人蒼白桿菌zjb－061及其應用的製作方法

2023-07-20 05:17:01 1

專利名稱：人蒼白桿菌zjb－061及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及從土壤中篩選到的微生物新菌株人蒼白桿菌ZJB-061(Ochrobactrum anthropi ZJB-061)，及其在催化β-氨基丙腈製備β-氨基丙酸中的應用。
背景技術：
β-氨基丙酸是製備泛酸鈣的重要中間體，維生素B3(泛酸)由泛解酸和β-氨基丙酸組成，存在於一切組織之中，它是輔酶A的成分，是體內能量代謝中不可缺少的成分。泛酸參與碳水化合物、脂肪和蛋白質代謝，特別是對脂肪的合成與代謝起十分重要的作用。泛酸還是形成乙醯膽鹼所必需的物質。缺乏泛酸可使動物生長速度下降，皮膚受損，神經系統紊亂，抗體形成受阻。
β-氨基丙酸還是合成肌肽、帕米磷酸鈉、巴柳氮的前體。β-氨基丙酸還被應用於電鍍，也用於微生物和生物化學等研究，它本身也可用於鉛中毒解毒劑，還可用於合成甜味劑等。
生產β-氨基丙酸的方法有多種，目前研究較多的是化學法生產，主要有三種[徐克勳，精細有機化工原料及中間體手冊，北京，化學工業出版社，2002，1998，445-446]1、丙烯腈法
2、β-氨基丙腈法2NH2CH2CH2CN+Ba(OH)2→(NH2CH2CH2COO)2Ba+N2
3、琥珀醯亞胺降解法(霍氏反應) 以上三種方法均需強鹼或強酸等參與反應，試劑損耗大，對環境不友好，而且收率不高。
由於此法存在著一系列化學法生產的缺點，因此利用生物技術法來來代替化學法是一種趨勢。人們一直試圖尋求一種生物技術的方法來生產β-氨基丙酸。
日本人及川等在土壤中分離到兩株能將β-氨基丙腈分解為β-氨基丙酸的菌株產鹼菌(Alcaligenes sp.)OMT-MY14和(aminobacter aminobrance)ATCC23314(公開特許公報10-42885)。

發明內容本發明的目的是為了提供一株可將β-氨基丙腈水解為β-氨基丙酸的新的微生物菌株；其次是提供一種利用該微生物催化水解β-氨基丙腈生產β-氨基丙酸的方法。
為達到發明目的本發明採用的技術方案是人蒼白桿菌ZJB-061(Ochrobactrum anthropi ZJB-061)，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NoM206039，保藏日期2006年4月14日，提議的分類命名為人蒼白桿菌ZJB-061。
所述人蒼白桿菌ZJB-061由如下方法篩選得到以β-氨基丙腈為唯一氮源，甘油為唯一碳源，加入基本的無機離子，從土樣(採自杭州各個地方)中篩選具有水解β-氨基丙腈生產β-氨基丙酸的腈水解酶類活力的微生物菌株。
篩選培養基甘油4g/L，MgCl20.4g/L，Na2HPO42g/L，KH2PO41g/L，滅菌後添加3mL/L的β-氨基丙腈。
(1)初篩從浙江各個地區採集土壤樣品，稱取1.0g土壤，裝入含50mL水的250mL三角瓶中，用玻璃珠打散，吸取1mL接入篩選培養基(250mL三角瓶，裝液量50mL)，搖床培養(150rpm，30℃，96h)。
(2)復篩在篩選培養基上長出菌體的培養液稀釋不同的梯度，進行平板塗布，挑取不同的單菌落接種到篩選培養基中進行培養72h，離心得到菌體，取0.5g離心得到的菌體，加入10mL磷酸緩衝液，震蕩混勻於50mL帶塞子的三角瓶中，添加30μL β-氨基丙腈，30℃水浴轉化4h。離心，上清用薄板層析法快速定性檢測是否含有β-氨基丙酸。具有轉化能力的菌種即為我們目標要篩選的微生物菌株，從150個土樣中我們篩選到一個具有轉化活力的微生物蒼白桿菌ZJB-061。
用於篩選微生物的土樣來自各種可分離到微生物的樣品，如果園、農田、汙水處理站等。
所述的人蒼白桿菌ZJB-061細胞形態為杆狀，長度2～4μm，寬度0.8～1.2μm，無鞭毛、革蘭氏染色陽性；所述的人蒼白桿菌ZJB-061的生理生化特徵的詳細科學描述見表1表1人蒼白桿菌ZJB-061菌株生理生化特徵科學描述
注表中+表示陽性，-表示陰性以提取到的細胞總DNA為模板，利用引物p16S-85′-aga gttt gat cct ggctca g-3′和p16S-15415′-aag gag gtg atc cag ccg ca-3′擴增菌株的16S rDNA基因，將PCR產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳，經PCR擴增成功獲得了一長約為1.5kb的片段，經測序確認該片段實際長度為1422bp，其序列如下
GGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCTTTTGCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGTAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTTGGGGAGTTTACTCTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATACCGGTCGCGGACACAGAGATGTGTCTTTCAGTTCGGCTGGACCGGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGCACGCGAGTGTGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGCGCTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAA。
將該序列(已提交GenBank，GenBank登記號為No.DQ468351)與GenBank中相關數據進行相似性分析發現，與人蒼白桿菌的同源性最高(homology，100％/1422 bps，based on 16S rDNA)。同已知的細菌16S rDNA序列進行比對，利用Phylips(version 3.572)軟體構建進化樹，確定菌株的進化地位，生理生化鑑定結合分子鑑定，可確認該菌株為人蒼白桿菌(Ochrobactrum anthropi)，擬命名為Ochrobactrum anthropi ZJB-061。
由β-氨基丙腈通過水解作用製備β-氨基丙酸主要反應為
所述的人蒼白桿菌ZJB-061主要用於製備β-氨基丙酸。所述的方法是將人蒼白桿菌ZJB-061菌種接種到適用於人蒼白桿菌的發酵培養基中、並在所述的發酵培養基中添加終濃度為10～60mmol/L的β-氨基丙腈，進行發酵培養，然後對發酵液進行離心，得到菌體，將菌體細胞或處理過的菌體細胞添加到含有β-氨基丙腈溶液中進行水解反應，最後對轉化液進行分離，即得所述的β-氨基丙酸。所述處理過的菌體細胞是指經處理後得到的粗酶、固定化細胞、固定化酶。
用於本發明培養菌種的培養基是一些含有可以被上述菌株利用營養物質，通常所用的培養基含有碳源(例如葡萄糖，甘油，麥芽糖)，有機營養物質(如酵母膏，蛋白腖，牛肉膏，玉米漿)，無機營養成分(如磷酸鹽，鎂，鉀、鐵)等，另外還要加入少量的β-氨基丙腈作為誘導劑，誘導微生物在培養的過程中產生水解腈到酸的腈水解酶。優選的，所述發酵培養基組成為葡萄糖5～12％，MgCl20.01～1.0％，Na2HPO40.1～0.5％，KH2PO40.05～0.2％，酵母膏0.2～0.6％，餘量為去離子水，將發酵培養基分裝、滅菌，接入斜面人蒼白桿菌ZJB-061菌種，並添加終濃度10～60mmol/L的β-氨基丙腈；培養條件為pH6～8、溫度28～32℃下培養3～4天。本發明中培養基組成以重量/體積百分比計算，某物質濃度為1％表示100mL溶液中含有1g該物質。
按照上述方法培養3～4天，然後通過離心等方法分離出細胞。再將細胞或處理過的細胞(粗酶、固定化細胞、固定化酶等)懸浮在緩衝液中，然後加入底物β-氨基丙腈，進行水解反應。
上述加入底物β-氨基丙腈的方式有多種，可以一次性加入，也可以逐漸地，以可控制的方式連續加入腈化合物，底物濃度最大可以達到150mmol/L。
β-氨基丙腈在細胞或處理過的細胞的生物催化作用下轉化為β-氨基丙酸，反應液中大約含有3％～5％(溼重)的細胞和大約50～150mmol/L的β-氨基丙腈。
所述水解反應的反應條件為反應溫度30～40℃，反應pH 5～9，反應3～10小時。優選的，所述水解反應在磷酸鹽緩衝液(0.2N，pH6.0)轉化體系中，最佳轉化溫度為30-35℃，β-氨基丙腈轉化為β-氨基丙酸的轉化率達到92％以上。
本發明中作為生物催化劑的微生物細胞或處理過的細胞(粗酶、固定化細胞、固定化酶等)可以重複利用。
所述轉化液分離方法為將轉化液離心分離，上清首先調pH至4-5，通過柱I(WA-2樹脂，用氨水洗脫)去除大部分的無機離子，然後蒸掉大部分氨水，通過柱II(D201-FC樹脂，用鹽酸洗脫)去除β-氨基丙腈以及一些無機陽離子；最後通過柱III(WA-2樹脂，用氨水洗脫)，去除前一洗脫液中的鹽酸等雜質，收集β-氨基丙酸，濃縮結晶，得到的β-氨基丙酸純度達到95％以上。
具體的，所述β-氨基丙酸製備方法如下(1)發酵培養發酵培養基組成 葡萄糖10％，MgCl20.4％，Na2HPO42％，KH2PO41％，酵母膏3％，用去離子水配製，pH自然；將發酵培養基分裝、滅菌，接入斜面人蒼白桿菌ZJB-061菌種，並添加終濃度10～60mmol/L的β-氨基丙腈，搖床轉速150r/min，pH6.5-7.5，溫度28-32℃條件下培養3.5天；(2)催化水解發酵液離心收集菌體，加於0.2N、pH6.0的磷酸鹽緩衝液中，添加終濃度為50～150mmol/L的β-氨基丙腈，pH7.0、30℃水浴中轉化3～10小時；(3)產物分離上清首先調pH至4-5，通過柱I(WA-2樹脂，用氨水洗脫)去除大部分的無機離子，然後蒸掉大部分氨水，通過柱II(D201-FC樹脂，用鹽酸洗脫)去除β-氨基丙腈以及一些無機陽離子；最後通過柱III(WA-2樹脂，用氨水洗脫)，濃縮結晶，得所述的β-氨基丙酸。
