一種可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架及其製備方法
2023-07-20 07:55:21
一種可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架及其製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架，組成材料包括絲素蛋白、角蛋白、明膠和自產氧物，其中，所述絲素蛋白和角蛋白的質量比為（3-9）:（2-6），所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為（1-5）:15，所述自產氧物和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為（0.2-3）:15。本發明提供的可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架複合了角蛋白、絲素蛋白、明膠和自產氧物，物理強度要優於利用單純絲素蛋白溶液和單純蛋白組合溶液所構建的膜結構材料，同時明膠成份對自產氧物構成一定的包裹作用，使得本發明提供的蛋白複合支架能夠恆速且高水平的釋放氧氣，更適合於實際手術操作的需要，最終提高尿道修復重建的成功率。
【專利說明】一種可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蛋白複合支架，尤其涉及一種可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架及其製備方法。
【背景技術】
[0002]由於各種原因所導致的複雜性尿道疾病，歷來是泌尿外科臨床治療中的一個難題。雖然多種自體組織作為替代材料已經在尿道修復重建中獲得理想的效果，但相比而言組織工程技術沒有前者「犧牲正常組織為代價，以手術創傷修復組織缺損」的固有缺陷，因而更可作為未來尿道重建發展的主要方向。現有國內外文獻報導中對於各種組織工程材料或者材料-種子細胞複合體在尿道修復重建中的研究已逐漸從實驗室向臨床拓展。其中不乏有小範圍實際尿道疾病臨床治療的案例，並且獲得另人滿意的初步療效。
[0003]但是相對於種子細胞研究的日趨完善，在尿道組織工程修復重建中選擇何種支架材料最為理想卻始終未能達成共識。目前在尿道的組織工程研究中主要採用兩大類支架:天然脫細胞膠原基質(SIS、BAMG、脫細胞真皮基質等)和人工合成材料(聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物)。前者雖然製備方便，適合商品化的生產，但由於多取材於異種乃至異體生物組織，因而在生物安全性方面一直受到部分學者質疑，很難被所有患者所接受。同時其在空間結構，生物力學特性以及促進微血管和細胞滲透方面也同時存在著固有缺陷。後者雖然將生物安全性方面的風險降到了最低，但支架在降解過程中的代謝產物對周圍的細胞以及微環境會造成不可避免的負面影響，另外人工合成類支架因缺乏相應的生長因子，在促進種子細胞黏附，增殖方面也有著先天的不足。
[0004]人發提取角蛋白是一類廣泛存在於人毛髮以及指甲內的結構蛋白質。因其含有豐富的半胱氨酸殘基，其彼此之間通過氧化作用形成大量分子內和分子間的二硫鍵，從而使得製備的生物支架材料擁有了相應的生物彈性。在生物相容性方面，現有的研究結果顯示不同種子細胞均能在該類蛋白支架上很好的生長。同時由於還原型的角蛋白不含極性，在水中的溶解度較小且能耐受極端的PH環境，因而擁有相對較慢的降解速率，可作為替代支架在體內發揮作用長達3 — 6月之久。
[0005]雖然角蛋白擁有著上述的諸多優點，但單純採用此種蛋白進行支架材料製備時，不可避免的會遇到生物力學特性不足的問題。因此在製備支架的過程中將角蛋白和其餘天然材料進行有效結合可以進一步提升材料的力學性能，從而更能夠滿足類似尿道組織修復重建的需要。相比而言，自蠶絲內獲取的絲素蛋白擁有提取簡易，製作成本低的優勢。不僅如此，絲素蛋白極佳的彈性以及較好的抗拉強度也為其與角蛋白的結合提供了理論基礎。
[0006]製備完成的角蛋白-絲素蛋白複合支架如同其它合成的尿道組織工程修復材料一樣會擁有一定的厚度，而支架材料的厚度勢必會對微血管的長入、氧氣以及營養補給起到限制作用。而這一問題也是導致利用組織工程材料進行尿道重建術後出現狹窄復發的主要原因之一。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在於克服上述不足，提供一種具有自體供氧能力的可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架及其製備方法。
