孔雀石綠殘留檢測elisa試劑盒的製作方法
2023-07-25 02:00:31
孔雀石綠殘留檢測elisa試劑盒的製作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種孔雀石綠殘留檢測ELISA試劑盒。試劑盒包括盒體、盒蓋、設置於盒體內的底部固定座和頂部固定座，所述的底部固定座上有各種試劑瓶下凹瓶位，用於放置孔雀石綠抗體工作液、酶標二抗工作液、顯色液、終止液、濃縮洗滌液、孔雀石綠標準液、基質稀釋液和Tween-20備用液，所述的頂部固定座上有各種卡槽或凹槽，用於放置酶標板、微孔條、吸管、比色卡和pH試紙。該實用新型採用間接競爭ELISA方法進行孔雀石綠殘留的定性、定量檢測，具有操作簡單、靈敏度高、成本低廉等優點，適合大批量樣品的現場快速檢測。
【專利說明】 孔雀石綠殘留檢測ELISA試劑盒
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及一種醫藥生物領域的檢測試劑盒，具體涉及一種用於測定樣品溶液中孔雀石綠殘留含量的ELISA檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]孔雀石綠(Malachite Green, MG)又名鹼性綠、苯胺綠、維多利亞綠或中國綠等，屬於三苯甲烷類染料，是一分子苯甲醛與兩分子二甲基苯胺在濃硫酸或氯化鋅存在的條件下聚合而形成的深綠色晶體。孔雀石綠在細胞分裂時阻礙蛋白肽的形成，使細胞內的胺基酸無法轉化為蛋白肽，細胞分裂受到抑制，從而產生抗菌殺蟲作用。最早在1913年有人發現孔雀石綠可使某些組織著色，破壞病原菌而不引起宿主損害，於是將孔雀石綠用做防腐齊U、殺錐蟲藥和其它醫療用途。由於抗菌效果好、價格便宜，孔雀石綠被廣泛用作驅蟲劑和殺菌劑，以殺滅水產動物體外的寄生蟲、原生動物和魚卵中的黴菌，預防魚的水黴病、鰓黴病、小瓜蟲病等。有時為了使鱗受損的魚延長生命，在運輸過程中和存放池內，也常使用孔雀石綠。
[0003]但孔雀石綠及其代謝產物隱性孔雀石綠容易在生物體內積累，不易代謝。研究還發現:孔雀石綠及隱性孔雀石綠具有多重毒性，包括致癌性、致基因突變、引起染色體斷裂、致畸胎及呼吸道毒性等。鑑於此，美國、加拿大、日本、歐盟等許多國家均已禁止將孔雀石綠用作魚類的抗真菌藥物，我國於2002年5月也將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化全物清單》中。
[0004]孔雀石綠理化檢測方法包括氣相色譜(GC)、高效液性色譜(HPLC)、氣質聯用(GC-MS)和液質聯用(HPLC-MS)等，這些方法靈敏準確、特異性強，分離度好，但需要昂貴的儀器設備，樣品前處理複雜、繁瑣費時、檢測成本高，不能現場操作，而且需要專業技術人員；與之相比，酶聯免疫方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合於批量樣品的篩選等優點，而且所需設備少，操作簡單易學，成本低廉，能夠更好地滿足我國水產養殖、食品加工企業、政府職能監管部門等開展檢測工作。
【發明內容】
[0005]本實用新型的目的是提供了一種小巧輕便的孔雀石綠殘留檢測ELISA試劑盒，使用該試劑盒操作簡便，靈敏度高，成本低，穩定性好，可進行一次連續多個樣品中孔雀石綠含量的測定，減少了樣品檢測所需要的時間。
[0006]本實用新型的技術方案是:
[0007]一種孔雀石綠殘留檢測ELISA試劑盒，包括盒體和連接於盒體上的盒蓋，開口一側的盒蓋與盒體上分別設有相對應的盒蓋卡頭和盒體卡槽，其特徵在於:所述的盒體內部由上到下依次設有頂部固定座和底部固定座,其中底部固定座由底部間隔分為A、B兩部分，A部分設有7個試劑瓶下凹瓶位，B部分設有5個試劑瓶下凹瓶位，A部分的7個試劑瓶下凹瓶位內分別放置有孔雀石綠抗體工作液、酶標二抗工作液、顯色劑A液、顯色劑B液、終止液、濃縮洗滌液和孔雀石綠標準液，B部分的5個試劑瓶下凹瓶位內分別放置有淡水魚稀釋液、海水魚稀釋液、蝦肉稀釋液、飼料稀釋液和Tween-20備用液，所述的頂部固定座由手柄分為A、B兩部分，A部分設有2個卡槽，B部分設有6個凹槽，A部分的2個卡槽內分別放置有96孔酶標板和酶標反應微孔條，B部分的6個凹槽內分別放置有1.0mL吸管、100 μ L微吸管、60 μ L微吸管、50 μ L微吸管、比色卡和pH試紙，在頂部固定座B部分的上方放置有基質標準曲線和說明書。
