用來測定激酶的活性的方法、顆粒和試劑盒的製作方法

2023-07-20 14:54:31

專利名稱：用來測定激酶的活性的方法、顆粒和試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明一般涉及用來測定一種或多種激酶的活性的方法和組合物(例
如顆粒和試劑盒(kit))，更具體來說，本發明涉及在多重(multiplex)法中， 使用螢光檢測測定與顆粒結合的一種或多種激酶的一種或多種活性的方法 和組合物。
2. 現有技術描述
以下涉及的描述和實施例雖然包括在該背景部分中，但是並非因此承 認其為現有技術。
蛋白激酶對活的生物體內的細胞內信號傳導的調節具有重要意義，在
自然界中很容易產生。例如，在人類基因組中存在超過500種蛋白激酶和
超過500,000種人類磷酸化位點。蛋白酶可以寬泛地定義為催化磷酸酯從
三磷酸腺苷(ATP)轉化為胺基酸殘基的酶。蛋白質磷酸化的非正常表達可能
與活的生命體、特別是人類體內的一些疾病和惡性腫瘤相關。因此，通過
對蛋白激酶活性進行監控，可能有益於檢測疾病和惡性腫瘤和/或鑑別用於
治療疾病和惡性腫瘤的治療藥劑(即用來促進或抑制活生物體內的蛋白激
酶活性的治療藥劑)。
對微陣列技術領域的技術人員來說顯而易見的是，如果能夠迅速地確 定在化學和生物被分析物中是否存在分析物以及/或者測定分析物的濃度，
將會是有益的。另外(或者)，如能同時對多種分析物進行檢測，也將是有 益的。在本文中，將同時檢測單獨樣品中的多種分析物的操作稱為多重法 方案(multiplexing scheme)。用來測定激酶活性的常規技術通常不適於高產 量篩選和/或多重試驗。具體來說，許多用來測定激酶活性的常規技術使用 放射性同位素，依賴於液相色譜和/或質譜進行分析，因此不適於快速檢測。另外，這些方法無法連續監測激酶活性，因此無法精確測定激酶活性。其 它用來測定激酶活性的技術包括昂貴的特異化的生物試劑，例如磷酸肽-特 異化抗體。 一般來說，基於抗體的微陣列會產生大量的假陽性和假陰性， 這是因為抗體具有無法預期的交叉反應性。因此，基於抗體的激酶活性技 術通常不適用於高通量的篩選和/或多重試驗。另外的測定激酶活性的方法 使用螢光敏化劑，其在磷酸化的時候發生構象變化。但是用於常規試驗的 大多數螢光敏化劑在磷酸化的時候表現出非常有限的螢光變化，這限制了 其實用性。
因此，如果能夠開發一種新的、特別是適於高通量篩選和/或多重的試 驗方法、顆粒和試劑盒來測定被分析物中的激酶活性，將會是非常有益的。

發明內容
以下對於用來測定激酶活性的方法、顆粒和試劑盒的各種實施方式的 描述決不會以任何方式構成對所附權利要求的主題的限制。
用來處理顆粒的方法的一個實施方式包括使得螢光顆粒接觸被分析 物，所述螢光顆粒包括載體基質以及通過所述載體基質的官能團與所述載
體基材連接的肽底物(peptide substrate),所述載體基質包含一種或多種熒 光材料。該方法還包括在使得所述螢光顆粒接觸被分析物的過程中對所述 肽底物進行磷酸化，然後對所述螢光顆粒進行處理，使得所述肽底物去磷 酸化，在脫去磷酸化的位點產生極化的碳-碳雙鍵(在下文中稱為極化的雙 鍵)。另外，該方法包括通過所述極化的雙鍵將包含親核性端基的螢光指示 劑(reporter)與所述螢光顆粒連接。
顆粒的一個實施方式包括包含一種或多種螢光材料的載體基質，以 及通過所述載體基質的官能團與所述載體基質連接的肽底物。
用來測定樣品內的激酶活性量的試劑盒的一個實施方式包含大量螢光 顆粒以及一種或多種激酶特異性的肽底物。所述大量的螢光顆粒各自包括 載體基質，所述載體基質包含一種或多種設計用來發射在第一波長範圍的 螢光的螢光材料。
用來測定樣品中激酶活性量的方法的一個實施方式包括使得螢光顆粒的不同亞組的集合群體接觸所述樣品。所述螢光顆粒中的至少一部分包含 載體基質，該載體基質包含設計成能發射第一波長範圍內的螢光的一種或 多種螢光材料，所述螢光顆粒的不同亞組中的至少一部分分別包含一種或 多種螢光材料的不同構型。另外，至少一部分的所述螢光顆粒包含通過所 述載體基質的官能團與所述載體基質連接的肽底物，所述螢光顆粒的不同 亞組中的至少一部分分別包含不同的肽底物。所述方法還包括對所述樣品 和所述集合群體進行磷酸化處理，所述磷酸化處理用來為所述肽底物的接
收殘基添加磷酸基團(phosphate group)。
