一種長效蛋白質藥物及其製備方法

2023-07-20 10:50:46

專利名稱：一種長效蛋白質藥物及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域。具體地講，本發明公布了一種製備長效蛋白質藥物的方法， 利用該方法可以對藥物蛋白質進行改造，提高其體內的半衰期，延長其體內療效。
背景技術：
重組蛋白質藥物是目前最主要的一類生物技術藥物，與小分子化學藥物相比，重組蛋白 質藥物具有特異性強、副作用小、療效好等優點，但是蛋白質類藥物的缺點也是顯而易見的。 蛋白質藥物易失活、給藥途徑單一、體內的半衰期短，對於外源性蛋白質藥物，還存在抗原 性的問題。作為生物大分子，每種蛋白質都有其獨特的高級結構，蛋白質藥物的活性依賴於 其正確的高級結構，任何影響其高級結構的理化因素都可能導致蛋白質藥物活性的降低或喪 失，因此，蛋白質藥物對存儲條件要求較高， 一般為4'C或低溫保存。在使用方面，蛋白質藥 物還存在著給藥途徑少、半衰期短等缺點。蛋白質藥物一般不能通過口服給藥，只能通過皮 下或靜脈注射給藥，通過皮下或靜脈注射而進入體內的蛋白質藥物不可避免地會受到體內蛋 白酶的攻擊而降解，從而失去活性。另外，作為藥物的蛋白質一般分子量相對較小，容易被 腎小球濾過，導致血液中有效藥物濃度降低。正是由於這些原因，使得蛋白質藥物的體內半 衰期較短，剛給藥後，蛋白質藥物濃度一過性增高，之後很快降低到有效濃度以下，臨床上 為了使血液中蛋白質藥物濃度達到有效治療濃度，必須反覆給藥，從而導致用藥成本增加、 副作用增大、病人的依從性差等問題。為了提高蛋白質藥物的生物利用度和療效，臨床上急 需穩定、長效的蛋白質藥物。
目前提高蛋白質藥物的半衰期和療效的途徑主要有構建更穩定的突變體蛋白、聚乙二醇 修飾和與血清白蛋白融合等。聚乙二醇修飾的蛋白質藥物具有很多優點，主要有蛋白質藥物 的分子量增加，被腎小球過濾的機率減小，在體內的半衰期延長；由於聚乙二醇的屏蔽作用 使蛋白質免疫原性降低，被蛋白酶降解的機率減小；聚乙二醇化的水解使得蛋白質藥物活性 得到恢復，起到類似緩釋的作用，從而長時間維持有效的血藥濃度。但是蛋白質藥物的聚乙 二醇修飾也存在著明顯的不足，主要是聚乙二醇的使用導致生產成本增加，聚乙二醇的屏蔽 作用導致蛋白質的活性降低，聚乙二醇修飾的不均一性導致產品質控困難，回收率低，進一 步增加了生產成本。因此，有必要開發新的長效蛋白質藥物製備方法。本發明的目的就是建 立一種新的長效蛋白質藥物製備方法，可以對蛋白質藥物進行長效改造。

發明內容
本發明公開了一種長效蛋白質藥物製備方法，該方法的特點是將具有抗體Fc段結合活性 的小肽(或蛋白質)與藥物蛋白質相連接，從而使藥物蛋白質在體內具有抗體Fc段結合活性， 改造後的藥物蛋白質在體內能夠與抗體的Fc段結合，形成大分子複合體，從而增加其半衰期， 維持更持久的體內活性。這種連接了具有抗體Fc段結合活性的小肽(或蛋白質)的藥物蛋白 質就是一種長效蛋白質藥物。
將具有抗體Fc段結合活性的小肽(或蛋白質)與藥物蛋白質相連接可以採取生物學方法，也可以採取化學偶聯法。
生物學方法的步驟包括構建藥物蛋白質和具有抗體FC段結合活性的小肽(或蛋白質) 的融合基因，將融合基因通過酶切、連接方法，或同源重組等方法克隆到表達載體中。用構 建好的融合基因表達載體轉化宿主細胞，通過宿主細胞表達融合蛋白並進行分離純化。該融
合蛋白即為長效蛋白質藥物。其中，融合基因的構建可以採用SOE(Gene splicing by over lap extension)法，也可以採用SDL(Gene splicing by directed ligation)法或PCR法。
SOE法構建融合基因實際上是通過複製時DNA鏈的交錯延伸實現基因拼接的，基本步 驟為