[0008]本發明的第一個方面是提供一種可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架，所述蛋白複合支架的組成材料包括絲素蛋白、角蛋白、明膠和自產氧物。
[0009]優選地，所述絲素蛋白和角蛋白的質量比為(3-9): (2-6)，更優選為(3.5-8.5):(2.5-5.5)，更優選為(4-8): (3-5.2)，更優選為(5-7): (3-5)，更優選為(5.5-6.5):(3.5-4.5)，例如 6:4 或 6:4.2。。
[0010]優選地，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(1-5): 15，更優選為(1.5-4.5): 15，更優選為(2-4): 15，更優選為(2.5-3.5):15，例如 2.8:15 或 3:15。
[0011]優選地，所述自產氧物和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(0.2-3):15，更優選為(0.5-2.5):15,更優選為(0.5-2): 15，更優選為(0.8-1.5):15,更優選為(0.9-1.2):15,例如 0.95:15 或 1:15。
[0012]其中，所述自產氧物優選為過氧化鈣、過碳酸鈉、過碳酸鉀、過氧化硫脲等中的一種或幾種的混合物，更優選為過氧化鈣。
[0013]其中，所述角蛋白優選為還原型人發角蛋白。
[0014]本發明的第二個方面是提供一種上述用於尿道修復重建的蛋白複合支架的製備方法，包括以下步驟:
[0015]步驟1，將角蛋白溶液與絲素蛋白溶液混合得到蛋白混合液，控制絲素蛋白和角蛋白的質量比為(3-9): (2-6)，且蛋白混合液中角蛋白與絲素蛋白的總濃度為0.05-0.2g/mL ；
[0016]步驟2，將明膠加入到蛋白混合液中，待明膠完全溶解後，加入自產氧物，溶解完全，其中，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(1-5): 15，所述自產氧物和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(0.2-3):15 ；
[0017]步驟3，將步驟2得到的混合溶液密封靜置，直至凝膠化，敞口自蒸發，得到蛋白複合支架。
[0018]步驟I中，所述絲素蛋白和角蛋白的質量比優選為(3.5-8.5): (2.5-5.5)，更優選為(4-8): (3-5.2)，更優選為(5-7): (3-5)，更優選為(5.5-6.5): (3.5-4.5)，例如 6:4或 6:4.2。
[0019]步驟I中，蛋白混合液中角蛋白與絲素蛋白的總濃度優選為0.06-0.17g/mL，更優選為 0.07-0.15g/mL，更優選為 0.08-0.13g/mL，更優選為 0.09-0.llg/mL，例如 0.lg/mL 或0.105g/mL。
[0020]步驟2中，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比優選為(1.5-4.5):15，更優選為(2-4): 15，更優選為(2.5-3.5):15，例如 2.8:15 或 3:15。
[0021]步驟2中，所述自產氧物和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比優選為(0.5-2.5):15,更優選為(0.5-2): 15，更優選為(0.8-1.5):15,更優選為(0.9-1.2):15,例如 0.95:15 或 1:15。
[0022]步驟2中，所述自產氧物優選為過氧化鈣、過碳酸鈉、過碳酸鉀、過氧化硫脲等中的一種或幾種的混合物，更優選為過氧化鈣。
[0023]步驟I中，所述角蛋白優選為還原型人發角蛋白，製備方法如下:將人頭髮置於提取液中，50-150°C (優選為70-130°C，更優選為80-120°C，更優選為100-110°C )下浸泡10-60min (優選為15_50min,更優選為25_35min),過濾,將濾液透析,濃縮,得到還原型人發角蛋白，其中，人頭髮的質量與提取液的體積的比為(0.5-4g): (5-20mL)。
[0024]進一步優選地，人頭髮的質量與提取液的體積的比為(l_3g): (8_15mL)，更優選為(1.5-2g): (10-12mL)。
[0025]優選地，所述提取液為尿素、十二烷基硫酸鈉、Na2S2O5的混合水溶液。
[0026]進一步優選地，所述提取液中，每10mL水中，含有30_70g(優選為35_60g，更優選為45-50g)尿素、40-80g (優選為45-70g，更優選為50_60g)十二烷基硫酸鈉、80_120g (優選為 88-110g，更優選為 92-100g) Na2S205。
