鋅金屬硫蛋白的生產方法

2023-07-20 04:26:41

專利名稱：鋅金屬硫蛋白的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種鋅金屬硫蛋白的生產方法，屬於金屬硫蛋白的生產方法之一。
背景技術：
1957年Margoshes和Vallee在研究金屬生物學作用時，從動物器官分離出一種新的蛋白質，它含有豐富的巰基，能螯合大量的金屬離子，此物質稱為金屬硫蛋白(英文為Metallothionein，簡稱MT)。人體、動物、植物以及微生物體內均含MT，而且其理化特性基本一致。分子量為6500-7000道爾頓，直徑30-50A，分兩個結構域，每個分子含7-12個金屬原子，具有特殊的光吸收。它含有61個胺基酸，其中21個胺基酸為半胱氨酸，這樣每一個MT分子就可以最多結合七個金屬原子。MT化學性質穩定，可以在80℃的水中存活30分鐘，100℃的水中存活3分鐘而不失活，同時抗酶解，它具有廣泛的生物功能，在體內主要參與微量元素的貯存、運輸和代謝、拮抗電離輻射、清除羥基自由基及重金屬解毒等多種作用。大量的科學實驗和臨床結果表明MT在抗電離輻射、紫外線照射、解除金屬毒素、治療消化道潰瘍、心肌梗塞、各種炎症、各種癌症、美容護膚、減輕吸菸及環境汙染對人體的危害及抗過敏等方面均有顯著療效，具有廣譜高效的保健效果和極高的醫療價值。因此，提高金屬硫蛋白的生產量是大家的共同追求。但是，要提高金屬硫蛋白的生產量，其途徑之一是解決生產工藝，能夠在較短的時間內，和操作工序簡單的情況下，將原料中的金屬硫蛋白儘可能的分離出來，並且純度高。目前的生產工藝，主要存在生產工藝複雜、時間長、成本高和提取率、提純率低的問題。如中國專利申請號為CN200410013212.x一種豬肝金屬硫蛋白的生產方法，具有以下5個工序，且有的工序又包含了多個分工序。1、誘導。2、宰殺檢測。3、粗提。在這一工序中包括以下分工序(1)將搗碎的新鮮豬肝置於第一容器，加入Tris-HCL溶液攪拌勻漿，(2)冷凍離心，取上清液置於第二容器中，(3)再加入C2H5OH-CHCL攪拌，(4)進行第二次冷凍離心，又取上清液置於第三容器中，(5)將第三容器放入70-90℃的水浴鍋中水浴3-8min，並迅速取出冷卻至室溫，(6)進行第三次冷凍離心，取上清液置於半透膜中，(7)用磷酸緩衝液透析，半透膜中剩餘的溶液為金屬硫蛋白的粗提液。4、純化。在這一工序中又包括超率濃縮、在濃縮液中加入乙醇過夜浸提，然後，再進行第四次冷凍離心，去上清液取沉澱物，再用Tris-HCL溶解，進行Sephadex G-50柱層析，在柱面加入MT顯色試劑對MT組分著色；用NH4HCO3進行洗脫，收集著色的MT段洗脫液；將收集的著色部分再進行層析，NH4HCO3進行梯度洗脫，自動收集器收集峰尖部分洗脫液，對洗脫液升溫真空冷凍乾燥得凍乾粉。5、分裝。中國專利號CN92111198.3公開了另一種鋅金屬硫蛋白的生產工藝，包括誘導、粗提、柱層析分離、濃縮脫鹽、分裝凍幹5道工序，而且在粗提工序中又包括清洗、加入混合液、勻槳、超聲波破碎、分離去沉澱5道工序。不但工藝複雜，還因在誘導工序中所用的誘導劑是ZnCL2，所以必須有脫鹽工序，否則將嚴重影響金屬硫蛋白的提純精度和營養效果。

發明內容
本發明要解決的問題是，提供一種工藝簡單、提出率和提純率高的鋅金屬硫蛋白的生產方法。
