確定優勢菌株，通過革蘭氏染色法與16srdna共同鑑定優勢菌株的種屬，得到的優勢菌株的種屬結果準確，並將得到的優勢菌株進行保存，便於再次使用該菌株。3、將保存的優勢菌株培養至相同的od600值，以一定的體積比混合得到微生物菌劑，通過試驗得出3瓶菌液混合的體積比為，假單胞菌：檸檬酸桿菌：喜冷桿菌為1:2～4:4～6，這種體積比的微生物菌劑應用在花卉植株中，花卉植株的生長速度較快。附圖說明圖1為1號喜冷桿菌屬菌株培養於lb平板上的形態；圖2為3號假單胞菌屬菌株培養於lb平板上的形態；圖3為5號檸檬酸桿菌屬菌株培養於lb平板上的形態；具體實施方式為更好地理解本發明，以下將結合附圖和具體實例對發明進行詳細的說明。為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種微生物菌劑的製備方法，具體地說，通過在長白山原始森林土壤中篩選得到優勢菌株，將此優勢菌株鑑定其種屬後製成微生物菌劑應用於花卉植株上，促進花卉植株的生長。下將通過具體的實施例來對本發明的一種微生物菌劑的製備方法及其應用的優選方式進行詳細地說明。1)材料的選擇：取自長白山原始森林的土壤；2)稀釋塗布：取土壤10克，將10克的土壤投入裝有90ml滅菌水的錐形瓶中放入搖床中搖動1小時混勻，搖床的轉速為100rpm；採用梯度稀釋分離法製備10-4、10-5、10-6的土壤懸浮液，將10-4、10-5、10-6的土壤懸浮液各取0.2ml分別塗布於5塊固體培養基平板上，將塗有不同濃度土壤懸浮液的5塊固體培養基平板置於18℃的恆溫箱中培養2～3天，培養後從5塊固體培養基平板中挑選出一塊單菌落較多的平板作為統計平板；固體培養基的配方為：10g/l胰蛋白粉、5g/l酵母提取物、10g/l氯化鈉、15g/l瓊脂、5g/l葡萄糖；3)統計：根據統計平板中菌落的形態特徵對統計平板中的菌落進行歸類並統計數量；見表1表1菌落形態與數量統計4)優勢菌株的確定：根據步驟3)的結果確定3株優勢菌株，採用平板劃線法進一步純化3株優勢菌株；本發明所述的優勢菌株定義為：在最高稀釋度上，菌落數佔總菌落數的比例為10％以上的菌株稱之為優勢菌株。每個樣品中最多菌落達不到10％的，取菌落數最多的3種作為優勢菌株。根據該定義，得出1號，3號，5號菌株為優勢菌株。如圖1為1號菌株培養於lb平板上的形態；如圖2為3號菌株培養於lb平板上的形態；如圖3為5號菌株培養於lb平板上的形態。5)優勢菌株的鑑定：將純化後的3株優勢菌株分別接種到lb固體培養基上，18℃培養，觀察菌落的形態特徵並採用革蘭氏染色法對細菌的類別進行的判斷，然後利用pcr技術擴增16srdna鑑定菌株的種屬，具體的過程為：挑取單菌落溶於100ul超純水中，在沸水中煮10min裂解菌體，吸取1ul裂解後的菌液作為pcr反應的模板，擴增16srdna基因，將擴增的16srdna基因序列與genebank中16srdna的資料庫進行同源性比對，確定3株優勢菌株的種屬；pcr技術擴增中的引物採用通用引物對27f-1492r；pcr的反應體系為：10×pcrbuffer5μl、dntp5μl、mg2+2μl、10μm引物對27f-1492r各1μl、koddnapolymease1μl、模板1ul，用超純水定容至50μl；pcr反應程序為95℃5min；95℃1min、52℃30s、68℃2min，30個循環；68℃10min，15℃10min；將3株優勢菌株的菌落形態，染色結果對比《伯傑氏細菌鑑定手冊》及16srdna分析其相應的菌屬。結果如下：菌株1與cryobacteriumpsychrotolerans相似度為97％，菌株3與pseudomonasfluorescens相似度為99％，菌株5與citrobactermurliniae相似度為98％。綜合以上，鑑定3株優勢菌株分別為喜冷桿菌、假單胞菌、檸檬酸桿菌；見表2表2優勢菌株的菌屬鑑定編號相關屬相關種拉丁名相似度革蘭氏染色1喜冷桿菌屬psychrotoleranscryobacteriumpsychrotolerans97％陰性3假單胞菌屬fluorescenspseudomonasfluorescens99％陰性5檸檬酸桿菌屬murliniaecitrobactermurliniae98％陰性6)優勢菌株的保存：將3株優勢菌株分別接種於5mllb液體培養基中培養，待od600達到2.0時，取0.5ml菌液與0.5ml質量百分比為40％的滅菌甘油混合均勻，液氮預凍，-80℃保存待用；7)微生物菌劑的製備：從液氮中取出3株優勢菌株，分別接種在3瓶50mllb液體培養基中培養，控制3瓶菌液的od600為0.6時，將3瓶菌液混合，混合的體積比為，假單胞菌：檸檬酸桿菌：喜冷桿菌為1:2:4，將混合的菌液離心懸浮於質量百分比為0.9％的滅菌鹽水中，即製得微生物菌劑a，取10ml微生物菌劑a，10ml無菌水分別將它倒入相同大小的蘆薈的培養土中，三個月後，記錄蘆薈的長勢，具體見表3，其中高度差為三個月後的蘆薈與三個月前同一株蘆薈的高度差；溼重差為三個月後的蘆薈與三個月前同一株蘆薈的溼重差；乾重差為三個月後的蘆薈與三個月前同一株蘆薈的乾重差。表3高度差(cm)溼重差(g)乾重差(g)對比例5.1105.312.4微生物菌劑a12.6292.126.4將3瓶菌液混合，混合的體積比為，假單胞菌：檸檬酸桿菌：喜冷桿菌為1:3:5，將混合的菌液離心懸浮於質量百分比為0.9％的滅菌鹽水中，即製得微生物菌劑b；取10ml微生物菌劑b，10ml無菌水分別將它倒入相同大小的仙人掌的培養土中，三個月後，記錄仙人掌的長勢，具體見表4，其中高度差為三個月後的蘆薈與三個月前同一株仙人掌的高度差；溼重差為三個月後的蘆薈與三個月前同一株仙人掌的溼重差；乾重差為三個月後的蘆薈與三個月前同一株仙人掌的乾重差。表4高度差(cm)溼重差(g)乾重差(g)對比例0.54.61.2微生物菌劑b2.515.64.5將3瓶菌液混合，混合的體積比為，假單胞菌：檸檬酸桿菌：喜冷桿菌為1:4:6，將混合的菌液離心懸浮於質量百分比為0.9％的滅菌鹽水中，即製得微生物菌劑c；取10ml微生物菌劑c，10ml無菌水分別將它倒入相同大小的仙人掌的培養土中，三個月後，記錄虎尾蘭的長勢，具體見表5，其中高度差為三個月後的蘆薈與三個月前同一株虎尾蘭的高度差；溼重差為三個月後的蘆薈與三個月前同一株虎尾蘭的溼重差；乾重差為三個月後的蘆薈與三個月前同一株虎尾蘭的乾重差。表5高度差(cm)溼重差(g)乾重差(g)對比例5.890.324.3微生物菌劑c14.3200.845.3上述喜冷桿菌屬菌株保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏地址是中國武漢，武漢大學，保藏日期為2016.10.31，保藏號為cctccm2016604。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。當前第1頁12