[0027]步驟I中，所述絲素蛋白的製備方法如下:將脫膠蠶絲溶於MX溶液中，過濾，將濾液透析，濃縮，得到純化的絲素蛋白，其中，M為鹼金屬(例如L1、Na、K等)，X為滷素(例如F、Cl、Br、I 等)。
[0028]優選地，步驟3中，凝膠化後，敞口自蒸發8_16h(優選為10_14h，更優選為ll_12h)後，倒入無水酒精0.5-2h (優選為0.8-1.5h，更優選為1-1.2h)後取出得到蛋白複合支架。
[0029]本發明提供的可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架複合了角蛋白、絲素蛋白、明膠和自產氧物，物理強度要優於利用單純絲素蛋白溶液和單純蛋白組合溶液所構建的膜結構材料，同時明膠成份對自產氧物構成一定的包裹作用，使得本發明提供的蛋白複合支架能夠恆速且高水平的釋放氧氣，更適合於實際手術操作的需要，最終提高尿道修復重建的成功率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為本發明提供的用於尿道修復重建的蛋白複合支架的HE染色圖；
[0031]圖2為本發明提供的用於尿道修復重建的蛋白複合支架的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
[0032]下面參照附圖，結合具體的實施例對本發明作進一步的描述，以更好地理解本發明。
[0033]實施例1
[0034]1、自理髮店中獲取無染色的正常黑髮，常規洗髮精清洗1-2次，置放於常規室溫中進行乾燥。
[0035]2、將乾燥處理後的頭髮浸泡於乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0036]3、頭髮再次乾燥後，充分剪碎，將其按1.5g/10ml比例加入提取液(每100ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸鈉SDS、95.045gNa2S205)中，浸沒後在100°C油浴加熱30min。
[0037]4、真空抽濾，將黑色提取液置於透析袋中，透析5d，透析袋周圍水溶液中含有
0.lwt% 的 Na2S2O5。
[0038]5、完成透析後將透析帶置於20wt%PEG(分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調節還原型人發角蛋白的的濃度為0.lg/mL後，行SDS蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-60kD左右，說明得到還原型人發角蛋白。
[0039]6、將得到的還原型人發角蛋白溶液在4°C環境下予以保存。
[0040]7、將10g溴化鋰溶於60ml水中，配製成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至60。。。
[0041]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲1g溶液溴化鋰水溶液中，5h後，多層紗布過濾，過濾後溶液置於透析袋中。
[0042]9、透析5d，透析袋周圍水溶液中含有0.lwt%的Na2S2O5，每天換水一次。
[0043]10、完成透析後將透析帶置於20wt%PEG (分子量20000)水溶液中，濃縮6h，調節至絲素蛋白的濃度為0.lg/mL，行SDS蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-30kD左右，說明得到絲素蛋白。
[0044]11、將得到的絲素蛋白溶液在4°C環境下予以保存。
[0045]12、將得到的還原型人發角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比6:4進行混合。
[0046]13、取步驟12得到的混合液15ml，將其融合攪拌並加熱至37°C，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.02g/mL。待明膠完全溶解後，加入過氧化鈣0.1g,高速攪拌30s後置入方型模具中。
[0047]14、混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置12h小時，帶凝膠化後，開蓋，自然蒸發12h，倒入酒精Ih後取出，得到蛋白複合支架。
[0048]最終獲取的蛋白複合支架大體外觀為褐色半透明膜狀材料。其HE染色提示該材料為一伊紅染色陽性膜狀物(圖1所示)。掃描電鏡顯示支架表面存在散在分布的顆粒狀過氧化鈣，部分區域可見明膠包被過氧化鈣表現(圖2所示)。
