一種表達定向進化l-乳酸脫氫酶的工程菌及應用的製作方法

2023-07-20 13:13:06 2

專利名稱：一種表達定向進化l-乳酸脫氫酶的工程菌及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種大腸桿菌工程菌及應用，尤其涉及一種能夠外源表達定向進化的 NAD (煙醯胺腺嘌呤雙核苷酸)非依賴型L-乳酸脫氫酶的工程大腸桿菌，以及所述工程菌在拆分外消旋扁桃酸，共生產R-扁桃酸和苯乙酮酸中的應用。
背景技術：
R-扁桃酸及其衍生物是重要的精細化工及多種藥物合成的中間體。高純度手性R-扁桃酸可以用來合成半合成青黴素，頭孢菌素，抗癌抗菌素以及抗肥胖藥物 ((Preparation of (R) - (-) -mandelic acid and its derivatives from racemates by enantioselective degradation with anewly isolated bacterial strain Alcaligenes sp. ECU0401. Bioprocess. Biosyst. Eng. 2008,31 :445-451.》。R-扁桃酸還可以作為醇類白勺旋光拆分i式齊 11使用〈〈Production of R-(-)-mandelicacid from mandelonitrile by Alcaligenes faecalis ATCC 8750. Appl. Environ. Microbiol. 1991，57 :3028_3032》。苯乙酮酸是合成某些農藥(如除草劑苯嗪草酮)和醫藥產品(如胃長寧)的重要中間體《化工中間體苯乙酮酸的合成初探，上海化工，2000, 2，22-23》。文獻報導生物催化法生產R-扁桃酸的途徑有三種，一是通過腈水解酶立體選擇性的催化外消旋扁桃腈水解《Enantioselective biocatalytic hydrolysis of(R, S)-mandelonitrile forproduction of(R)-(2)-mandelic acid by a newly isolated mutant strain. J Ind MicrobiolBiotechnol. 2010,38 :337-345)) ；二是利用脂肪酶立體選擇性的水解外消旋扁桃酸酯《Enzyme-catalysed optical resolution of mandelic acid via RS(+ ) -methyl mandelate innon-aqueous media. Biochemical. Engineering. Journal. 2004，19 101-107》或進行外消旋扁桃酸的酯化《Biocatalytic enantioconvergent separation of racemic mandelic acid. Separationand Purification Technology. 2007,53 :178_182》。三是利用微生物的氧化還原酶催化生成 R-扁桃酸〈〈Preparation of (R) -(-) -mandelic acid and its derivatives from racemates byenantioselective degradation with a newly isolated bacterial strain Alcaligenes sp. ECU0401. Bioprocess. Biosyst. Eng. 2008，31 :445-451.》。該類方法可使用外消旋扁桃酸，外消旋苯基-1，2-乙二醇或苯乙酮酸為底物，操作簡易，不需添加共底物。其中外消旋扁桃酸來源廣泛，價格低廉，使用其作為底物生產高光學純的的R-扁桃酸具有較好的可行性。施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri SDM，CCTCC No. M206010)含有 NAD 非依賴性L-乳酸脫氫酶(L-iLDH)和NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶(D_iLDH)，通過針對性的保留施氏假單胞菌中L-iLDH，去除D-iLDH，可以實現外消旋乳酸及外消旋α -羥基丁酸的拆分 ((Enantioselective oxidation of racemic lactic acid to D-Iactic acid and pyruvic acid byPseudomonas stutzeri SDM. Bioresour. Technol. 