1、 為藥物蛋白質基因(基因I )設計上、下遊引物primed和primer2，為具有抗體Fe 段結合活性的小肽或蛋白質基因(基因II)設計上、下遊primer3和primer4，其中primerl 和primer4為常規引物，而primer2的3'端序列為基因I常規引物，其5'端序列則為基因II正 義鏈5'末端互補序列。同理，primer3的3'端序列為基因II的常規引物，其5'端序列則為基 因I反義鏈5'末端互補序列。
2、 將基因I、 II分別進行PCR擴增，產物分別為基因I的正義鏈A、反義鏈B，基因II 的正義鏈C、反義鏈D。
3、 將兩種PCR產物混合，經變性及退火處理，A鏈和D鏈部分鹼基互補配對形成雜交鏈。
4、 在DNA聚合酶I作用下，A和D鏈互為引物和模板，合成出包含基因I和基因II的 融合基因。
SDL法構建融合基因的基本步驟為
1、 為藥物蛋白質基因(基因I )設計上、下遊引物primerl和primer2，為具有抗體Fc 段結合活性的小肽或蛋白質基因(基因n)設計上、下遊primer3和primer4，其中primerl 和primer4為常規引物，而primer2的3'端序列為基因I常規引物，5'端序列則包含一種限制 性內切酶A的酶切位點；同理，primer3的3'端序列為基因II的常規引物，5'端序列則包含 一種限制性內切酶B的酶切位點。而限制性內切酶A和B切割靶序列後形成的粘性末端應互 補。
2、 將基因I、 II分別進行PCR擴增，回收擴增產物。將基因I擴增產物用限制性內切酶 A酶切，將基因II擴增產物用限制性內切酶B酶切。
3、 將酶切後的兩種基因純化、回收，然後在DNA連接酶的作用下將基因I和基因II通 過其互補的粘性末端相連接，形成融合基因。
PCR方法構建融合基因
通過PCR構建融合基因的方法主要適用於將藥物蛋白質基因與小肽基因融合。由於小肽 基因小，可以將小肽基因序列設計到PCR引物中。通過PCR擴增藥物蛋白質基因時，小肽 基因就被融合到藥物蛋白質基因的上遊或下遊，從而得到藥物蛋白質與小肽的融合基因。
將具有抗體Fc段結合活性的小肽(或蛋白質)與藥物蛋白質相連接的另外一種方法就是化學偶聯法。其基本步驟為將^W白J^和具有抗體，C殺結合活性的小肽(或蛋白質)按 照一定的比例(摩爾比為l: 1~1: 20)振蕩混勻，邊攪拌邊逐滴加入偶聯劑。加畢，再攪拌 5 10min，然後在室溫下繼續反應2 3h。之後，採用層析技術將偶聯了小肽的藥物蛋白質 和未偶聯小肽的藥物蛋白質分開，偶聯了小肽的藥物蛋白質即為長效蛋白質藥物。
利用化學偶聯法製備長效蛋白質藥物時，應根據具有抗體Fc段結合活性的小肽(或蛋白 質)的性質選用不同的偶聯劑。常用作偶聯劑的有碳化二亞胺類、戊二醛、二異氰酸化合物 和二滷化二硝基苯等。這些偶聯劑使具有抗體Fc段結合活性的小肽(或蛋白質)與藥物蛋白 質在-COOH、 -\112或-811等基團部位發生結合。
在本發明的實施例中，提供了一種通過生物學方法製備長效人粒細胞集落刺激因子的步 驟，具體包括採用兩步PCR方法構建hG-CSF與小肽VETWKTSRISIF的融合基因，將該 融合基因用五coR I和5a附H I雙酶切後連接到pBV220表達載體中，轉化大腸桿菌DH5a， 選取序列正確的克隆誘導表達hG-CSF-小肽融合蛋白，採用陰離子交換柱和分子篩層析等純 化方法將hG-CSF-小肽融合蛋白進行純化。
用本方法製備的長效人粒細胞集落剌激因子保留了原有生物學活性，作用時間明顯延長， 可有效避免聚乙二醇修飾帶來的生產成本增加、蛋白質的活性降低、產品質控困難，回收率 低等缺點。


圖l.hG-CSFtagl融合基因的構建
圖2. pBV-G-CSFtagl表達載體的酶切鑑定
1: DL2000 marker; 2: DL15000 marker; 3: pBV-G-CSFtagl重組質粒酶切圖譜；
圖3 hG-CSF和hG-CSFtagl的誘導表達 1: hG-CSFtagl的誘導表達； 2: hG-CSF的誘導表達； M:蛋白質分子量標準；
圖4 hG-CSF和hG-CSFtagl對NFS-60細胞的增殖刺激作用