[0049]經力學拉伸檢測，該蛋白複合支架的最大伸長率52.43%，彈性模量0.202MPa。釋氧能力檢測提示每Icm2該種材料浸沒於8ml蒸餾水溶液中可使得該溶液的氧含量在2周之內維持在HO-1OOmmHg之間。
[0050]實施例2
[0051]1、自理髮店中獲取無染色的正常黑髮，常規洗髮精清洗1-2次，置放於常規室溫中進行乾燥。
[0052]2、將乾燥處理後的頭髮浸泡於乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0053]3、頭髮再次乾燥後，充分剪碎，將其按1.5g/10ml比例加入提取液(每100ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸鈉SDS、95.045gNa2S205)中，浸沒後在100°C油浴加熱30min。
[0054]4、真空抽濾，將黑色提取液置於透析袋中，透析5d，透析袋周圍水溶液中含有
0.lwt% 的 Na2S2O5。
[0055]5、完成透析後將透析帶置於20wt%PEG(分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調節還原型人發角蛋白的的濃度為0.lg/mL後，行SDS蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-60kD左右，說明得到還原型人發角蛋白。
[0056]6、將得到的還原型人發角蛋白溶液在4°C環境下予以保存。
[0057]7、將10g溴化鋰溶於60ml水中，配製成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至
60。。。
[0058]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲1g溶液溴化鋰水溶液中，5h後，多層紗布過濾，過濾後溶液置於透析袋中。
[0059]9、透析5d，透析袋周圍水溶液中含有0.lwt%的Na2S2O5，每天換水一次。
[0060]10、完成透析後將透析帶置於20wt%PEG (分子量20000)水溶液中，濃縮6h，調節至絲素蛋白的濃度為0.lg/mL，行SDS蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-30kD左右，說明得到絲素蛋白。
[0061]11、將得到的絲素蛋白溶液在4°C環境下予以保存。
[0062]12、將得到的還原型人發角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比4:6進行混合。
[0063]13、取步驟12得到的混合液15ml，將其融合攪拌並加熱至37°C，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.02g/mL。待明膠完全溶解後，加入過氧化鈣0.4g，高速攪拌30s後置入方型模具中。
[0064]14、混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置12h小時，帶凝膠化後，開蓋，自然蒸發12h，倒入酒精Ih後取出，得到蛋白複合支架。
[0065]實施例3
[0066]1、自理髮店中獲取無染色的正常黑髮，常規洗髮精清洗1-2次，置放於常規室溫中進行乾燥。
[0067]2、將乾燥處理後的頭髮浸泡於乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中24小時，其中乙酸乙酯與甲醇的體積比為3:1。
[0068]3、頭髮再次乾燥後，充分剪碎，將其按1.5g/10ml比例加入提取液(每100ml水中，溶解480.4g尿素、57.676g十二烷基硫酸鈉SDS、95.045gNa2S205)中，浸沒後在100°C油浴加熱30min。
[0069]4、真空抽濾，將黑色提取液置於透析袋中，透析5d，透析袋周圍水溶液中含有
0.lwt% 的 Na2S2O5。
[0070]5、完成透析後將透析帶置於20wt%PEG(分子量10000)水溶液中，濃縮6小時，調節還原型人發角蛋白的的濃度為0.lg/mL後，行SDS蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在45-60kD左右，說明得到還原型人發角蛋白。
[0071]6、將得到的還原型人發角蛋白溶液在4°C環境下予以保存。
[0072]7、將10g溴化鋰溶於60ml水中，配製成溴化鋰水溶液，攪拌溶液同時加熱至60。。。
[0073]8、將自市場上購置的脫膠蠶絲1g溶液溴化鋰水溶液中，5h後，多層紗布過濾，過濾後溶液置於透析袋中。
[0074]9、透析5d，透析袋周圍水溶液中含有0.lwt%的Na2S2O5，每天換水一次。
