氧化水解酶基因BtLPMO10A及氧化水解酶與應用
2023-07-20 01:33:11 2
氧化水解酶基因BtLPMO10A及氧化水解酶與應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種新型氧化水解酶化LPM010A的基因序列（來源於蘇雲金芽抱桿菌 庫斯塔克亞種ACCC 10066)及其編碼的氧化水解酶的製備方法和應用（Pr巧aration and application of a novel lytic polysaccharide monooxygenase)。本發明還提供了該氧 化水解酶的重組質粒和重組基因工程菌株。本發明設及的氧化水解酶化LPMOIOA可應用在 生物能源、綠色農業、健康食品及生物醫藥等領域。
【背景技術】
[0002] 幾下質是一種主要來源於海洋郵蟹殼、昆蟲外殼等的等難溶性天然多糖，幾下質 的高效生物降解在生物能源、綠色農業、生物醫藥、材料化工等領域具有重要的意義。目前 可用於幾下質生物降解的酶主要為糖巧水解酶，從其催化反應模式上又可分為=類：內切 型糖巧水解酶、外切型糖巧水解酶、二糖水解酶。到目前為止，已有大量的關於運些糖巧水 解酶的報導，然而由於運些難溶性天然多糖的晶體結構難W被破壞，致使糖巧水解酶的催 化效率較低。2010年挪威生命科學大學的團隊首次報導了一種來自粘質沙雷氏菌的幾下質 氧化水解酶（SmCBP21)，該酶可催化位於幾下質糖鏈Cl位上的氧化反應，生成具有不同聚 合度的糖酸，該酶可W通過氧化破壞幾下質表面的晶體結構，輔助幾下質酶高效降解幾下 質。對於該類酶的新發現和深入研究對於實現幾下質等多糖物質的生物轉化具有重要的意 義。
【發明內容】
[0003] 本發明的第一個目的是提供一種新型氧化水解酶化LPM010A及其編碼基因。
[0004] 本發明的第二個目的是提供一種製備新型氧化水解酶化LPM010A的方法。 陽0化]本發明的第S個目的是提供含有所述的新型氧化水解酶化LPM010A基因的基因 工程表達體系。
[0006] 本發明的第四個目的是提供新型氧化水解酶化LPM010A在多糖降解中的應用。
[0007] 本發明所提供的新型氧化水解酶化LPM010A，來源於蘇雲金芽抱桿菌庫斯塔克亞 種菌株（購於中國農業微生物菌種保藏管理中屯、，編號為ACCC 10066)，其胺基酸序列具有 如下特徵之一：
[0008] 1)序列表SEQ ID NO. 2中的胺基酸殘基序列；
[0009] 2)將序列表SEQ ID NO. 2中的胺基酸殘基序列經過胺基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加後，具有降解多糖活性的蛋白質；
[0010] 3)與序列表SEQ ID NO. 2中所限定的胺基酸序列的同源性達到90%及W上且具 有降解多糖活性的蛋白質。
[0011] 本發明還提供了新型氧化水解酶化LPM010A的編碼基因（命名為化LPM010A)，具 有下述核巧酸序列特徵之一： 陽01引 1)具有序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸值NA)序列；
[0013] 2)編碼SEQ ID NO. 2胺基酸序列的脫氧核糖核酸值NA)序列；
[0014] 扣具有與序列表中SEQ ID NO. 1所限定的脫氧核糖核酸值NA)序列的同源性達到 90%及W上，且能編碼降解多糖的蛋白質的脫氧核糖核酸值NA)序列。
[0015] 本發明的氧化水解酶化LPM010A的胺基酸序列及其核巧酸編碼序列也可W根據 預測的化LPM010A的胺基酸序列及其核巧酸編碼序列人工合成獲得。
[0016] 製備重組酶化LPM010A的方法，是將編碼基因化LPM010A克隆入重組表達載體，導 入宿主細胞，獲得重組表達的氧化水解酶。
[0017] 所述的重組表達氧化水解酶化LPM010A的表達載體可W是大腸桿菌表達載體、酵 母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈黴菌表達載體、隧菌體載體、絲狀真菌 表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體等。