圖5正常小鼠給予hG-CSF和hG-CSFtagl後血液白細胞數量的變化
圖6小鼠化療後給予hG-CSF和hG-CSFtagl後血液中白細胞數量恢復情況
具體實施例方式
以下實施例用於詳細說明本發明及其效果，但是本發明並不僅僅局限於這些實施例，這 些實施例不以任何方式限制本發明的範圍。本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改， 但所作的類似的改動或修改同樣落在本申請權利要求書所限定的範圍之內。
實施例l長效人G-CSF表達載體的構建
根據文獻報導，選用與人、鼠IgG Fc段具有結合活性的多肽序列VETWKTSRISIF。按 照hG-CSF基因序列設計特異性引物，之後通過PCR擴增，使此多肽編碼序列與hG-CSF基因形成融合基因，再將融合基因克隆承r原,達載體彿V'2i (5中。設計的PCR引物序列為 上遊引物F: 5'-ATAGAATTCATGACACCATTAGGCTCTG-3'(五coRI) 下遊引物Rl: 5'- AATGCGGCTGGTTTTCCAGGTTTCCACGGGCTGGGCAAGGTG -3' 下遊引物R2:5'- ATTGGATCCTTAAAAAATGCTAATGCGGCTGGTTTTCCAG -3' (5awH
I)
具體步驟如下
融合基因的獲得以攜帶hG-CSF基因的pBV220-G-CSF表達載體為模板，以上遊引物F 和下遊引物R1進行第一次PCR，回收第一次PCR產物，以回收的PCR產物為模板，再以上 遊引物F和下遊引物R2進行第二次PCR擴增，回收第二次PCR產物，即hG-CSFtagl融合 基因(圖1)。將第二次PCR產物和pBV220表達載體分別用BamH I和￡coR I進行雙酶切， 用回收試劑盒回收酶切產物，將雙酶切後的PCR產物和pBV220表達載體用T4DNA連接酶 在16'C水浴中連接過夜。將連接產物轉化大腸肝菌DH5a感受態細胞，在LB-Amp平板上篩 選陽性克隆，擴增並提取質粒，用5amH I和五coR I進行雙酶切鑑定(圖2)，將重組質粒 送北京奧科生物技術有限公司進行測序鑑定，重組質粒命名為pBV-hG-CSFtagl。測序結果表 明，hG-CSF基因和VETWKTSRISIF小肽的編碼基因融合為一個基因，序列完全正確。
實施例2: hG-CSFtagl的誘導表達
將序列正確的pBV-hG-CSFtagl質粒轉化DH5a宿主菌，鋪LB Amp+平板，在該平板上長 出的克隆即為陽性克隆。挑取陽性克隆，37'C培養過夜。次日，將工程菌接入LBAmp+液體 培養基，在30。C搖床上培養至菌體密度OD6QQ達到0.4~0.6，然後轉入42。C搖床誘導表達4 小時，取菌體進行SDS-聚丙烯醯氨凝膠電泳，hG-CSFtagl的表達量佔菌體總蛋白的30% (圖 3) 。 hG-CSF在同樣條件下誘導表達。
實施例3:包涵體的製備及裂解
菌體收集和包涵體製備4'C， 6000rpm離心8min，收集hG-CSFtagl工程菌菌體沉澱，置 於-2(TC冰箱中保存。次日，將在-20'C保存的菌體在室溫下解凍後，置於冰浴中超聲處理， 條件為電流350mA,脈衝20sxl0次(每次間隔ls)，然後將超聲後的菌體於12 000 rpm， 4'C離心 15min，收集沉澱即包涵體。
包涵體的洗滌將包涵體分別用20 mMTris-HCl緩衝液(pH8.0)、 1M NaCl、lmM EDTA、 0.1% TritonX-100分別進行洗滌，之後12000rpm、 4°C離心15min，收集沉澱。然後再將沉 澱用2M尿素洗滌一次，之後離心收集沉澱即包涵體。
包涵體的裂解將洗滌好的包涵體稱重，按每克包涵體加入20ml含1%巰基乙醇的8M 尿素(溶解於20mMTris-HCl)的比例將包涵體裂解過夜。次日，將裂解液在室溫下10000rpm 離心15min，收集裂解上清。