另外，所述方法包括隨後對大量所述螢光顆粒進行處理，使得如果所 述大量螢光顆粒中存在任何磷酸化的肽底物，則所述磷酸化的肽底物會去 磷酸化，在所述肽底物的脫去磷酸化的位點生成極化的雙鍵。另外，所述 方法包括對所述大量螢光顆粒進行進一步處理，使得如果所述肽底物的脫 去磷酸化的位點存在任何極化的雙鍵，則螢光指示劑會通過其親核性端基 在所述極化雙鍵的位置與所述螢光顆粒連接。這些螢光指示劑設計成用來 發射在不同於所述第一波長範圍的第二波長範圍內的螢光。該方法還包括 隨後測量所述大量螢光顆粒的螢光發射，根據測定的在所述第一波長範圍 內的螢光發射來確定樣品中顆粒的亞組類別。另外，該方法包括在所述樣 品和集合群體經受所述脫去磷酸工藝處理的時候，根據是否存在測定的第
二波長範圍內的螢光發射，確定樣品中激酶活性量。 附圖簡述
結合附圖，通過以下對本發明優選實施方式的詳述，本領域技術人員
可以很明顯地看出本發明的其它益處，在附圖中


圖1顯示了用來對螢光顆粒進行處理以進行激酶檢測的方法的流程
圖2顯示了使用多重試驗的方案測量樣品內的激酶活性的方法的流程圖。
儘管本發明可以進行各種改變和採用替代形式，但在附圖以示例的方 式顯示了本發明的特定實施方式，並在本文中詳細描述。附圖可能不是按照比例繪製的。但是應當理解，附圖和詳述並不是將本發明的範圍限制在所 揭示的特定形式，本發明應包括所附權利要求書定義的本發明範圍內的所 有變化、等同形式和替代形式。
優選實施方式的詳細描述
一般來說，在本文中，術語"顆粒"應表示任意用來對化學和生物被 分析物進行分析的基材，可具體表示用來提供和/或支持相關分析物(包括 但不限於激酶活性)的定性和/或定量的分子反應的物體。另外，術語"顆 粒"可表示具有很寬的粒度範圍的顆粒，包括但不限於尺寸約為1納米至
300微米的物體。因此，術語"顆粒"應表示大量不同的材料和構型，包括但 不限於微球體、珠粒、聚苯乙烯珠粒、微型顆粒、金納米顆粒、量子點 (quantum dot)、納米點、納米顆粒、複合顆粒(例如金屬-聚合物顆粒或磁性 -聚合顆粒)、納米殼體、納米棒、納米管、納米珠粒、膠乳顆粒、膠乳珠粒、 螢光珠粒、螢光顆粒、彩色顆粒、彩色珠粒、組織、細胞、微生物、孢子、 有機物、任意非有機物或者它們的任意組合。因此，在本文中，任意的所 述術語均可與術語"顆粒"互換地使用。
參見附圖，圖1中顯示了用來對螢光顆粒進行處理，以進行激酶檢測 的方法的流程圖。如圖1所示，所述方法可包括框IO，其中使得螢光顆粒 接觸被分析物。所述被分析物可以是生物被分析物或化學被分析物。框io 顯示，所述螢光顆粒包括含有一種或多種螢光材料的載體基質，以及通過 所述載體基質的官能團與所述載體基質連接的肽底物。如上所述，在本文 中，術語"顆粒"可表示任何用於對化學被分析物和生物被分析物進行分析 的基質，因此術語"螢光顆粒"可包括包含一種或多種光致發光材料(例如熒 光團、螢光染料或其它螢光材料)的這些基質中的任何一種。儘管關於螢光 染料描述了實施方式，但是應當理解，本文所述的這些實施方式可以利用 任意的光致發光材料(例如螢光團或量子點)。所述光致發光材料可以結合 入所述載體基質中和/或連接於所述載體基質的表面。在一些實施方式中， 可以特別有益地使得所述載體基質交聯，以便將多種光致放光材料結合入 所述載體基質內。這些實施方式特別適用於多重的試驗，使得顆粒的分類可達到等於或大於100的量級。所述螢光顆粒的載體基質可以包含任意的
用於對化學被分析物和生物被分析物進行分析的材料，包括但不限於聚苯 乙烯、金屬或芯-殼材料的複合體。
如上所述，除了包含一種或多種螢光材料的所述螢光顆粒的載體基質
以外，所述螢光顆粒包含通過所述載體基質的官能團(例如COOH, NH2, OH等)與所述載體基質連接的激酶底物。更具體來說，所述螢光顆粒可以 包含與所述載體基質連接的激酶特異性肽底物，在一些情況下，所述激酶 特異性肽底物通過共價鍵與所述載體基質連接。在此情況下，肽底物可能 如圖1的流程圖中的框12所述容易發生磷酸化。具體來說，圖1中的框12 說明該方法包括在所述螢光顆粒與被分析物接觸的步驟中使得肽底物磷酸 化。這樣的磷酸化過程可以在存在ATP以及激酶的情況下進行。所述激酶 可能很容易地從樣品中得到，或者可以是加入的，用於進行所述磷酸化處 理。對於激酶特異性的決定因素尚未充分為人們所知，但是應當理解，肽 底物的絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸殘基周圍的胺基酸序列的基序以及所述底物 的三維結構都對該特異性有貢獻。