2009,100 :1878-188)) ((Kinetic resolution of2-hydroxybutanoate racemic mixtures by NAD—independent L-Iactatedehydrogenase. Bioresour. Technol. 2011，102 :4595-4599)) 但是其中 L-iLDH具有較窄的底物譜，僅對於L-乳酸及L-2-羥基丁酸具有較高的活性，而對於含苯環或長鏈的2-羥酸無活性或僅具有微弱活性，限制了其在生物催化中的應用。R-扁桃酸與L-乳酸具有類似的結構，利用蛋白質定點突變技術，改變L-iLDH的底物特異性，可以提高其催化S-扁桃酸的活性，通過在不含扁桃酸降解活性的大腸桿菌中外源表達該突變蛋白製備全細胞催化劑，可以實現以外消旋扁桃酸為底物進行手性拆分，生成兩種重要的中間體R-扁桃酸和苯乙酮酸。經檢索，利用外源表達突變L-iLDH的工程菌株完整細胞催化劑生產R-扁桃酸以及苯乙酮酸的方法未見報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種能夠外源表達定向進化L-乳酸脫氫酶的大腸桿菌工程菌及其應用該工程菌製備的全細胞作為催化劑進行外消旋扁桃酸的拆分，同時生產手性純R-扁桃酸以及苯乙酮酸。本發明所述表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌，其特徵在於所述工程菌是一種能夠外源表達定向進化的煙醯胺腺嘌呤雙核苷酸(NAD)非依賴型L-乳酸脫氫酶的工程大腸桿菌，由如下方法構建獲得(1)設計併合成PCR引物，自施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri SDM) CCTCC No. M206010菌株的基因組中擴增L-iLDH的基因IldD (Genbank序列號GU373722)；其中所述引物是上遊引物IldU iAAGCTTATGATCATTTCCGCCTCTACC,下遊引物11 dD CTCGAGTCAGACGTCAGCAGACGTTG ；(2)選取L-iLDH蛋白質序列中的108位的纈氨酸作為目標位點，設計併合成含有突變位點的PCR引物，通過PCR反應，將IldD基因第323的胸腺嘧啶核苷酸(T)改變為胞嘧啶核苷酸(C)，即相應於將蛋白質序列108位的纈氨酸(Val)突變為丙氨酸(Ala)，得到突變L-iLDH基因mlldD ；其中所述引物是上遊引物ImU TTCACCCTTTCCACCGCGTCGGTCT,下遊引物ImD GGGAATCCCTTTCTTGTCTGCCGC ；使用DNA連接酶進行PCR反應產物的自連接，將直線型的產物重新連接為環狀，完成蛋白質編碼基因的定點突變；(3)以含有T7啟動子和氨苄青黴素抗性的大腸桿菌宿主適用表達載體pETDuet-1 出發，將突變L-iLDH基因mlldD序列通過T4 DNA連接酶連接至表達載體，構建表達載體 pETDuet-1-mlldD ；(4)使用化學轉化的方法將表達載體pETDuet-1-mlldD轉化至大腸桿菌C43 (DE3) 所製備的感受態細胞中，將轉化細胞塗布於含有氨苄青黴素抗性的固體LB培養基上，篩選得到含有連接突變L-iLDH基因表達載體的轉化子，即得到表達突變蛋白的煙醯胺腺嘌呤雙核苷酸(NAD)非依賴型L-乳酸脫氫酶的工程大腸桿菌。上述步驟中大腸桿菌感受態細胞的製備方法可參考科學出版社出版的《精編分子生物學指南》中大腸桿菌感受態製備方法。
