一種纖維素酶水解促進劑及其應用的製作方法

2023-07-20 17:26:21

專利名稱：一種纖維素酶水解促進劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種酶水解促進劑，尤其是一種纖維素酶水解促進劑及其應用。
背景技術：
在化石能源即將消耗殆盡的今天，開發可再生能源是人類維持社會發展的必然趨勢。燃料乙醇的使用能降低化石燃料的用量，減輕日益嚴重的化石環境汙染問題，因此世界各國都在大力開發燃料乙醇生產技術。燃料乙醇作為目前應用最為廣泛的可再生機動燃料，其商業化生產主要以澱粉和糖類作物為原料，如世界乙醇產量第一大國(巴西)就以甘蔗作為原料進行生產，美國則以玉米作為原料進行生產。近年來，商業化使用玉米等糧食作物進行生產導致糧食價格的上漲，加劇了世界糧食危機，迫使世界各國提倡以非糧食原料進行燃料乙醇的生產與開發。我國作為人口大國，糧食安全顯得尤為重要，因此我國也明確 強調開發使用非糧食原料進行乙醇生產。木質纖維生物質作為地球儲量最為豐富的生物質資源，其主要成分為纖維素、半纖維素和木質素，纖維素和半纖維素通過化學法或者酶法可以降解為單體糖，這些單糖通過微生物酵母發酵可以轉化為燃料乙醇。木質纖維原料轉化為燃料乙醇過程，因為具有廣泛原料來源，工藝環境友好，條件溫和，是目前世界研究開發熱點。木質纖維原料具有比澱粉類原料更為複雜的結構，纖維素被半纖維素和木質素包裹著，這種結構使得木質纖維原料具有更高的穩定性和抗生物降解性。實現生物轉化首先要先將纖維素和半纖維素等多糖類物質降解為微生物能代謝的單糖物質，目前常用酸水解和酶水解。作為傳統工藝，酸水解具有較高的效率，但是酸水解工藝對設備要求高，需要脫毒和中和過程，不符合綠色化工原則，不代表未來發展方向。酶水解具有條件溫和，環境友好以及水解過程和後期發酵過程兼容性好等特點，是目前研究最多的工藝。植物纖維素資源是地球上最大的可利用的再生資源，有效地水解纖維素為葡萄糖進而發酵為乙醇等，將會減輕人類糧食和能源的壓力。但是，酶水解工藝目前還不具備規模化應用的可能，這由三方面的原因導致1、酶生產成本居高，儘管研究致力於不斷降低酶生產成本，04年美國的可再生能源實驗室將酶生產成本降低到了原來的1/10，酶生產成本仍然達不到規模應用的要求；2、木質纖維原料複雜的結構降低了纖維素酶對纖維素的可及性，也就是降低了酶水解效率，增大酶用量；3、原料中木質素吸附部分纖維素酶組分，這也大大降低酶有效組分濃度。目前，提高纖維素酶水解效率的方法如下1)選育和開發能生產高效酶系的菌株，採用過程集成技術去消除酶濃縮成本從而降低酶生產成本；2)對原料進行預處理提高纖維素酶的可及性，或者採用一些工業廢棄木質纖維素作為原料，這些原料通常在其產生過程中已經過了一些處理，具有疏鬆結構，易於被酶水解；3)採用表面活性劑降低木質素對酶組分的吸附，或者通過一定預處理降低原料中木質素的含量。木質素通過植物的光合作用產生，基本結構為苯丙烷，木質素的存在會阻礙酶與底物的接觸，導致酶水解效率降低。採用表面活性劑是行之有效且實用的一種方法，但化學合成表面活性劑合成成本高，同時其生物難降解性會增加下遊生物轉化和產物分離過程的負擔。天然表面活性劑中蛋白類具有獨特的優點，其能作為下遊生物轉化過程的潛在營養-氮源。儘管牛血清蛋白等精製的蛋白提高酶活的效果顯著，但其不適合用作酶水解添加劑，因為其同樣具有高的生產成本。因此，開發低廉有效的蛋白作為表面活性劑成為亟待解決的技術問題。

發明內容