在任意的情況下，所述磷酸化過程可以在所述肽底物的絲氨酸、蘇氨 酸或酪氨酸殘基上觀察到。在一些實施方式中，所述磷酸化過程可以在存 在離子型液體的情況下進行。從理論上來說，離子型液體可以加快磷酸化 速率，縮短該方法的操作時間，並且/或者減少可能阻礙所述螢光顆粒後續 的操作(特別是下面對框14和16所述的操作)的副產物的產生。在一些情 況下，用來促進所述磷酸化過程的離子型液體可以通過微波加熱。 一般來 說，微波加熱可進一步提高磷酸化的速率。更具體來說，使用通過微波加 熱的離子型液體可以將完成所述磷酸化過程所需的時間從數小時縮短到數 分鐘。
在使得肽底物磷酸化之後，可以將所述螢光顆粒從所述樣品中移出， 使得所述螢光顆粒可以進行隨後的操作，以測定激酶活性(如下文詳細描 述)。在一些實施方式中，所述螢光顆粒的載體基質可以是磁性的，所述移 出的操作可包括施加磁場，在移出上清液的同時使顆粒固定不動。這樣的 實施方式可以有益地簡化從樣品中移出顆粒的過程，可能能夠因此避免耗時的過濾步驟。但是，在任意的其他的情況中，所述螢光顆粒的載體基質 可能不是磁性的，所述顆粒可以通過過濾移出。
再來看圖1中的框14，該方法包括對所述螢光顆粒進行處理，使得所 述肽底物脫去磷酸化，在肽底物脫去磷酸的位點產生極化的雙鍵。所述脫
去磷酸的過程可以通過鹼催化的l3-消除工藝進行。 一般來說，所述p-消除
工藝可使用任何足以催化所述工藝的鹼。鹼的例子包括但不限於氫氧化鈉
和氫氧化四甲基銨(TMA)。在一些情況下，可以有益地使用較弱的鹼(即pH 小於14的鹼)，例如TMA,已減少該過程產生的副產物的量。在一些實施 方式中，可以將離子型液體與較弱的鹼相結合，以進一步減少副產物的生 成。在另一個實施方式中，所述鹼和離子型液體可以通過微波加熱以加快 所述p-消除反應的速率。在任意的情況下，所述p-消除反應設計用來從肽 底物除去磷酸基團(phosphate gro叩)並用極化的雙鍵代替該磷酸基團。所 述極化的雙鍵可以稱為麥可受體，其可用於下文對框16的更詳細描述的 麥可加成反應。
如圖1所示，該方法包括框16，其中通過所述極化的雙鍵將包含親核 性端基的螢光指示劑與所述螢光顆粒連接。該反應一般稱為麥可類反應， 大體上可定義為親核原子加成到包含極化的雙鍵的化合物。包含親核原子 的化合物通常被稱為"麥可給體"，包含極化的雙鍵的化合物通常被稱 為"麥可受體"。如上所述，在對框14所述的卩-消去反應產生的極化的 雙鍵可以作為麥可受體。包含親核性端基的螢光指示劑可以作為麥可 給體，可與所述螢光顆粒的極化的雙鍵反應，使得螢光指示劑通過所述親 核性端基與所述螢光顆粒相連。上面對框12描述的磷酸化和p-消去步驟， 在一些實施方式中，將螢光指示劑與螢光顆粒相連的過程可以在存在離子 型液體的情況下進行，在一些實施方式中，可以在存在通過微波加熱的離 子型液體的情況下進行。通過採用離子型液體可以有益地減少連接過程中 副產物的生成，提高隨後的顆粒複合物的產率。另外，通過微波加熱可以 加快連接過程的反應速率，縮短生產時間。
一般來說，螢光指示劑可以包括以下化合物連有親核性端基的任意 光致發光材料(例如螢光團、螢光染料或其它螢光材料)。另外，所述親核性端基可包括任意的親核性基團，例如但不限於巰基和氨基。在一些實施 方式中，可能需要在所述螢光指示劑中使用親水性螢光化合物，以確保以 後可以測量到強螢光信號。具體來說，試驗通常在水性介質中進行。如果 在水性介質中使用疏水性染料，則會發生猝滅，螢光信號會受到影響。在 一些實施方式中，巰基的存在會使得具有親水性，因此在一些情況下優選 巰基作為螢光指示劑的親核性端基。儘管在化學領域中對親水性化合物和 疏水性化合物的界定不夠明確，但是本文所述的親水性化合物可具體表示 為不會溶解在有機溶劑(例如乙酸乙酯)中的化合物。
除了具有親水性以外，所述螢光指示劑的螢光化合物還可以設計成在 不同於所述螢光顆粒的載體基質內的一種或多種螢光材料的波長範圍內發 射螢光。按照這種方式，載體結構和螢光指示劑中的不同螢光材料發射的 螢光互相不重疊。這樣的特徵對於使用載體結構內的螢光材料來區分樣品 內的顆粒的實施方式來說是特別有益的。更具體來說，螢光材料中的各種 螢光範圍可以在不影響對樣品中激酶活性檢測的前提下，區分待測樣品內 的不同顆粒類別。在一些情況下，所述螢光指示劑的螢光化合物可以設計