本發明為解決以上問題而採取的技術解決方案是，提供一種由下例工序組成的鋅金屬硫蛋白的生產方法。它由原料清洗，原料破碎，勻漿，過濾和提取工序組成，其特點是，在提取工序中採用的是真空蒸餾，然後進行冷凝，冷凍分離和真空冷凍乾燥，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內的溫度為35℃-60℃，冷凍分離工序中的溫度為-10℃到-90℃。這裡的原料清洗，主要目的是去掉原料中的雜質，因此可以用純蒸餾水進行反覆清洗；也可以先用生理鹽水進行消毒清洗，再用純蒸餾水進行多次清洗，以便去掉生理鹽水和原料中的雜質。這裡的原料破碎，是將清洗好的原料進行破碎，以便用於下道工序的勻漿，使其與溶液充分混合。因此，原則上，破碎後的原料越細越好。破碎可以用傳統的破碎機進行破碎，並過60-200目篩，也可以用超聲波粉碎處理。這裡的勻漿是將粉碎好的原料與容劑充分混合，所用容劑是乙醇溶液，乙醇的含量在60％-85％之間。乙醇溶液與原料的重量比是2-4∶1。這裡的過濾是用離心機過濾或用濾布進行自然過濾，保留液體，去調殘渣。然後將液體放入蒸餾釜內進行蒸餾，並保證蒸餾釜處於真空狀態，蒸餾後的氣體經冷凝器後轉換為液體，並用容器收集，然後將盛有收集液體的容器放入冷凍器內進行冷凍分離，保留沉澱物，並將液體(主要是乙醇)回收再利用。再對沉澱物進行真空冷凍乾燥，得鋅金屬硫蛋白產品，其含量在95％以上。
本發明一種較好的實施方式是，真空蒸餾工序中蒸餾釜內的溫度為38℃-55℃，溫度過高不利於鋅金屬硫蛋白的活性，溫度偏低則影響蒸餾速度，在這一溫度範圍內，更能保證蒸餾速度和鋅金屬硫蛋白的活性。冷凍分離工序中的溫度為-20℃到-85℃，並保持2-36小時，溫度越低，鋅金屬硫蛋與乙醇的分離速度越快，所以冷凍分離所用的時間最少，反之冷凍分離所用的時間較多。
本發明第二種較好的實施方式是，在冷凍分離和真空冷凍乾燥工序之間，又增加了層析分離工序，以便分離鋅金屬硫蛋白的不同組分。在這裡，可以將鋅金屬硫蛋白分離出MT-1、MT-2兩種組分，或分離出MT-1、MT-2和MT-3三種組分，MT-1、MT-2和MT-3是MT的同分異構體，為MT的三種亞組分。在這裡用傳統的層析分離法即可。
本發明第三種較好的實施方式是，真空蒸餾工序中蒸餾釜內的溫度為38℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-20℃，並保持24小時。
本發明第四種較好的實施方式是，真空蒸餾工序中蒸餾釜內的溫度為50℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-85℃，並保持2小時。
本發明第五種較好的實施方式是，真空蒸餾工序中蒸餾釜內的溫度為55℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-50℃，並保持4小時。
由於本發明所給出技術解決方案，僅包括原料清洗，原料破碎，勻漿，過濾和提取工序，並且在提取工序中採用的是真空蒸餾，然後進行冷凝，冷凍分離和真空冷凍乾燥，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內的溫度為35℃-60℃，冷凍分離工序中的溫度為-10℃到-90℃。與現有技術相比，一是提取工序只有一道，避免了現有技術粗提和精提兩道工序；二是冷凍分離只有一次，而現有技術為四次；三是提出速度快，其速度比現有生產工藝速度提高2-4倍；四是提出率比現有技術高20％-40％，不但能提取兔、羊、豬、牛肝臟中的金屬硫蛋白，還能提取兔、羊、豬、牛肉內所含的金屬硫蛋白；五是提取純度比現有技術提高4％以上。
具體實施例方式下面給出本發明的實施例，用來進一步說明技術解決方案。其原料以兔肝臟中的肝、腎、心為主。兔肉，以及豬、羊、牛的肝臟或肉的加工過程與其相同。
實施例1取新鮮的含鋅金屬硫蛋白的兔肝臟5Kg，在原料清洗工序中用蒸餾水反覆進行清洗，去除一切雜質。
在原料破碎工序中，將洗淨的兔肝臟放入粉碎機中破碎，並過60-200目篩後，放到容器中。
在勻漿工序中，將粉碎好的原料與容劑攪拌，達到充分混合，所用容劑是乙醇溶液，乙醇的含量在60％-85％之間。乙醇溶液與原料的重量比是2-4∶1，乙醇的主要作用是將原料中的鋅金屬硫蛋白浸出來，使其進入溶液中。