本發明中所用到的分析方法(1)薄板層析法定性檢測薄板層析法展開劑為乙醇∶蒸餾水＝85∶15；點樣體積2μL；展開時間40min；以0.2％的茚三酮溶液為顯色劑。β-氨基丙酸Rf＝0.2133，β-氨基丙腈Rf＝0.4067。
(2)高效液相色譜法β-氨基丙酸和β-氨基丙腈的衍生化方法取0.2mL樣品，再依次加入1mL 0.5mol/L的NaHCO3溶液、0.8mL蒸餾水和0.5mL的衍生化試劑(二硝基氟苯，濃度為3％，用乙腈配置)，在60℃下水浴避光反應30min後，取出並加入7.5mL的pH為7.0的磷酸鹽緩衝液(NaH2PO4和Na2HPO4濃度都是0.2mol/L，前者與後者混合的體積比是39∶61，未有特殊說明下同)，就可以進樣了。以甲醇0.05mol/L的乙酸和乙酸鈉溶液(55∶45)為流動相；C18色譜柱(250nm×4.6nm)；流速1.0mL/min；柱溫30℃。可以對轉化液中β-氨基丙酸和β-氨基丙腈進行定量檢測。
本發明的有益效果主要體現在通過篩選得到新的菌株來生物法合成β-氨基丙酸，代替化學合成方法。具有轉化率高，環境友好，過程綠色等優點。


圖1為人蒼白桿菌ZJB-061同相關菌株的進化樹。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例1從斜面將人蒼白桿菌ZJB-061接種至100mL滅菌後的發酵培養基中葡萄糖10g/L，MgCl20.4g/L，Na2HPO42g/L，KH2PO41g/L，酵母膏3g/L。再添加終濃度為44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培養4天後發酵液冷凍離心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸鹽緩衝液洗滌，同樣方法離心。取0.5g離心得到的溼菌體，加入10mL磷酸鹽緩衝液，震蕩混勻於50mL帶塞子的三角瓶中，添加0.447mmol(即30μL)β-氨基丙腈，30℃水浴轉化2.5h。離心，上清通過柱前衍生高效液相色譜法進行檢測。轉化率達98％。
將轉化液離心分離，上清首先調pH至4，通過柱IWA-2樹脂(購自安徽烷東化工廠)，用氨水洗脫，去除大部分的無機離子，然後蒸掉大部分氨水，通過柱IID201-FC樹脂(購自漂萊特(中國)有限公司)，用鹽酸洗脫，去除β-氨基丙腈以及一些無機陽離子；最後通過柱IIIWA-2樹脂(購自安徽烷東化工廠)，用氨水洗脫，去除前一洗脫液中的鹽酸等雜質，收集β-氨基丙酸，濃縮結晶，得到β-氨基丙酸，純度達到95％。
實施例2從斜面將人蒼白桿菌ZJB-061接種至100mL發酵滅菌後的培養基中甘油4g/L，MgCl20.4g/L，Na2HPO42g/L，KH2PO41g/L，酵母膏3g/L。再添加終濃度為44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培養5天後發酵液冷凍離心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸鹽緩衝液洗滌，同樣方法離心。取0.5g離心得到的溼菌體，加入10mL磷酸鹽緩衝液，震蕩混勻於50mL帶塞子的三角瓶中，添加0.746mmol(即50μL)β-氨基丙腈，30℃水浴轉化6h。離心，上清通過柱前衍生高效液相色譜法進行檢測。轉化率達92％。
實施例3從斜面將人蒼白桿菌ZJB-061接種至100mL發酵滅菌後的培養基中葡萄糖8g/L，MgCl20.3g/L，Na2HPO41.5g/L，KH2PO41.5g/L，再添加終濃度為44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培養4天後發酵液冷凍離心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸鹽緩衝液洗滌，同樣方法離心。取0.5g離心得到的溼菌體，加入10mL磷酸鹽緩衝液，震蕩混勻於50mL帶塞子的三角瓶中，添加0.447mmol(即30μL)β-氨基丙腈，30℃水浴轉化2.5h。離心，通過高效液相色譜法進行檢測。轉化率達91.2％。
實施例4從斜面將人蒼白桿菌ZJB-061接種至100mL發酵滅菌後的培養基中葡萄糖10g/L，MgCl20.4g/L，Na2HPO42g/L，KH2PO41g/L，酵母膏5g/L，再添加終濃度為59.6mmol/L的β-氨基丙腈，培養3.5天後發酵液冷凍離心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸鹽緩衝液洗滌，同樣方法離心。取0.5g離心得到的溼菌體，加入10mL磷酸鹽緩衝液，震蕩混勻於50mL帶塞子的三角瓶中，添加1.04mmol(即70μL)β-氨基丙腈，30℃水浴轉化10h。離心，上清通過柱前衍生高效液相色譜法進行檢測。轉化率達88％。