成在大於約500納米的波長範圍內發射螢光，這是因為許多被分析物包含 本徵螢光波長約小於450納米的分子。在一些實施方式中，試驗可能不會 設計成具有這樣的普遍性，因此在不同的應用中，螢光指示劑的螢光發射
的波長範圍可能會變化。例如，在一些實施方式中，所述螢光指示劑的熒 光化合物可以設計成發射在大約400-580納米的波長範圍的螢光。
在一些實施方式中，所述螢光指示劑可以包含位於所述親核性端基與 所述螢光化合物之間的一種或多種間隔基化合物。通過使用一種或多種間 隔基化合物，可以減輕對激酶活性劑檢測以及酶和底物之間的識別過程的 幹擾。在一些實施方式中，可以使用總共包含約1-25個原子的間隔基以在 親核性端基和螢光化合物之間提供足夠的間隔。在更具體的情況下，可以 使用總共包含約5-25個原子的間隔基化合物。注意在一些應用中，根據對 螢光顆粒和/或螢光指示劑的說明，可以使用總共包含大於25個原子的間 隔基化合物。下面列出了可以與用於螢光指示劑的螢光化合物一起使用的 包含親核性端基的一些間隔基化合物的例子。注意這些列舉是示例性的，而不會排除本文所述用於螢光指示劑的其它化合物。下面在可用於本文所 述方法的示例性螢光指示劑的列表中列出了間隔基化合物的其它例子。 麥可給體的例子
1)formula see original document page 14
2)formula see original document page 14
3.) formula see original document page 14
下面列出了可用於本文所述方法的一些螢光指示劑的例子。注意這些 列舉是示例性的，而不會排除用於本文所述方法的其它螢光指示劑。螢光指示劑的例子
formula see original document page 15
l.)指示劑染料一SA-
formula see original document page 15formula see original document page 15下面揭示了圖1所示的實施該方法的示例性方案。應當注意的是，該 歷程是示例性的，不應排除可用來對螢光顆粒進行處理以進行激酶檢測的 其它歷程。因此，本文所述的方法不一定僅限於下面所列的方案。如下文 所述，激酶特異性肽底物可以通過所述螢光顆粒的羧酸官能團與螢光顆粒 連接。如上面圖1中的框IO所示，本文所述的方法可用於包含其它官能團 的螢光顆粒。所述連接操作可以在存在乙基-二甲基氨基丙基-碳二亞胺 (EDC)和磺酸化的n-羥基琥珀醯亞胺的情況下進行，但是也可使用其他的 試劑。在將所述激酶特異性肽底物與所述螢光顆粒連接之後，可以在肽底 物上進行磷酸化過程。如所列的方案所述，所述磷酸化過程可以在存在激 酶和ATP的情況下進行，在一些情況下，存在離子型液體。在將磷酸基加入到所述肽底物之後，繼續進行p-消除步驟，在此步驟中，使得肽底物脫 去磷酸化，在肽底物脫去磷酸的位點產生極化的雙鍵。如上所述，這樣的P-消除步驟可以是鹼催化的，在一些實施方式中，還可在存在離子型液體的 情況下進行。如下面列出的歷程所示，所述極化的雙鍵可具有胺基酸-絲氨 酸。但是，本文所述的方法可以設計成產生其他的胺基酸殘基，例如氨基 酸蘇氨酸和酪氨酸。
在(3-消除過程之後，螢光指示劑通過極化的雙鍵與所述螢光顆粒連接。 下面的歷程列出了兩個示例性的用來將螢光指示劑與螢光顆粒連接的邁克
爾反應。 一種麥可反應包括通過醯胺鍵(CONH鍵)與一種或多種間隔基化 合物(稱為"間隔基")結合的螢光化合物(稱為"指示劑染料")。CONH 鍵是螢光化合物與一種或多種間隔基化合物連接形成的，具體來說是所述 螢光化合物的羧酸官能團與所述一種或多種間隔基化合物的胺基酸官能團 連接形成的。包含CONH鍵是示例性的，因此，本文所述的方法不一定限於 此。下列歷程中所述的其它麥可反應包括使得示例性的生物素取代的邁 克爾給體和抗生物素蛋白鏈菌素共軛的螢光化合物(稱為"指示劑染料") 與所述螢光顆粒連接。特別適合用於該反應的示例性的螢光化合物是藻紅 蛋白(PE)。但是，其它螢光化合物以及其它生物素取代的麥可受體可用 於本文所述的方法。image see original document page 17