實施例4: hG-CSFtagl的純化與復性
準備4.0cmxl00cm層析柱，裝入Sephacryl S-100至90cm，然後，用20mM Tris-HCl ，8M (pH8.0)尿素溶液平衡。平衡完畢，將包涵體按柱體積的3%上樣，進行分子篩層析，收集 目的蛋白峰。以牛血清白蛋白為標準測蛋白，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。用20mMTris-HCl ,8M (pH8.0)尿素溶液頓璺蛋白濃度至，4004eO^g/'ml，然後用含有lmM氧化型谷 胱甘肽和lmM還原型穀胱甘肽的20mM Tris-HCl(pH8.0)稀釋4倍，使蛋白終濃度在100pg/ml 左右，4'C條件下放置過夜。次日，將復性蛋白溶液對20mM Tris-HCl (pH8.0)緩衝液充分 透析，用於後續純化。
準備一支2.6cmx20cm層析柱，裝入DEAE Sepharose Fast Flow凝膠，柱高15cm，之後 用20mM Tris-HCl (pH8.0)平衡。將復性的蛋白上樣於已平衡的DEAE柱中，上樣完畢， 用20mMTris-Ha (pH8.0)洗至基線。之後，用含0.15M NaCl的20mM Tris-HCl (pH8.0) 洗脫目的蛋白峰，收集洗脫峰。將收集的目的蛋白峰用lOmM乙酸-乙酸鈉(pH4.0)透析3 次，此即為純化後的hG-CSFtagl蛋白。
實施例5: hG-CSFtagl的體外活性測定
用MTT法，採用G-CSF依賴細胞株NFS-60細胞測定G-CSF和hG-CSFtagl的活性。 將NFS-60細胞在含有10ng /ml的G-CSF和10%牛馬血清的1640培養液中培養至數量 合適後，收集細胞，之後，用RPMI-1640培養液洗3遍，以去除培養液中殘存的G-CSF。然 後，用含10%胎牛血清的培養液將NFS-60配成細胞懸液，以每孔5000個細胞接種到96孔 板，每孔體積100pl。分組為G-CSF組，hG-CSFtagl和不加G-CSF的陰性對照組。將各組細 胞在5%(202、 37'C培養箱中培養3天。檢測前4小時每孔加入5mg/ml的MTT溶液(pH7.4 PBS的配製)20pl。繼續孵育4小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加15(Hil DMSO, 振蕩IO分鐘，使結晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收 值，記錄結果。結果表明，hG-CSF和hG-CSFtagl均能維持NFS-60細胞的存活與增殖， hG-CSFtagl的活性比hG-CSF的活性略低(圖4)，這可能與兩種蛋白質定量差異或復性效 率不同造成的，也可能小肽標籤對G-CSF的活性有些微的影響。
實施例6: hG-CSFtagl的體內長效性測定1
將實驗小鼠按照隨機均衡的原則分為二組，每組6隻，分別是G-CSF組和hG-CSFtagl 組。給藥方案為，第O天給予G-CSF和hG-CSFtagl,按照lmg/kg給藥，給藥1次。然後， 每天進行白細胞計數，觀察各組動物白細胞數量的變化情況(圖5)。
從圖5可以看出，首先，hG-CSF和hG-CSFtagl在給藥後在第3天開始，兩組動物的白 細胞數都有了較大幅度的提高，而且，hG-CSF組提升的更快，最先達到峰值，而hG-CSFtagl 組的白細胞升離是平穩的。說明在動員骨髓幹細胞產生粒細胞方面，hG-CSF可能起效更快。 但是hG-CSF-tagl能夠平穩升高粒細胞，說明hG-CSF-tagl在體內能夠維持相對穩定的藥物 濃度，對於刺激粒細胞產生的作用是溫和並且持續的；在達到最高值之後，在下降速度方面， hG-CSF組下降很快，於第一峰值後第3天降低到最低值，但是hG-CSF-tagl組於峰值第4天 才降到最低值，並且粒細胞數量的降低是緩慢而平穩的，這在一定程度上說明，rhG-CSF-tagl 在動物體內的代謝是緩慢的、平穩的，有一定的緩釋作用。