[0018] 用於重組表達氧化水解酶化LPM010A的重組菌或轉基因細胞系，可W是大腸 桿菌宿主細胞（如 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli D冊 a 等）、酵母菌宿主細胞（如 Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、 Kluyveromyces Iactis 等）、枯草桿菌宿主細胞（如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細胞（如 Lactic acid bacteria COCCIOI 等）、放線菌 宿主細胞（如Streptomyces spp.等）、絲狀真菌宿主細胞（如I'richoderma viride、 Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細胞（女日 Bombyx mo;ri、Antharaea eucalypti等）或哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢細胞CHO、幼小 倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等）。
[0019] 本發明提供的氧化水解酶化LPM010A對於幾下質具有較強的結合能力，可氧化水 解幾下質等多糖物質，可輔助多糖水解酶提高多糖的降解效率。
[0020] 本發明提供的氧化水解酶化LPM010A可廣泛應用於化工、農業、食品、飼料添加和 醫藥等領域，具有較大的生產潛力和經濟價值。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :氧化水解酶化LPM010A的蛋白表達及純化的聚丙締酷胺凝膠電泳圖 (SDS-PAGE)。各泳道加入的樣品分別是：泳道M :蛋白質標識物（marker);泳道1 :發酵液上 清，上樣量10 y 1，泳道2 :5 y g純化後的化LPM010A。
[0022] 圖2 :氧化水解酶化LPM010A的底物結合實驗。a為上清中未與底物結合的蛋白，電 泳實驗的上樣量為10yL;b為沉澱中與底物結合的蛋白。CK，對照度tLPMOlOA+緩衝液）； 1，化LPM010A+a -幾下質粉末；2, BtLPMOlOA+0 -幾下質粉末；3, BtLPMOlOA+微晶纖維素； 4,化LPMOIOA+a -膠體幾下質；5, BtLPMOlOA+幾下質珠。
[0023] 圖3 :氧化水解酶化LPM010A的酶解產物分析。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1蘇雲金芽抱桿菌庫斯塔克亞種的培養及其基因組DNA的提取
[00巧]蘇雲金芽抱桿菌庫斯塔克亞種菌株（購於中國農業微生物菌種保藏管理中屯、，編 號為ACCC 10066)的單克隆接種到IOml液體LB培養基中，接著放入溫度為30°C，轉數為 15化pm的搖床培養16個小時，取3ml菌液，離屯、收集菌體，用於基因組DNA的提取。基因組 DM的提取與純化方法按照試劑盒說明書操作完成。
[0026] 實施例沈tLPMOlOA基因在大腸桿菌中的重組表達
[0027] W蘇雲金芽抱桿菌庫斯塔克亞種ACCC 10066基因組DNA為模板，用下述引物對進 行PCR擴增。引物設計如下：
[0028] IES 引f勿 P-F :5，一C邑Ct邑ccca邑CC邑邑C邑at邑邑cccat邑邑atat邑ta邑aatcacca邑C邑_3，；
[0029] 反向引物 P-R :5, -gctttgttagcagccggatctcaaaatagtgtaggagtttgcatacg-3，；聚 合酶PrimeSTAR購自寶生物公司，PCR反應體系按照公司提供的產品說明操作。PCR反應條 件：94°C預變性5分鐘，然後94°C變性30sec-50°C退火30sec-72°C延伸lmin，30個循環， 最後72°C延伸lOmin。PCR反應結束後將PCR產物作為引物，W祀T2化質粒作為載體，按照 上述PCR擴增條件進行二次PCR擴增，所得PCR產物利用化nl進行過夜處理，並進行瓊脂 糖凝膠電泳和DNA測序驗證。