由於圖1所示的方法，本文中描述了大量螢光顆粒。具體來說，由於 該方法的各個處理步驟，提供了大量不同的螢光顆粒構型。例如，提供了 一種顆粒，其包括包含一種或多種螢光材料的載體基質，以及通過所述
載體基質的官能團與所述載體基質連接的肽底物。在一些實施方式中，所 述肽底物可以設計成用於特定的激酶活性，例如用於圖1中框io所述的顆 粒。在其他的情況下，所述肽底物可以是磷酸化的肽底物，其通過圖1中 框12所示的磷酸化步驟製得。在其他的情況下，所述肽基材可以包含通過 圖1中的框14所述的操作步驟製得的麥可受體。另外，所述螢光顆粒可
以包含通過圖1中的框16所述的操作步驟製得的與肽底物連接的螢光指示 劑。所述螢光指示劑可以包括上面框16中所述的任意實施方式，出於簡潔 的目的，此處不再重複描述。除了圖1所示的方法以及所得的顆粒，還提供了用來進行圖1所示方 法的各種試劑盒。具體來說，提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含大量熒 光顆粒以及一種或多種激酶特異性肽底物。所述大量的螢光顆粒各自包括 載體基質，所述載體基質包含一種或多種設計用來在第一波長範圍發射熒 光的螢光材料。在一些情況下，所述一種或多種激酶特異性肽底物通過所 述載體基質的官能團與所述載體基質連接。在具體的實施方式中，所述一 種或多種激酶-特異性肽底物可以分別與所述大量螢光顆粒中的不同亞組 連接。在此情況下，可以對樣品中大量不同的激酶活性進行評價，從而激 酶活性的測定可以多重化。但是在其他的情況下，所述一種或多種激酶-特 異性肽底物與所述多種螢光顆粒隔離開。在這樣的實施方式中，在一些情 況下，所述試劑盒還可包含設計用來將所述一種或多種激酶-特異性肽底物 與所述載體基質的官能團相連接的試劑。在此形式中，所述試劑盒可以用
來製備具有圖1中的框IO所述特徵的顆粒。
在一些情況下，所述試劑盒還可包含磷酸化試劑，所述磷酸化試劑設 計用來使得所述一種或多種激酶-特異性肽底物磷酸化，以製備具有圖1中
的框12所示特徵的顆粒。另外，所述試劑盒還可包括|3-消除試劑，該(3-消除試劑設計用來使得所述一種或多種激酶-特異性肽底物脫去磷酸化，在 所述一種或多種激酶-特異性肽底物的脫去磷酸位點生成麥可受體，以制 得具有圖1中框14所述特徵的顆粒。另外，所述試劑盒可包括一種或多種 各自包含親核性端基和一種或多種螢光化合物的螢光指示劑試劑，以製備 具有圖1中的框16所述特徵的顆粒。所述螢光指示劑試劑的螢光化合物可 以包括上面框16中所述的任意實施方式，出於簡潔的目的，此處不再重複 描述。除了上述組分以外，本文所述的試劑盒可以設計成使得所述磷酸化 試劑、p-消除試劑和所述一種或多種螢光指示劑試劑中的至少一種包含離 子型液體。或者說，所述試劑盒可以設計成任意一種或多種所述試劑可以 在存在或不存在離子型液體的情況下使用。在任意的情況下，所述試劑盒 可以包含作為被分析物製備的標準的其它組分，例如但不限於螢光標記、 競爭分子、參比材料、洗滌緩衝劑、塑料器皿等。
如上所述，在圖2的流程圖中顯示了利用多重試驗的方案測定樣品中的激酶活性的方法。如圖2所示，所述方法可包括框20，其中螢光顆粒的 不同亞組的集合群體接觸樣品。所述樣品可包括任何其中有多種需要進行 分析的被測物的生物或化學被分析物。所述集合群體中的至少一部分螢光 顆粒包含載體基質和通過所述載體基質的官能團與所述載體基質相連接的 肽底物，所述載體基質包含一種或多種設計成在第一波長範圍內發射螢光 的螢光材料。這些顆粒可以與圖1的框10中所述的螢光顆粒相類似。
為了實施對樣品中的多種被測物進行檢測和/或定量的多重的方案；所 述螢光顆粒設計成可區分的組。在一些情況下，這些組由吸收入顆粒內和/ 或結合在顆粒表面上的螢光材料的不同種類和/或濃度來區別。因此，在一 些實施方式中，所述集合群體中的螢光顆粒的不同亞組中的至少一部分可 以分別包含所述一種或多種螢光材料的不同配置。在一個實施方式中，通 過在一組顆粒中以十種不同濃度使用兩種不同染料，得到了一百種可通過 螢光區別的顆粒類別。可通過增加染料的數量和/或不同的染料濃度來增加 顆粒的類別數量。在許多的情況下，設計用來分析數種被測物的試驗，例 如約包含一百種或更多不同被測物的試驗，使得在評價樣品的時候可以將 時間和工藝成本最小化。注意顆粒分類可以通過其他的方式(例如粒度)實 施，因此，圖2所述的方法不一定限於具有不同螢光材料配置的顆粒的亞