在過濾工序中，將勻漿用離心機過濾，保留液體，去掉殘渣。或將勻漿放置到濾布中進行自然過濾，取其濾液。
在提取工序中，先對液體進行真空蒸餾，然後冷凝，再冷凍分離，最後進行真空冷凍乾燥。首先將過濾後的液體放入蒸餾釜內進行蒸餾，並保證蒸餾釜處於真空狀態，蒸餾釜內的溫度為35℃-60℃；蒸餾後的氣體直接流入冷凝器，並轉換為液體，在冷凝器出口用容器收集；然後將盛有收集液體的容器放入溫度為-10℃到-90℃的冷凍器內進行冷凍分離，並保持2-36小時，保留沉澱物，並將液體(主要是乙醇)回收以便重複利用；最後對沉澱物進行真空冷凍乾燥，真空冷凍乾燥技術為目前常用的技術，可得30g-35g鋅金屬硫蛋白產品，其含量在95％以上。
實施例2。取新鮮的含鋅金屬硫蛋白的兔肝臟5Kg，在原料清洗工序中，先用生理鹽水清洗消毒、去雜質，然後再用蒸餾水反覆清洗，去除生理鹽水和一切雜質。
在原料破碎工序中，將洗淨的兔肝臟放入超聲波粉碎機中破碎，並將破碎後的原料放到容器中。
在勻漿工序中，將粉碎好的原料與容劑攪拌，達到充分混合，所用容劑是乙醇溶液，乙醇的含量為65％。乙醇溶液與原料的重量比是2∶1。
在過濾工序中，將勻漿用離心機過濾，保留液體，去調殘渣。或將勻漿放置到濾布中進行自然過濾，取其濾液。
在提取工序中，先對液體進行真空蒸餾，然後冷凝，再冷凍分離，最後進行真空冷凍乾燥。將過濾後的液體放入蒸餾釜內進行蒸餾，並保證蒸餾釜處於真空狀態，蒸餾釜內的溫度為38℃±2℃；蒸餾後的氣體直接流入冷凝器，並轉換為液體，在冷凝器出口用容器收集；然後將盛有收集液體的容器放入溫度為-20℃的冷凍器內進行冷凍分離，並保持24小時，保留沉澱物，並將液體(主要是乙醇)回收以便重複利用；最後對沉澱物進行真空冷凍乾燥，得34g鋅金屬硫蛋白產品，其含量在95％以上。由於蒸餾釜內的溫度偏低，所以所用時間偏長。
實施例3。原料清洗工序、原料破碎工序、過濾工序與實施例2相同。
在勻漿工序中，所用乙醇溶液的乙醇含量為75％。乙醇溶液與原料的重量比是2.5∶1。
在提取工序中，處於真空狀態的蒸餾釜溫度為50℃±2℃；冷凍分離所用冷凍器的溫度為-30℃的冷凍器內進行，並保持6小時，保留沉澱物，並將液體(主要是乙醇)回收以便重複利用。
將主要成分是鋅金屬硫蛋白的沉澱物進行層析分離。在層析分離工序中，按沉澱物與蒸餾水1∶3-4.5比例混合。然後將溶液放入SephardexG-50柱進行層析，MT-1留在柱內，MT-2流到柱外的容器中，然後用碳酸氫氨對柱內的MT-1進行衝洗，並將衝洗液保存到另一個容器中，分別對MT-1溶液、MT-2溶液進行冷凍分離，取沉澱物，並對其真空冷凍乾燥既可得MT-1和MT-2。
由於蒸餾釜內的溫度較高，故所用時間較短。又因冷凍分離所用冷凍器的溫度為-30℃，保持這種狀態僅6小時就可。增加層析分離工序後，可以將鋅金屬硫蛋白的組分進一步分離成MT-1和MT-2。
實施例4。原料清洗工序、原料破碎工序、過濾工序、層析分離工序、真空冷凍乾燥與實施例3相同。
在勻漿工序中，所用乙醇溶液的乙醇含量為85％。乙醇溶液與原料的重量比是4∶1。
在提取工序中，處於真空狀態的蒸餾釜溫度為50℃±2℃；冷凍分離所用冷凍器的溫度為-85℃的冷凍器內進行，並保持2小時，保留沉澱物，並將液體(主要是乙醇)回收以便重複利用。然後經層析分離和真空冷凍乾燥可得MT-1-1HE MT-2。
與實施例3相比，所用時間更短。
實施例5。原料清洗工序、原料破碎工序、過濾工序、層析分離工序、真空冷凍乾燥工序與實施例3相同。
在勻漿工序中，所用乙醇溶液的乙醇含量為80％。乙醇溶液與原料的重量比是3.5∶1。