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上述步驟中的LB培養基配方為每升蒸餾水中含有5克酵母粉，10克蛋白腖，10 克氯化鈉，調節PH值為7. 5，121°C溼熱滅菌20分鐘。固體LB培養基配方為在上述配方中加入15克瓊脂粉。本發明所述表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的應用。其中所述表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌的全細胞作為催化劑進行外消旋扁桃酸的拆分，同時生產手性純R-扁桃酸以及苯乙酮酸。進一步的，所述工程菌的全細胞作為催化劑進行外消旋扁桃酸的拆分的方法是(1)製備表達定向進化L-乳酸脫氫酶工程菌的完整細胞催化劑平板培養將構建的高表達突變L-iLDH的大腸桿菌工程菌劃線接種於固體LB培養基，培養基含有濃度為1毫克/毫升的氨苄青黴素，在37°C進行培養12小時，挑取單菌落；種子培養將挑取的單菌落接種至5毫升液體LB培養基，培養基含有濃度為1毫克/毫升的氨苄青黴素，在37°C培養8 10小時；誘導培養將工程菌種子以體積比的接種量接種至LB培養基中，37°C培養； OD62tlIim達到0. 5 0. 7時，加入終濃度為0. 8 1. 2毫摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)，開始誘導突變蛋白進行表達；繼續在30 37°C誘導蛋白表達6 10小時後，終止培養；分離並收集菌體，用PH 7. 4磷酸鉀緩衝液洗滌菌體2次，菌體重懸於去離子水中，得到作為催化劑的表達定向進化L-乳酸脫氫酶工程菌的完整細胞懸液；(2)將上述催化劑與外消旋扁桃酸鈉水溶液混合，加入20 25毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸鈉的濃度為20 40克/升；催化劑完整細胞濃度為80 120克溼細胞/升，在30 42°C，pH 6. 5 7. 5條件下，使底物外消旋扁桃酸鈉、催化劑與氧氣充分混合，並以120轉/分鐘 180轉/分鐘振蕩培養36 48小時，得含R-扁桃酸鈉以及苯乙酮酸鈉的轉化液。上述步驟( 優選的實施方式是將上述催化劑與外消旋扁桃酸鈉水溶液混合， 加入25毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸鈉的濃度為40克/ 升；催化劑完整細胞濃度為100克溼細胞/升，在37 42°C，pH 7. 0條件下，使底物外消旋扁桃酸鈉、催化劑與氧氣充分混合，並以150轉/分鐘振蕩培養40 45小時，得含R-扁桃酸鈉以及苯乙酮酸鈉的轉化液。利用高效液相色譜(HPLC)測定轉化液中R-扁桃酸的含量及R-扁桃酸的對映體過量值樣品處理待測樣品用兩倍體積的高氯酸(5% )酸化，4°C靜置2小時後，12000轉 /分鐘離心15分鐘，離心上清用0. 22微米的水相濾膜過濾，然後HPLC分析樣品；R-扁桃酸及苯乙酮酸的含量測定採用AgilentllOO色譜系統，色譜柱為離子交換柱(300X7. 8毫米，Aminex HPX-87H column，美國Bio-Rad公司)，分析條件為以10毫摩爾/升硫酸為流動相，柱溫，流速為0. 4毫升/分鐘，進樣量5微升，採用示差折光檢測器(RID)進行檢測；R-扁桃酸對映體過量值測定採用Agilent 1100色譜系統，色譜柱為手性柱 (150X4. 6 毫米，DAICEL CHIRALCEL 0J-RH，日本 Daicel 公司)，以純水(含 0. 1 %醋酸)乙腈(體積比為90 10)作為流動相，柱溫15°C，流速為0. 4毫升/分鐘，進樣量1微升， 採用二極體陣列檢測器(DAD)進行檢測，波長設定為205納米。其中上述對映體過量率的計算公式為
權利要求
1.一種表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌，其特徵在於所述工程菌是一種能夠外源表達定向進化的煙醯胺腺嘌呤雙核苷酸(NAD)非依賴型L-乳酸脫氫酶的工程大腸桿菌， 由如下方法構建獲得(1)設計併合成PCR引物，自施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri SDM)CCTCC No. M206010菌株的基因組中擴增L-iLDH的基因IldD (Genbank序列號GU373722)；其中所述引物是上遊引物 IldU :AAGCTTATGATCATTTCCGCCTCTACC,下遊引物 IldD CTCGAGTCAGACGTCAGCAGACGTTG ；(2)選取L-iLDH基因IldD中的108位的纈氨酸作為目標位點，設計併合成含有突變位點的PCR引物，通過PCR反應，將IldD基因第323的胸腺嘧啶核苷酸(T)改變為胞嘧啶核苷酸(C)，即相應於將蛋白質序列108位的纈氨酸(Val)突變為丙氨酸(Ala)，得到突變 L-iLDH基因mlldD;其中所述引物是上遊引物 ImU TTCACCCTTTCCACCGCGTCGGTCT,下遊引物 ImD GGGAATCCCTTTCTTGTCTGCCGC ；(3)以含有T7啟動子和氨苄青黴素抗性的大腸桿菌宿主適用表達載體pETDuet-1 出發，將突變L-iLDH基因mlldD序列通過T4DNA連接酶連接至表達載體，構建表達載體 pETDuet-1-mlldD ；(4)使用化學轉化的方法將表達載體pETDuet-1-mlldD轉化至大腸桿菌C43(DE!3)所製備的感受態細胞中，將轉化細胞塗布於含有氨苄青黴素抗性的固體LB培養基上，篩選得到含有連接突變L-iLDH基因表達載體的轉化子，即得到表達突變蛋白的煙醯胺腺嘌呤雙核苷酸(NAD)非依賴型L-乳酸脫氫酶的工程大腸桿菌。
2.權利要求1所述表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌的全細胞作為催化劑進行外消旋扁桃酸的拆分，同時生產手性純R-扁桃酸以及苯乙酮酸。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述工程菌的全細胞作為催化劑進行外消旋扁桃酸的拆分的方法是(1)製備表達定向進化L-乳酸脫氫酶工程菌的完整細胞催化劑將工程菌種子以體積比的接種量接種至LB培養基中，37°C培養；OD62tlIim達到0. 5 0. 7時，加入終濃度為 0. 8 1. 2毫摩爾/升的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，開始誘導突變蛋白進行表達；繼續在 30 37°C誘導蛋白表達6 10小時後，終止培養；分離並收集菌體，用pH 7. 4磷酸鉀緩衝液洗滌菌體2次，菌體重懸於去離子水中，得到作為催化劑的表達定向進化L-乳酸脫氫酶工程菌的完整細胞懸液；(2)將上述催化劑與外消旋扁桃酸鈉水溶液混合，加入20 25毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸鈉的濃度為20 40克/升；催化劑完整細胞濃度為80 120克溼細胞/升，在30 42°C，pH 6. 5 7. 5條件下，使底物外消旋扁桃酸鈉、 催化劑與氧氣充分混合，並以120轉 180轉/分鐘振蕩培養36 48小時，得含R-扁桃酸鈉以及苯乙酮酸鈉的轉化液。
5.如權利要求4所述的應用，其特徵在於步驟(2)所述方法是將上述催化劑與外消旋扁桃酸鈉水溶液混合，加入25毫摩爾/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸鈉的濃度為40克/升；催化劑完整細胞濃度為100克溼細胞/升，在37 42°C，pH 7. 0條件下，使底物外消旋扁桃酸鈉、催化劑與氧氣充分混合，並以150轉/分鐘振蕩培養 40 45小時，得含R-扁桃酸鈉以及苯乙酮酸鈉的轉化液。
全文摘要
本發明公開了一種表達定向進化L-乳酸脫氫酶的工程菌，是一種能夠外源表達定向進化的煙醯胺腺嘌呤雙核苷酸(NAD)非依賴型L-乳酸脫氫酶的工程大腸桿菌；其是以商業大腸桿菌C43(DE3)為基礎，通過轉入含有突變NAD(煙醯胺腺嘌呤雙核苷酸)非依賴性L-乳酸脫氫酶基因的表達載體pETDuet-1-mlldD，使其能夠高表達相應的突變蛋白，具有S-扁桃酸降解活性。本發明還公開了所述工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的應用，是以所構建工程菌完整細胞作為催化劑進行外消旋扁桃酸的拆分，同時生產手性純R-扁桃酸以及苯乙酮酸，具有底物利用率高、產物濃度高、光學純度高以及後提取簡便等優點。
文檔編號C12N15/70GK102559570SQ20121001051
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月13日 優先權日2012年1月13日
發明者姜天翼, 許平, 馬翠卿, 高超 申請人:山東大學