組。除了具有不同的分類參數以外，在一些情況下，所述螢光顆粒的不同 亞組中的至少一部分可以分別包含不同的肽底物。在此情況下，可以對樣 品中大量不同的激酶活性進行評價，從而可以在對樣品中的顆粒進行鑑別 時，使得激酶活性的測定多重化。
繼續來看框22，該方法包括對所述樣品和集合群體進行磷酸化過程， 所述磷酸化過程設計用來為肽底物的接受殘基(例如絲氨酸、蘇氨酸或酪氨 酸殘基)加入磷酸基團。這些方法與對圖1中框12所述的磷酸化過程類似， 因此為了簡潔可以參考。框22與框12中所述的過程略微的不同之處在於， 框22中，對樣品和集合群體進行磷酸化操作。肽底物是否被磷酸化取決於 樣品抑制或促進激酶活性的性質。具體來說，應當注意的是，在一些實施 方式中，由於樣品中的激酶抑制劑，所述肽可能不會被框22中所述的過程 磷酸化。在此情況下，圖2中描述的方法可以用來確定樣品中的激酶活性為可以忽略或者無激酶活性。與之相反的是，在一些實施方式中，樣品中
的激酶活性不會受到抑制(或者甚至受到促進)，圖2所述的方法可以用來 測定激酶活性度。因此，儘管圖2中列出的方法的操作步驟設計成按照與 圖1所述類似的方式處理螢光顆粒，但是圖2中的方法的略微不同，即所述 顆粒可能不會被所述操作步驟改變。相反的是，對於存在激酶活性的情況， 圖2中的方法僅僅對所述顆粒進行操作步驟以改變顆粒。通過這種方式， 所述方法可以用來測定樣品中的激酶活性度，包括其中不存在活性或者僅 存在可以忽略的活性的實施方式。圖2的框24和26(下文中進行詳細描述) 與框14和16之間也可能有類似的差異。
如圖2所示，所述用來測定樣品中激酶活性的方法繼續進行至框24， 其中對大量螢光顆粒進行處理，使得如果所述大量螢光顆粒中存在磷酸化 的肽底物，則所述磷酸化的肽底物會被脫去磷酸，在所述肽底物的脫去磷酸 的位點產生極化的雙鍵。這些操作可以與圖1中框14所述的操作類似，因 此為了簡潔而可以參考。另外，所述方法包括框26，用於對所述大量螢光 顆粒進行進一步處理，使得如果所述肽底物的脫去磷酸的位點存在任何極 化的雙鍵，則螢光指示劑會通過其親核性端基在所述極化雙鍵的位置與所 述螢光顆粒相連。這些操作可以與圖1中框16所述的操作類似，因此為了 簡潔而可以參考。關於框16所述的螢光指示劑的不同實施方式的描述也適 用於框26。在一些實施方式中，框26可包括使得不同的螢光指示劑與螢光 顆粒中不同的亞組相連接。在這些情況下，所述不同的螢光指示劑可以設 計成在不同的波長範圍(即互不相同，也不同於螢光顆粒的載體結構中包含 的螢光材料的波長範圍)發射螢光。在此形式中，不同的螢光指示劑可以設 計成用來檢測不同的激酶活性，因此在試驗中激酶活性檢測可以多重化。
所述方法另外的步驟包括框28，其中測量了大量螢光顆粒的螢光發射。 這樣的測量操作可通過任意已知的測量方法進行，例如通過流式細胞儀或 螢光成像進行。所述方法還包括框30，其中根據測得的第一波長範圍內的 螢光發射測定顆粒類別，所述第一波長範圍按所述螢光顆粒的載體結構內 包含的螢光材料所決定的。更具體來說，顆粒的載體結構內的螢光材料發 射的螢光所產生的輸出信號可以用來將顆粒鑑別為不同的類別組。另外，如框32所示，該方法包括根據是否存在在第二波長範圍內測得的螢光發射， 確定在所述樣品和集合群體進行所述磷酸處理時樣品中的激酶活性量。具 體來說，因為激酶活性的存在可以通過對肽底物進行磷酸化來表明，本文 所述的方法通過在預先磷酸化的位點設置螢光指示劑而識別這些活性，從 螢光指示劑發射的螢光可以表示樣品中的激酶活性度。相反的是，在樣品 中的激酶活性受到抑制的實施方式中，螢光顆粒上的肽底物將不會發生磷 酸化，也不會有螢光指示劑連接在螢光顆粒上。因此，在螢光指示劑的波 長範圍內不會檢測到螢光發射，表明樣品中的激酶活性可以忽略，或者不 存在激酶活性。
本領域技術人員通過閱讀本說明書，可以顯而易見地了解本發明各種 方面地其它改進和另外的實施方式。例如，儘管在多通路歷程地一個例子 中具體描述了用來確定激酶活性地方法、顆粒和試劑盒，但是所述方法、
顆粒和試劑盒也可用於單通路歷程地激酶檢測。因此，本說明書僅僅用於 說明，用來使得本領域技術人員了解本發明地大體實施方式。應當理解本 文所述的本發明形式作為優選實施方式。可以對本文顯示和描述地要素和 材料進行替換，組成和操作可以電導，本發明地某些特徵可以獨立使用， 本領域技術人員通過閱讀本發明的說明書，可以很容易地了解這些變化。 可以在不背離所附權利要求書描述的本發明精神和範圍的前提下對本文中 描述的要素進行改變。