本發明的目的是提供一種纖維素酶水解促進劑及其在提高纖維素酶水解效率中的應用。所述纖維素酶水解促進劑是將酵母或酵母廢棄物加入到水中，混勻，調pH值，力口熱處理得到。上述酵母廢棄物可進一步離心，取輕相部分處理。其中，調pH值至2.0-7.5，所述加熱處理的處理溫度100-1211;處理時間5_60mino 本發明還提供一種提高纖維素酶水解效率的方法，包括在纖維素原料中加入上述纖維素酶水解促進劑、纖維素酶進行酶水解。具體地，包括以下步驟I)對糠醛渣水溶液進行鹼中和、過濾，得到糠醛渣濾渣；2)糖化加入上述纖維素酶水解促進劑、纖維素酶進行酶水解，得酶水解液。所述糠醛渣水溶液含有9-12%的糠醛渣，所述鹼中和為用固體NaOH中和糠醛渣水溶液至PH5飛，所述糠醛渣濾渣含水量8(Γ85%。所述糖化為處理後的糠醛渣濾渣經過滅菌裝入糖化罐，糖化條件為3 9%糠醛渣(w/v),纖維素酶用量12-15FPU/g糠醛渣濾渣，加入纖維素酶水解促進劑濃度10g/l-30g/I，糖化溫度為45-47 °C，糖化時間48-96h。其中，步驟2)中所述纖維素酶由適應性培養的擬康氏木黴得到。所述擬康氏木黴的適應性培養的條件在2%糠醛渣固體培養基上培養擬康氏木黴菌種的孢子；將孢子用生理鹽水稀釋；將孢子懸浮液接種到含糠醛渣的液體產酶培養基中培養，所述2%糠醛渣固體培養基組成為4g糠醛渣、200ml Mandels營養鹽和4g瓊脂，所述液體產酶培養基為馬鈴薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然。在步驟2)得到的酶水解液中進一步加入接種濃度I. 25g/l的酵母或加入接種濃度3g/l的乳酸菌，溫度為38-42°C，發酵72-120h，pH值5. 5-6. 5，進行發酵，得到乙醇或乳酸。其中，所述酵母或乳酸菌經步驟I)中所述過濾得到的糠醛渣中和濾液進行適應性培養。適應性培養條件為每kg活菌加入15L糠醛渣中和濾液，使乳酸菌或酵母在發酵使用前提前適應含抑制物發酵液環境。所述乳酸菌的適應性培養的條件為培養溫度為30-32°C，培養時間為32_45h，pH 值 6. 0-6. 5，培養基組成KH2PO4 O. 5g/l, MgSO4 · 7Η200· 5g/l, NaCl O. lg/1,固體 CaCO32% (w/v)，糠醛渣中和濾液。所述酵母的適應性培養的條件為培養溫度為30_32°C，培養時間為18_24h，pH值
4.5-6. 0，培養基組成=KH2PO4O. 5g/l，MgSO4 · 7H200. 5g/l，糠醛渣中和濾液。
所述纖維素酶水解促進劑的活性組分主要是低分子量的蛋白質或肽類物質，通過酸熱處理可使大分子酵母蛋白降解為低分子量物質。本發明的有益效果(I)本發明酶水解促進劑原料酵母價格低廉，來源廣泛，其能從工業廢棄資源中獲得。(2)本發明酶水解促進劑製備工藝簡 單，易於實現，和現有工業具有良好兼容性。(3)本發明酶水解促進劑能明顯提高酶水解效率。(4)本發明酶水解促進劑具有良好的生物兼容性，其加入基本對後期生物轉化無抑制作用。(5)本發明酶水解促進劑能同時作為發酵微生物優良的營養源，其能取代合成培養基，大大降低發酵培養基的成本。(6)本發明原料酵母含有一定量的多糖(約20%)，同樣能為生物轉化過程提供碳源，實現酵母組分的全利用。(7)本發明原料可降低酶水解木質纖維原料過程酶消耗，提高酵母中葡聚糖的利用，同時較大程度降低下遊轉化過程化學品的消耗。


圖I為本發明的工藝流程。
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。質量體積比(w/v)為g/Ι，工業糠醛渣購自河北春蕾集團，含水量55飛0%，pH值2 3。擬康氏木黴菌購自中國工業微生物保藏管理中心。酵母為耐高溫型安琪活性乾酵母，乳酸菌為嗜熱乳桿菌，均為市售商品。實施例II、糠醛渣預處理脫毒過程向10%的糠醛渣水溶液中加入固體NaOH調pH5，攪拌O. 5h後，進行過濾，得糠醛渣濾渣，濾渣含水量80 85%。2、I)製備纖維素酶水解促進劑按照6% (w/v)的比例將純酵母加入水中，調節pH值為7. O,攪拌IOmin使酵母分散均勻，之後對酵母溶液進行加熱處理，處理溫度121°C ;處理時間10min，處理液備用。2)製備纖維素酶將在2%糠醛渣固體培養基(4g糠醛渣+200ml Mandels營養鹽+4g瓊脂)上培養好的擬康氏木黴菌種的孢子用無菌生理鹽水稀釋至孢子懸浮液的濃度為IX IO8個/mL，將5mL孢子懸浮液接種到含50mL糠醛渣的液體產酶培養基(馬鈴薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然)的250mL的燒瓶中，並在32°C下，轉速150r/min，pH4. 