[0030] 驗證成功的帶有目的基因的載體電轉至大腸桿菌ToplO中，37°C培養12h，挑取單 克隆；將單克隆接入含有50 Ji g/ml氨節西林的液體Luria-Bertani培養基中培養，提取質 粒；將質粒用正向引物和反向引物進行菌落PCR驗證，結果得到大小正確的擴增產物，初步 證明構建的重組質粒正確；接著將該重組質粒送去大連寶生物工程有限公司測序，結果表 明，在祀T-22b的信號膚末端和終止密碼子之間插入SEQ ID NOl所示的化LPM010A基因， 且插入方向正確，所W進一步證明構建的重組質粒正確。
[0031] 將上述重組質粒轉化大腸桿菌菌株化21 0E3)(購自美國Novagen公司），然後按 照該公司提供的操作步驟進行氧化水解酶化LPM010A的誘導表達及純化，結果如圖1所示， 氧化水解酶化LPM010B的表達成功，且主要W可溶的形式分布於周質空間中，經過幾下質 親和層析純化後的氧化水解酶化LPM010A在電泳膠上呈單一條帶，分子量大小為19kDa，與 通過胺基酸序列預測的分子量一致。
[0032] (1) SEQ ID No: 1的信息（參見序列表） 陽〇3引 （a)序列特徵
[0034] *長度：561個鹼基對 齡35] *類型：核酸
[0036] *鏈型：雙鏈
[0037] *拓撲結構：線性
[0038] 化）分子類型：DNA
[0039] (C)假設杏
[0040] (d)反義杏
[0041] (e)最初來源：蘇雲金芽抱桿菌庫斯塔克亞種菌株ACCC 10066
[0042] (f)與核巧酸序列相關的特徵關鍵詞：為"氧化水解酶" 陽0創 似SEQ ID NO 2:的信息（參見序列表） 柳44] (a)序列特徵：
[0045] *長度：187個胺基酸殘基 陽046] *類型：蛋白
[0047] *結構：包含1個AAlO家族氧化水解酶結構域 W48] 化）分子類型：蛋白質
[0049] (C)假設杏
[0050] (d)反義杏
[0051] (e)最初來源：蘇雲金芽抱桿菌庫斯塔克亞種菌株ACCC 10066 陽0巧 序列表
[0053]沈Q ID NO. 1
[0057] 實施例3氧化水解酶化LPMOIOB的生化特性分析
[0058] (1)多糖結合能力分析
[0059] 氧化水解酶化LPM010A與各種多糖的結合實驗按W下條件進行：在1. 5ml的 Eppendcxrf管中將5mg各種不同多糖與0. 5mg純化後的氧化水解酶化LPM010A混合，反應 終體積通過20mM、抑8. 0的化is-HCl緩衝液定容為1ml。酶與底物的結合在室溫下進行 24小時，為了讓酶與多糖更好的結合，利用畑-II旋轉混合儀（寧波新芝公司）。結束後， 通過離屯、分別收集上清和沉澱，再利用SDS-PAGE電泳檢測。結果如圖2所示，氧化水解酶 化LPM010A與晶體性質的幾下質（a -幾下質和0 -幾下質）具有較強的結合能力，而與晶 體幾下質（幾下質珠和膠體幾下質）結合能力較弱，與微晶纖維素的結合能力幾乎無法觀 測到。
[0060] (2)酶反應產物分析 陽061] 為了分析酶反應產物，將氧化水解酶化LPMOIOAQ y M)，抗壞血酸（ImM)和0 -幾 下質（2. Omg/ml)混合在一起，反應總體積通過抑8. 0,20mM化is-肥1緩衝液定容為1ml。 反應在30°C進行2地。產物通過MLTI T0F/T0F MS進行分析（如圖3)。結果表明氧化水 解酶化LPM010A能氧化水解晶體幾下質，產生聚合度為4-10的幾下寡糖糖酸，且偶數聚合 度的糖酸呈現優勢分布。
【主權項】