實施例7: hG-CSFtagl的體內長效性測定2
將實驗小鼠按照隨機均衡的原則，分為三組，每組5隻，分別是醋酸氨緩衝液對照組， hG-CSF組和hG-CSFtagl組。給藥方案為，第O天給予環磷醯氨，劑量為200mg/kg，給藥一次。1， 2， 3天分別進行白細胞itf^在第》夭，*^組,—別給予醋酸氨緩衝液(HAc)、hG-CSF、 hG-CSFtagl，按照lmg/kg給藥，給藥1次。然後，每天進行白細胞計數，觀察各組動物白細 胞數量恢復情況(圖6)。
由圖6看出，hG-CSF組和hG-CSFtagl組，在給藥後第1天白細胞數目就有了顯著的提 高，並且在持續的幾天內， 一直在增高，這說明hG-CSF和hG-CSFtagl對升高白細胞是非常 有效的。
由hG-CSF組和hG-CSFtagl組的對比可以看出，hG-CSFtagl組小鼠的白細胞在第10天 還維持較高水平，而hG-CSF組小鼠的白細胞已經降低到HAc模型對照組水平。
hG-CSF組在建模後第11天白細胞降至最低值，之後逐漸恢復到正常值。而hG-CSFtagl 組，白細胞一直在升高，第ll天達到最高值，之後4天仍使白細胞數目維持在較高水平上， 比hG-CSF的療效至少長5天。
總體分析，hG-CSFtagl的藥效長達10天，而hG-CSF組的藥效僅為5天，hG-CSFtagl 的藥效是hG-CSF組的近2倍。
權利要求
1、一種長效蛋白質藥物，其特徵為在藥物蛋白質上連有一段小肽(或蛋白質)，該段小肽(或蛋白質)具有抗體Fc段結合活性。
2、 如權利要求1所述的長效蛋白質藥物，其特徵為在人粒細胞集落刺激因子的C末端連接 有一段具抗體Fc段結合活性的小肽VETWKTSRISIF。
3、 如權利要求l所述長效蛋白質藥物的製備方法，其特徵為將藥物蛋白質與具有抗體Fc段 結合活性的小肽(或蛋白質)相連接，形成偶聯蛋白。
4、 根據權利要求3所述的製備方法，其特徵為所用連接方法為生物學方法，步驟包括-(1) 構建藥物蛋白質和具有抗體Fc段結合活性的小肽(或蛋白質)的融合基因；(2) 將融合基因通過酶切、連接方法，或同源重組等方法克隆到表達載體中；(3) 用構建好的融合基因表達載體轉化宿主細胞；(4) 選取序列正確的陽性克隆誘導表達融合蛋白；(5) 分離純化融合蛋白。
5、 根據權利要求4所述的製備方法，其特徵為融合基因的構建採用SOE(Gene splicing by over lap extension)法、SDL(Gene splicing by directed ligation)、法或PCR 、法。
6、 根據權利要求3所述的製備方法，其特徵為所用連接方法為化學偶聯法，步驟包括(1) 將藥物蛋白質和具有抗體FC段結合活性的小肽(或蛋白質)按照摩爾比l: 1 1: 20振蕩 混勻，邊攪拌邊逐滴加入偶聯劑；(2) 加畢，再攪拌5 10min，然後在室溫下繼續反應2 3h;(3) 採用層析技術將偶聯了小肽的藥物蛋白質和未偶聯小肽的藥物蛋白質分離。
7、 根據權利要求6所述的製備方法，其特徵為所用偶聯劑選自碳化二亞胺類、戊二醛、二異 氰酸化合物或二滷化二硝基苯。
全文摘要
本發明公開了一種製備長效蛋白質藥物及其製備方法，屬於生物技術領域。具體地講，本發明是通過對蛋白質藥物進行改造，使之具有結合抗體Fc段的活性。改造後的蛋白質藥物在血液中能夠結合抗體的Fc段，從而與抗體形成大分子複合體，提高其體內的半衰期。由於半衰期的延長，改造後的蛋白質藥物具有更持久的體內活性。
文檔編號A61K47/48GK101623501SQ200810132699
公開日2010年1月13日 申請日期2008年7月9日 優先權日2008年7月9日
發明者傅一鳴, 王清明, 範國才, 陳吉中 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所