8條件下放入恆溫培養振蕩器中培養15天得到。3、糖化處理後的糠醛渣濾渣經過滅菌裝入糖化罐，糖化條件為3%糠醛渣濾渣(w/v)，纖維素酶用量12FPU/g糠醛渣濾渣，加入纖維素酶水解促進劑濃度為10g/l，加水至酶水解體系1L，糖化溫度為45°C，糖化時間48h。實施例2步驟同實施例1，不同之處在於纖維素酶水解促進劑濃度為20g/l。實施例3步驟同實施例1，不同之處在於纖維素酶水解促進劑濃度為30g/l。實施例4步驟同實施例1，不同之處在酵母溶液進行加熱處理的處理時間60min。實施例5 (對照例) 步驟同實施例1，不同之處在糖化步驟中未加纖維素酶水解促進劑。實施例6I、糠醛渣預處理脫毒過程向10%的糠醛渣水溶液中加入固體NaOH至pH6，攪拌O. 5h後，進行過濾，得糠醛渣濾渣。濾液用於乳酸菌的適應性培養，培養時每公斤活菌加入15L糠醛渣中和濾液。2、I)纖維素酶水解促進劑按照6% (w/v)的比例將酵母廢棄物加入水中，調節pH值為7.0，攪拌IOmin使酵母分散均勻，之後對酵母溶液進行加熱處理，處理溫度121°C;處理時間30min，離心，取輕相部分得到處理液備用。2)製備纖維素酶同實施例I。3)乳酸菌適應性培養培養溫度為32°C，培養時間為36h，pH值6. 0，培養基組成KH2PO4 O. 5g/l，MgSO4 · 7H20 O. 5g/l，NaCl O. lg/1,固體 CaCO3 2%(w/v)，糠醛渣中和濾液。3、分步糖化發酵處理後的糠醛渣濾渣經過滅菌裝入糖化罐，糖化條件為5%糠醛渣(w/v)，不加發酵培養基，加固體CaC035%(w/v)，纖維素酶用量15FPU/g糠醛渣濾渣，加入纖維素酶水解促進劑濃度為10g/l，加水至酶水解體系1L，糖化溫度為45°C，糖化時間48h。加入適應性培養過的乳酸菌，乳酸菌接種濃度I. 25g/l，溫度為42°C，發酵72h，pH值5. 5，進行發酵。實施例7I、糠醛渣預處理脫毒過程向10%的糠醛渣水溶液中加入固體NaOH至pH6，攪拌O. 5h後，進行過濾，得糠醛渣濾渣。濾液用於乳酸菌的適應性培養，培養時每公斤活菌加入15L糠醛渣中和濾液。2、I)纖維素酶水解促進劑按照6% (w/v)的比例將酵母廢棄物加入水中，調節pH值為2.0，攪拌IOmin使酵母分散均勻，之後對酵母溶液進行加熱處理，處理溫度121°C;處理時間30min，離心，取輕相部分得到處理液備用。2)製備纖維素酶同實施例I。3)乳酸菌適應性培養培養溫度為32°C，培養時間為36h，pH值6. 0，培養基組成KH2PO4 O. 5g/l，MgSO4 · 7H20 O. 5g/l，NaCl O. lg/1,固體 CaCO3 2%(w/v)，糠醛渣中和濾液。3、分步糖化發酵處理後的糠醛渣濾渣經過滅菌裝入糖化罐，糖化條件為9%糠醛渣(w/v)，不加發酵培養基，加固體CaC035%(w/v)，纖維素酶用量15FPU/g糠醛渣濾渣，加入纖維素酶水解促進劑濃度為10g/l，加水至酶水解體系1L，糖化溫度為47°C，糖化時間96h。加入適應性培養過的乳酸菌，乳酸菌接種濃度I. 25g/l，溫度為42°C，發酵72h，pH值5. 5，進行發酵。實施例8 (對照例)步驟同實施例6，不同之處在於未加纖維素酶水解促進劑。實施例9 (對照例)步驟同實施例6，不同之處在於未加纖維素酶水解促進劑，步驟3中加入發酵培養基，成分=KH2PO4 O. 5g/l ；MgS04 · 7H20 O. 5g/l ；NaC10. lg/1 ;牛肉膏 5g/l。實施例10I、糠醛渣預處理脫毒過程同實施例6。2、1)纖維素酶水解促進劑按照6% (w/v)的比例將純酵母加入水中，調節pH值 為7. 0，攪拌IOmin使酵母分散均勻，之後對酵母溶液進行加熱處理，處理溫度121°C;處理時間30min,處理液備用。2)製備纖維素酶同實施例6。3)乳酸菌適應性培養同實施例6。3、葡萄糖發酵67g/l葡萄糖(w/v),加入適應性培養過的乳酸菌,加固體CaCO370g/l，加入纖維素酶水解促進劑濃度為10g/l，乳酸菌接種濃度I. 