[0075]10、完成透析後將透析帶置於20wt%PEG (分子量20000)水溶液中，濃縮6h，調節至絲素蛋白的濃度為0.lg/mL，行SDS蛋白電泳檢測提示蛋白電泳帶在25-30kD左右，說明得到絲素蛋白。
[0076]11、將得到的絲素蛋白溶液在4°C環境下予以保存。
[0077]12、將得到的還原型人發角蛋白溶液和絲素蛋白溶液按體積比7:3進行混合。
[0078]13、取步驟12得到的混合液15ml，將其融合攪拌並加熱至37°C，加入明膠，控制混合液中明膠的濃度為0.0lg/mL。待明膠完全溶解後，加入過氧化鈣0.2g，高速攪拌30s後置入方型模具中。
[0079]14、混合溶液在方型模具中，模具加蓋，室溫下放置12h小時，帶凝膠化後，開蓋，自然蒸發12h，倒入酒精Ih後取出，得到蛋白複合支架。
[0080]以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為範例，本發明並不限制於以上描述的具體實施例。對於本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的範疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和範圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的範圍內。
【權利要求】
1.一種可以用於尿道修復重建的蛋白複合支架，其特徵在於，組成材料包括絲素蛋白、角蛋白、明膠和自產氧物，其中，所述絲素蛋白和角蛋白的質量比為(3-9): (2-6)，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(1-5): 15，所述自產氧物和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(0.2-3):15ο
2.根據權利要求1所述的蛋白複合支架，其特徵在於，所述絲素蛋白和角蛋白的質量比為(5-7): (3-5)。
3.根據權利要求1所述的蛋白複合支架，其特徵在於，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(2-4):15ο
4.根據權利要求1所述的蛋白複合支架，其特徵在於，所述自產氧物和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(0.5-2):15ο
5.根據權利要求1所述的蛋白複合支架，其特徵在於，所述自產氧物為過氧化鈣、過碳酸鈉、過碳酸鉀、過氧化硫脲中的一種或幾種的混合物。
6.根據權利要求1所述的蛋白複合支架，其特徵在於，所述角蛋白為還原型人發角蛋白。
7.—種如權利要求1所述的用於尿道修復重建的蛋白複合支架的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 步驟1，將角蛋白溶液與絲素蛋白溶液混合得到蛋白混合液，控制絲素蛋白和角蛋白的質量比為(3-9): (2-6)，且蛋白混合液中角蛋白與絲素蛋白的總濃度為0.05-0.2g/mL; 步驟2，將明膠加入到蛋白混合液中，待明膠完全溶解後，加入自產氧物，溶解完全，其中，所述明膠和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(1-5): 15，所述自產氧物和角蛋白與絲素蛋白總量的質量比為(0.2-3):15 ； 步驟3，將步驟2得到的混合溶液密封靜置，直至凝膠化，敞口自蒸發，得到蛋白複合支架。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述角蛋白為還原型人發角蛋白，製備方法如下: 將人頭髮置於提取液中，50-150°C下浸泡10-60min，過濾，將濾液透析，濃縮，得到還原型人發角蛋白，其中，人頭髮的質量與提取液的體積的比為(0.5-4g): (5-20mL)。
9.根據權利要求8所述的製備方法，其特徵在於，所述提取液為尿素、十二烷基硫酸鈉、Na2S2O5的混合水溶液，其中，每10mL水中，含有30_70g尿素、40_80g十二烷基硫酸鈉、80-120gNa2S205o
10.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述絲素蛋白的製備方法如下: 將脫膠蠶絲溶於MX溶液中，過濾，將濾液透析，濃縮，得到純化的絲素蛋白，其中，M為鹼金屬，X為滷素。
【文檔編號】A61L27/22GK104288835SQ201310476346
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年10月12日 優先權日:2013年10月12日
【發明者】馮超, 李喆, 徐月敏, 呂向國 申請人:上海市第六人民醫院