權利要求
1. 一種方法，該方法包括使得螢光顆粒接觸被分析物，所述螢光顆粒包含包含一種或多種螢光材料的載體基質；通過所述載體基質的官能團與所述載體基質連接的肽底物；在使得所述螢光顆粒接觸所述被分析物的步驟中使得所述肽底物磷酸化；對所述螢光顆粒進行處理，使得所述肽底物脫去磷酸，並在脫去磷酸的位點產生極化的雙鍵；使得包含親核性端基的螢光指示劑通過所述極化的雙鍵與所述螢光顆粒相連接。
2. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述螢光指示劑包含-螢光化合物；位於所述親核性端基以及所述螢光化合物之間的一種或多種間隔基化 合物。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述一種或多種間隔基化 合物總體上包含約1-25個原子。
4. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述使得螢光指示劑與熒 光顆粒相連接的步驟包括連接一種螢光指示劑，所述螢光指示劑設計成在 不同於所述載體基質的一種或多種螢光材料的波長範圍內發射螢光。
5. 如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述螢光指示劑設計成在 大於約500納米的波長範圍內發射螢光。
6. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述使得肽底物磷酸化的 步驟包括使得所述螢光顆粒接觸通過微波加熱的離子型液體。
7. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述對螢光顆粒進行處理 的步驟包括使得所述螢光顆粒接觸離子型液體。
8. 如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述對螢光顆粒進行處理 的步驟還包括對所述螢光顆粒和離子型液體進行微波加熱。
9. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述連接螢光指示劑的步 驟包括使所述螢光顆粒接觸離子型液體。
10. 如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述連接螢光指示劑的 步驟還包括對所述螢光顆粒和離子型液體進行微波加熱。
11. 一種顆粒，其包含包含一種或多種螢光材料的載體基質；通過所述載體基質的官能團與所述載體基質連接的肽底物。
12. 如權利要求11所述的顆粒，其特徵在於，所述肽底物是磷酸化 的肽底物。
13. 如權利要求11所述的顆粒，其特徵在於，所述肽底物包括邁克 爾受體。
14. 如權利要求11所述的顆粒，其特徵在於，所述顆粒還包含螢光 指示劑，所述螢光指示劑通過其親核性端基與所述肽底物連接。
15. 如權利要求14所述的顆粒，其特徵在於，所述螢光指示劑包含 螢光化合物；位於所述親核性端基以及所述螢光化合物之間的一種或多種間隔基化 合物。
16. 如權利要求15所述的顆粒，其特徵在於，所述一種或多種間隔 基化合物總體上包含約1-25個原子。
17. 如權利要求15所述的顆粒，其特徵在於，所述一種或多種間隔 基化合物總體上包含約5-25個原子。
18. 如權利要求15所述的顆粒，其特徵在於，所述螢光化合物設計 成在不同於所述載體基質的一種或多種螢光材料的波長範圍內發射螢光。
19. 如權利要求18所述的顆粒，其特徵在於，所述螢光化合物設計 成在約400-580納米的波長範圍內發射螢光。
20. 如權利要求18所述的顆粒，其特徵在於，所述螢光化合物設計 成在大於約500納米的波長範圍內發射螢光。
21. 如權利要求15所述的顆粒，其特徵在於，所述螢光化合物包括 親水性螢光化合物。
22. 如權利要求11所述的顆粒，其特徵在於，所述載體基質是交聯 的載體基質。