[0008]所述的酶標板由聚苯乙烯製成，採用96孔試劑板作為固相載體，放於鋁鉬袋內，並置於酶標板卡槽中，且酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有12個反應孔，其上預包被孔雀石綠偶聯抗原。
[0009]本實用新型的有益效果是:試劑盒所需儀器較少，操作簡單易行，且能快速、準確、批量地用於樣品溶液中孔雀石綠含量的定量、定性檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1是本實用新型的結構示意圖，圖2是本實用新型中底部固定座的結構示意圖，圖3是本實用新型中頂部固定座的結構示意圖。
[0011]圖面說明:1、盒體,2、盒蓋，3、底部固定座，4、頂部固定座；5、盒體卡槽，6、盒蓋卡頭，7、底座間隔，8、孔雀石綠抗體工作液瓶位，9、酶標二抗工作液瓶位，10、顯色劑A液瓶位，11、顯色劑B液瓶位，12、終止液瓶位，13、濃縮洗滌液瓶位，14、孔雀石綠標準液瓶位，15、淡水魚稀釋液瓶位，16、海水魚稀釋液瓶位，17、蝦肉稀釋液瓶位，18、飼料稀釋液瓶位，19、Tween-20備用液瓶位，20、手柄，21、酶標板卡槽，22、酶標反應微孔條卡槽，23、1.0ml吸管凹槽，24、ΙΟΟμΙ微吸管凹槽，25、60μ1微吸管凹槽，26、50μ1微吸管凹槽，27、比色卡凹槽，28、pH試紙凹槽。
【具體實施方式】
[0012]結合附圖詳細描述實施例。一種孔雀石綠殘留檢測ELISA試劑盒，包括盒體1、盒蓋2、設置盒體I內的底部固定座3和頂部固定座4，所述的盒體I上有盒體卡槽5，與盒蓋2上的盒蓋卡頭6相對應，用於開關試劑盒。
[0013]所述的底部固定座3由底部間隔7分為A、B兩部分，A部分設有7個試劑瓶下凹瓶位，B部分設有5個試劑瓶下凹瓶位。A部分孔雀石綠抗體工作液瓶位8放置有白色塑料試劑瓶封裝的6ml孔雀石綠抗體工作液，酶標二抗工作液瓶位9放置有紅色塑料試劑瓶封裝的6ml兔抗鼠酶標二抗(RaMIgG-HRP)，顯色劑A液瓶位10放置有黑色塑料試劑瓶封裝的4ml底物顯色劑A液，顯色劑B液瓶位11放置有綠色塑料試劑瓶封裝的4ml底物顯色劑B液，終止液瓶位12放置有黃色塑料試劑瓶封裝的7ml 2M硫酸溶液，濃縮洗滌液瓶位13放置有半透明塑料試劑瓶封裝的40ml濃縮洗滌液(10 X )，孔雀石綠標準液瓶位14放置有白色透明塑料試劑瓶封裝的2ml孔雀石綠標準品溶液(lmg/ml)。B部分淡水魚稀釋液瓶位15放置有紅色帽的半透明塑料試劑瓶封裝的50ml淡水魚樣品稀釋液，海水魚稀釋液瓶位16放置有黃色帽的半透明塑料試劑瓶封裝的50ml海水魚樣品稀釋液，蝦肉稀釋液瓶位17放置有白色帽的半透明塑料試劑瓶封裝的20ml蝦肉樣品稀釋液，飼料稀釋液瓶位18放置有灰色帽的半透明塑料試劑瓶封裝的20ml飼料樣品稀釋液，Tween-20備用液瓶位19放置有黑色帽的黑色塑料試劑瓶封裝的3ml Tween-20表面活性劑。
[0014]所述的頂部固定座4由手柄20分為A、B兩部分，A部分設有2個卡槽，B部分設有6個凹槽。A部分的酶標板卡槽21放置一塊由聚苯乙烯製成的酶標板，採用96孔試劑板作為固相載體，放於鋁鉬袋內，且酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有12個反應孔，其上預包被孔雀石綠偶聯抗原，酶標反應微孔條卡槽22放置有24-36條散裝酶標反應微孔條，使用時安裝在酶標板外框支撐架上，使試劑盒檢測容量擴大2-3倍。B部分的1.0ml吸管凹槽23放置有50根1.0ml容量的吸管，用於樣品基質的採樣，ΙΟΟμΙ微吸管凹槽24放置有50根ΙΟΟμΙ容量的微吸管，用於添加終止液，60μ1微吸管凹槽25放置有50根60μ1容量的微吸管，用於添加顯色劑溶液，50μ1微吸管凹槽26放置有50根50μ1容量的微吸管，用於添加孔雀石綠抗體工作液和酶標二抗工作液，比色卡凹槽27放置有不同基質條件下的比色卡，顯示不同顏色試劑孔對應的吸光度值和孔雀石綠殘留含量，用於樣品含量的大概推算，PH試紙凹槽28放置不同種類的PH試紙，用來測定不同溶液的pH值。B部分凹槽的表面還放置有基質標準曲線和說明書，將酶標儀測定的吸光度值代入標準曲線，可準確測定樣品溶液中孔雀石綠殘留含量。