在提取工序中，處於真空狀態的蒸餾釜溫度為55℃±2℃；冷凍分離所用冷凍器的溫度為-50℃的冷凍器內進行，並保持4小時，保留沉澱物，並將液體(主要是乙醇)回收以便重複利用。然後再經層析分離、真空冷凍乾燥即可得MT-1和MT-2。
同理，根據本發明給出的技術解決方案，還可以給出多個實施例。
權利要求
1.一種鋅金屬硫蛋白的生產方法，它由原料清洗，原料破碎，勻漿，過濾和提取工序組成，其特徵是，在提取工序中採用的是真空蒸餾，然後進行冷凝，冷凍分離和真空冷凍乾燥，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內的溫度為35℃-60℃，冷凍分離工序中的溫度為-10℃到-90℃。
2.根據權利要求1所述的鋅金屬硫蛋白的生產方法，其特徵是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內的溫度為38℃-55℃，冷凍分離工序中的溫度為-20℃到-85℃，並保持2-36小時。
3.根據權利要求1或2所述的鋅金屬硫蛋白的生產方法，其特徵是，在冷凍分離和真空冷凍乾燥工序之間，又增加了層析分離工序，以便分離鋅金屬硫蛋白的不同組分。
4.根據權利要求1或2所述的鋅金屬硫蛋白的生產方法，其特徵是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內的溫度為38℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-20℃，並保持24小時。
5.根據權利要求3所述的鋅金屬硫蛋白的生產方法，其特徵是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內的溫度為38℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-20℃，並保持24小時。
6.根據權利要求1或2所述的鋅金屬硫蛋白的生產方法，其特徵是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內的溫度為50℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-85℃，並保持2小時。
7.根據權利要求3所述的鋅金屬硫蛋白的生產方法，其特徵是，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內的溫度為50℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-85℃，並保持2小時。
8.根據權利要求1或2所述的鋅金屬硫蛋白的生產方法，其特徵是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內的溫度為55℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-50℃，並保持4小時。
9.根據權利要求3所述的鋅金屬硫蛋白的生產方法，其特徵是，在真空蒸餾工序中，蒸餾釜內的溫度為55℃±2℃，冷凍分離工序中的溫度為-50℃，並保持4小時。
全文摘要
本發明公開了一種鋅金屬硫蛋白的生產方法，屬於金屬硫蛋白的生產方法之一。它由原料清洗，原料破碎，勻漿，過濾和提取工序組成，其特點是，在提取工序中採用的是真空蒸餾，然後進行冷凝，冷凍分離和真空冷凍乾燥，在真空蒸餾工序中蒸餾釜內的溫度為35℃－60℃，冷凍分離工序中的溫度為－10℃到－90℃。具有加工方法簡單，周期短，提出率和提純率高等優點。
文檔編號C07K1/14GK1803840SQ20061004234
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月24日 優先權日2006年1月24日
發明者黃世寬 申請人:黃世寬