23. —種方法，該方法包括使得螢光顆粒的不同亞組的集合群體與樣品接觸，所述螢光顆粒中的至少一部分包含載體基質，包含一種或多種設計用來在第一波長範圍內發射螢光的熒 光材料，螢光顆粒的不同亞組中的至少一部分分別包含所述一種或多種熒 光材料的不同配置；通過所述載體基質的官能團與所述載體基質相連接的肽底物，螢光顆 粒的不同亞組的至少一部分分別包含不同的肽底物；對所述樣品和所述集合群體進行磷酸化處理，所述磷酸化處理用來加 入磷酸基團以接收所述肽底物的殘基；在對所述樣品和集合群體進行過磷酸化處理之後，對大量螢光顆粒進 行處理，使得如果所述大量螢光顆粒中存在任何磷酸化的肽底物，則所述磷 酸化的肽底物被脫去磷酸，在所述肽底物脫去磷酸的位點生成極化的雙鍵;對大量螢光顆粒進行進一步的處理，使得如果肽底物的脫去磷酸的位 點中存在任何極化的雙鍵，螢光指示劑通過其親核性端基在所述極化雙鍵 的位置與所述螢光顆粒相連接，所述螢光指示劑設計成發射在不同於所述第一波長範圍的第二波長範圍內的螢光；在對大量螢光顆粒進行進一步處理之後，測量所述大量螢光顆粒的螢光發射；根據測定的在第一波長範圍內的螢光發射鑑別樣品中顆粒的亞組類 別； .根據是否存在在第二波長範圍內測得的螢光發射，確定對所述樣品和 集合群體進行所述磷酸處理時樣品中的激酶活性量。
24. 如權利要求23所述的方法，其特徵在於，對所述顆粒的亞組類 別進行鑑別的步驟包括測定超過約ioo個亞組類別的種類。
25. 如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述對大量螢光顆粒 進行進一步處理的步驟包括使第一螢光指示劑與所述大量螢光顆粒的第一亞組中的螢光顆粒相連接；使不同的螢光指示劑與所述大量螢光顆粒的第二亞組中的螢光顆粒連 接，所述不同的螢光指示劑設計成用來在不同於所述第一螢光指示劑設計 的發射波長的波長範圍內發射螢光。
26. —種試劑盒，其包含大量的螢光顆粒，所述大量的螢光顆粒各自包括載體基質，所述載體 基質包含一種或多種設計用來在第一波長範圍發射螢光的螢光材料； 一種或多種激酶-特異性肽底物。
27. 如權利要求26所述的試劑盒，其特徵在於，所述一種或多種激 酶-特異性肽底物通過所述載體基質的官能團與所述大量螢光顆粒的載體 基質相連接。
28. 如權利要求27所述的試劑盒，其特徵在於，所述一種或多種激 酶-特異性肽底物分別與大量螢光顆粒的不同亞組相連接。
29. 如權利要求26所述的試劑盒，其特徵在於，所述一種或多種激 酶-特異性肽底物與所述大量螢光顆粒隔離開。
30. 如權利要求29所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還可包 含設計用來將所述一種或多種激酶-特異性肽底物與所述載體基質的官能 團相連接的試劑。
31. 如權利要求26所述的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒還包含 設計用來使得所述一種或多種激酶-特異性肽底物磷酸化的磷酸化試劑；p-消除試劑，其設計用來使得所述一種或多種激酶-特異性肽底物脫去 磷酸，在所述一種或多種激酶-特異性肽底物的脫去磷酸的位點產生麥可 受體；一種或多種螢光指示劑試劑，其各自包含親核性端基以及一種或多種 螢光化合物，所述螢光化合物設計成用來在不同於所述第一波長範圍的第 二波長範圍發射螢光。
32. 如權利要求31所述的試劑盒，其特徵在於，所述磷酸化試劑、|3-消除試劑以及所述一種或多種螢光指示劑試劑中的至少一種包含離子型液 體。
33.如權利要求31所述的試劑盒，其特徵在於，所述一種或多種熒 光指示劑試劑中的至少一種包含親水性螢光化合物。
全文摘要
提供了用來測定樣品中激酶活性的方法、顆粒和試劑盒。一種方法的一個實施方式包括使得螢光顆粒接觸被分析物，所述螢光顆粒包括載體基質以及通過所述載體基質的官能團與所述載體基質相連的肽底物，所述載體基質包含一種或多種螢光材料。該方法還包括在使所述螢光顆粒接觸被分析物的過程中對所述肽底物進行磷酸化，然後對所述螢光顆粒進行處理，使得所述肽底物脫去磷酸，在脫去磷酸的位點產生極化的雙鍵。另外，該方法包括通過所述極化的雙鍵將包含親核性端基的螢光指示劑與所述螢光顆粒相連。
文檔編號C12Q1/48GK101421414SQ200780013700
公開日2009年4月29日 申請日期2007年4月17日 優先權日2006年4月17日
發明者A·G·魯加德, J·W·雅各布森, M·R·霍夫邁耶 申請人:盧米尼克斯股份有限公司