1. 一種氧化水解酶基因 BtLPMOlOA，其核苷酸序列具有如下特徵之一： 1) 具有序列表中SEQ ID NO. 1的脫氧核糖核酸（DNA)序列； 2) 編碼SEQ ID NO. 2胺基酸序列的脫氧核糖核酸（DNA)序列； 3) 具有與序列表中SEQ ID NO. 1所限定的脫氧核糖核酸（DNA)序列的同源性達到90% 及以上，且能編碼降解多糖的蛋白質的脫氧核糖核酸（DNA)序列。2. -種權利要求1所述的氧化水解酶基因編碼的氧化水解酶，其編碼的胺基酸序列具 有如下特徵之一： 1) 具有序列表中SEQ ID NO. 2的胺基酸序列； 2) 將序列表中的SEQ ID NO. 2的胺基酸殘基序列經過胺基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加後，具有降解多糖活性的蛋白質； 3) 與序列表中SEQ ID NO. 2所限定的胺基酸序列的同源性達到90%及以上且具有氧 化水解多糖活性的蛋白質。3. -種權利要求2所述的氧化水解酶的製備方法，其特徵在於：是將權利要求1所述 的氧化水解酶基因克隆入重組表達載體，導入宿主細胞，獲得重組表達的氧化水解酶； 所述的重組表達氧化水解酶的表達載體，是指大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草 桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈黴菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載體、植物表 達載體、昆蟲表達載體、或哺乳動物細胞表達載體。4. 按照權利要求3所述的方法，其特徵在於：用於重組表達氧化水解酶的重組菌或轉 基因細胞系，是指大腸桿菌宿主細胞（如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM 109、Escherichia coli DH5a 等）、酵母菌宿主細胞（如 Saccharomyces cerevisiae、 Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等）、枯草桿菌宿主細胞（如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主細胞（如 Lactic acid bacteria C0CC101 等）、放線菌宿主細胞（如Streptomyces spp.等）、絲狀真菌宿主細胞（如Trichoderma viride、Trichoderma reesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆蟲細胞 (如Bombyx mori、Antharaea eucalypti等），哺乳動物細胞（如中國倉鼠卵巢細胞CHO， 幼小倉鼠腎臟細胞BHK、中國倉鼠肺細胞CHL等）中的一種。5. -種權利要求2所述的氧化水解酶在多糖氧化水解中的應用，其特徵在於：具有如 下用途之一或二種以上； 1) 氧化水解幾丁質、殼聚糖、纖維素、半纖維素、澱粉等多糖物質中的一種或二種以上， 可用於功能性寡糖產品的生產或生物質轉化生產燃料乙醇； 2) 通過氧化水解真菌細胞壁多糖的方式抑制真菌病害，可用於生物農藥或生物醫藥的 製備； 3) 根據其強大的多糖結合能力，可作為多糖類物質的識別分子。
【專利摘要】本發明公開了一種氧化水解酶基因及其編碼的氧化水解酶的製備與應用。本發明所涉及的氧化水解酶BtLPMO10A基因來源於蘇雲金芽孢桿菌庫斯塔克亞種(ACCC 10066)。本發明還提供了一種製備氧化水解酶BtLPMO10A的方法，即利用基因工程的技術方法，將該酶的基因克隆到大腸桿菌表達載體上，獲得可表達該酶的大腸桿菌重組菌株，用該工程菌株表達製備的氧化水解酶BtLPMO10A對不溶性幾丁質具有較強的結合能力，可氧化水解多糖物質產生具有不同聚合度的糖酸。本發明提供的氧化水解酶BtLPMO10A可輔助多糖水解酶，提高多糖的水解效率。
【IPC分類】C12N15/53, C12P19/14, A01P3/00, A01N63/02, C12N15/70, C12N9/02
【公開號】CN105713912
【申請號】CN201410719898
【發明人】趙勇, 尹恆, 王文霞, 張卉妍
【申請人】中國科學院大連化學物理研究所