25g/l，溫度為42°C，發酵96h，pH值5. 5，進行發酵。實施例11步驟同實施例9,不同之處在於酵母加熱處理時間30min。實施例12步驟同實施例9,不同之處在於酵母加熱處理時間60min。實施例13步驟同實施例9，不同之處在於酵母加熱處理溫度100°C。實施例14 (對照例)步驟同實施例9，不同之處在於未加纖維素酶水解促進劑。實施例15 (對照例)步驟同實施例9，不同之處在於，未加纖維素酶水解促進劑，在步驟3中加入發酵培養基，成分=KH2PO4 O. 5g/l ；MgS04 · 7H20 O. 5g/l ；NaCl 0. lg/1 ;牛肉膏 5g/l。實施例16纖維素酶活性分析1、3%糠醛渣的酶水解生產葡糖糖，如表I。表I 3%糠醛渣酶水解的葡萄糖產量
權利要求
1.一種纖維素酶水解促進劑，其特徵在於，將酵母或酵母廢棄物加入到水中，混勻，調PH值，加熱處理得到。
2.根據權利要求I所述的纖維素酶水解促進劑，其特徵在於，所述調PH值為2.0-7. 5 ；所述加熱處理的處理溫度為100-121°C，處理時間為5-60min。
3.一種提高纖維素酶水解效率的方法，其特徵在於，在纖維素原料中加入權利要求I或2所述的纖維素酶水解促進劑、纖維素酶進行酶水解。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)纖維素原料處理對糠醛渣水溶液進行鹼中和、過濾，得到糠醛渣濾渣； 2)糖化加入所述纖維素酶水解促進劑、纖維素酶進行酶水解，得酶水解液。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟2)中所述糖化的條件糠醛渣濾渣濃度3 9% (w/v),纖維素酶用量12-15FPU/g糠醛渣濾渣，纖維素酶水解促進劑濃度IOg/l-30g/l，糖化溫度為45-47°C，糖化時間48-96h。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟2)中所述纖維素酶由擬康氏木黴經適應性培養得到。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，擬康氏木黴經適應性培養的條件 1)在2%糠醛渣固體培養基上培養擬康氏木黴菌種的孢子； 2)將孢子用生理鹽水稀釋； 3)將孢子懸浮液接種到含糠醛渣的液體產酶培養基中培養； 所述2%糠醛渣固體培養基為4g糠醛渣、200ml Mandels營養鹽和4g瓊脂；所述液體產酶培養基為馬鈴薯汁1L，葡萄糖10g，pH自然。
8.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，酶水解液進一步加入酵母生產乙醇或乳酸菌生產乳酸。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述酵母或乳酸菌經步驟I)中所述過濾得到的糠醛渣中和濾液適應性培養，配比為15L濾液1kg活菌。
10.權利要求I所述纖維素酶水解促進劑在提高纖維素酶水解效率中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種纖維素酶水解促進劑及其應用。所述纖維素酶水解促進劑是將酵母或酵母廢棄物加入到水中，混勻，調pH值，加熱處理得到。本發明的纖維素酶水解促進劑製備工藝簡單，易於實現，和現有工業具有良好兼容性，能明顯提高酶水解效率，具有良好的生物兼容性，能同時作為發酵微生物優良的營養源，其能取代合成培養基，大大降低發酵培養基的成本，所用原料酵母價格低廉，來源廣泛，能為生物轉化過程提供碳源。本發明方法可降低酶水解木質纖維原料過程酶消耗，提高酵母中葡聚糖的利用，同時較大程度降低下遊轉化過程化學品的消耗。
文檔編號C12R1/885GK102796718SQ20121028305
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月9日 優先權日2012年8月9日
發明者蔣建新, 唐勇, 趙鵬翔, 朱莉偉 申請人:北京林業大學