[0015]魚、蝦可食組織中孔雀石綠含量測定:
[0016]I)樣品前處理:取魚、蝦等水產樣品中可食性肌肉部分，均質器均漿；準確稱取2g均質後樣品於15ml離心管中，再加入Iml混合提取液(對甲苯磺酸0.2g，鹽酸羥胺0.1g,乙酸胺0.2g，加蒸餾水溶解，定容至500ml，再用2mol/L氫氧化鈉溶液調至pH4.5)至離心管中，振蕩Imin ;將3ml乙腈加入到離心管中，劇烈振蕩2min ;室溫下4000r/min離心5min,吸取100 μ I上清液待檢。
[0017]2)試劑盒的操作步驟:①將所需試劑從冷藏環境中取出，置於室溫平衡20min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻取出所需數量的微孔條，將不用的微孔條放進原錫箔袋中並且與提供的乾燥劑一起重新密封，保存於2-8°C 編號:將樣品對應微孔按序編號，每個樣品做2孔平行，並記錄樣品孔所在的位置加樣品:加樣品50 μ I到對應的微孔中，隨即加入酶標二抗工作液50 μ I /孔，再加入孔雀石綠抗體工作液50 μ I /孔，輕輕振蕩混勻，置37°C避光環境中反應30min 洗板:將孔內液體甩幹，用洗滌工作液300 μ I/孔，充分洗滌5次，每次間隔10s，用吸水紙拍幹；?顯色:加入底物顯色劑溶液60 μ I/孔(A液和B液各30 μ I )，輕輕振蕩混勻，置37°C避光環境反應15_20min ；?測定:加入終止液100 μ I/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀於450nm處，測定每孔吸光度值。
[0018]3)測定樣品溶液中孔雀石綠含量:
[0019]①定性測定:底物顯色15_20min後，將樣品孔藍色深淺與比色卡對比，獲得不同樣品基質中孔雀石綠殘留大概含量。
[0020]②定量測定:加入終止液100 μ I/孔後，將酶標儀測定的吸光度值代入標準曲線，可準確測定樣品溶液中孔雀石綠殘留含量。
【權利要求】
1.一種孔雀石綠殘留檢測ELISA試劑盒，包括盒體和連接於盒體上的盒蓋，開口一側的盒蓋與盒體上分別設有相對應的盒蓋卡頭和盒體卡槽，其特徵在於:所述的盒體內部由上到下依次設有頂部固定座和底部固定座,其中底部固定座由底部間隔分為A、B兩部分，A部分設有7個試劑瓶下凹瓶位，B部分設有5個試劑瓶下凹瓶位，A部分的7個試劑瓶下凹瓶位內分別放置有孔雀石綠抗體工作液、酶標二抗工作液、顯色劑A液、顯色劑B液、終止液、濃縮洗滌液和孔雀石綠標準液，B部分的5個試劑瓶下凹瓶位內分別放置有淡水魚稀釋液、海水魚稀釋液、蝦肉稀釋液、飼料稀釋液和Tween-20備用液，所述的頂部固定座由手柄分為A、B兩部分，A部分設有2個卡槽，B部分設有6個凹槽，A部分的2個卡槽內分別放置有96孔酶標板和酶標反應微孔條，B部分的6個凹槽內分別放置有1.0mL吸管、100 μ L微吸管、60 μ L微吸管、50 μ L微吸管、比色卡和pH試紙，在頂部固定座B部分的上方放置有基質標準曲線和說明書。
2.根據權利要求1所述的孔雀石綠殘留檢測ELISA試劑盒，其特徵在於:所述的酶標板由聚苯乙烯製成，採用96孔試劑板作為固相載體，放於鋁鉬袋內，並置於酶標板卡槽中，且酶標板由外框支撐架和放置其上的可拆裝酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有12個反應孔，其上預包被孔雀石綠偶聯抗原。
【文檔編號】G01N33/543GK203981679SQ201420336230
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年6月23日 優先權日:2014年6月23日
【發明者】王秋霞, 楊英軍, 李新朋, 杜鳳山, 懷文輝, 孫志文 申請人:河南知微生物工程有限公司, 河南科技學院