實施例5從斜面將人蒼白桿菌ZJB-061接種至100mL滅菌後的發酵培養基中葡萄糖8g/L，MgCl20.3g/L，Na2HPO42g/L，KH2PO41.5g/L，酵母膏5g/L，再添加終濃度為44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培養5天後發酵液冷凍離心(4℃，13000rpm，10min)，去上清，磷酸鹽緩衝液洗滌，同樣方法離心。取0.3g離心得到的溼菌體，加入10mL磷酸鹽緩衝液，震蕩混勻於50mL帶塞子的三角瓶中，添加0.447mmol(即30μL)β-氨基丙腈，30℃水浴轉化3h。離心，上清通過柱前衍生高效液相色譜法進行檢測。轉化率達89％。
實施例6從斜面將人蒼白桿菌ZJB-061接種至100mL滅菌後的發酵培養基中葡萄糖8g/L，MgCl20.3g/L，Na2HPO42g/L，KH2PO41.5g/L，酵母膏5g/L，再添加終濃度為44.7mmol/L的β-氨基丙腈，培養5天後發酵液離心(13000rpm，10min)，去上清，蒸餾水洗滌，同樣方法離心。取0.3g離心得到的溼菌體，加入蒸餾水中，震蕩混勻於50mL帶塞子的三角瓶中，添加0.447mmol(即30μL)β-氨基丙腈，30℃水浴轉化3h。離心，上清通過柱前衍生高效液相色譜法進行檢測。轉化率達85％。
序列表.WorkFileApplication Project-------------------120Title人蒼白桿菌ZJB-061及其應用130AppFileReference140CurrentAppNumber141CurrentFilingDate____-__-__Sequence--------213OrganismName400PreSequenceStringgggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcgc cccgcaaggg60gagcggcaga cgggtgagta acgcgtggga acgtaccttt tgctacggaa taactcaggg120aaacttgtgc taataccgta tgtgcccttc gggggaaaga tttatcggca aaggatcggc180ccgcgttggat tagctagtt ggtgaggtaa aggctcacca aggcgacgat ccatagctgg240tctgagagga tgatcagcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca300gcagtgggga atattggaca atgggcgcaa gcctgatcca gccatgccgc gtgagtgatg360aaggccctag ggttgtaaag ctctttcacc ggtgaagata atgacggtaa ccggagaaga420agccccggct aacttcgtgc cagcagccgc ggtaatacga agggggctag cgttgttcgg480atttactggg cgtaaagcgc acgtaggcgg acttttaagt caggggtgaa atcccggggc540tcaaccccgg aactgccttt gatactggaa gtcttgagta tggtagaggt gagtggaatt600ccgagtgtag aggtgaaatt cgtagatatt cggaggaaca ccagtggcga aggcggctca660ctggaccatt actgacgctg aggtgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct720ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgtta gccgttgggg agtttactct tcggtggcgc780agctaacgca ttaaacattc cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa840ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac900cttaccagcc cttgacatac cggtcgcgga cacagagatg tgtctttcag ttcggctgga960ccggatacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc1020cgcaacgagc gcaaccctcg cccttagttg ccagcattta gttgggcact ctaaggggac1080tgccggtgat aagccgagag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacggg
序列表.WorkFile1140ctgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggca gcgagcacgc gagtgtgagc1200taatctccaa aagccatctc agttcggatt gcactctgca actcgagtgc atgaagttgg1260aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca1320ccgcccgtca caccatggga gttggtttta cccgaaggcg ctgtgctaac cgcaaggagg1380caggcgacca cggtagggtc agcgactggg gtgaagtcgt aa1422212TypeDNA211Length1422SequenceNameZJB-061菌株的16s rDNA序列SequenceDescriptionSequence--------213OrganismName400PreSequenceStringagagtttgat cctggctcag20212TypeDNA211Length20SequenceName引物p16S-8SequenceDescriptionSequence--------213OrganismName400PreSequenceStringaaggaggtga tccagccgca20212TypeDNA211Length20SequenceName引物p16S-1541SequenceDescription
權利要求
1.人蒼白桿菌ZJB-061(Ochrobactrum anthropi ZJB-061)，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NoM 206039，保藏日期2006年4月14日。
2.如權利要求1所述的人蒼白桿菌ZJB-061，其特徵在於所述的人蒼白桿菌ZJB-061細胞形態為杆狀，長2～4μm、寬0.8～1.2μm，無鞭毛、有芽孢，革蘭氏染色陽性；所述的人蒼白桿菌ZJB-061生化實驗明膠水解陽性，酪氨酸水解陽性，澱粉水解陽性，酪素水解陽性，硝酸鹽還原陽性，反硝化實驗陰性，甲基紅實驗陽性，脫氫酶陰性，過氧化酶陽性。
3.如權利要求1所述的人蒼白桿菌ZJB-061，其特徵在於所述的人蒼白桿菌ZJB-061的16S rDNA序列如下GGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAGCGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCTTTTGCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACTTTTAAGTCAGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGTAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACCATTACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGTTAGCCGTTGGGGAGTTTACTCTTCGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATACCGGTCGCGGACACAGAGATGTGTCTTTCAGTTCGGCTGGACCGGATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGCACGCGAGTGTGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAAGGCGCTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCGACCACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAA。
4.如權利要求1～3之一所述的人蒼白桿菌ZJB-061在製備β-氨基丙酸中的應用。
5.如權利要求4所述的人蒼白桿菌ZJB-061在製備β-氨基丙酸中的應用，其特徵在於所述的應用是將人蒼白桿菌ZJB-061菌種接種到適用於人蒼白桿菌的發酵培養基中、並在所述的發酵培養基中添加終濃度為10～60mmol/L β-氨基丙腈，進行發酵培養，然後對發酵液進行離心，得到菌體，將菌體細胞或處理過的菌體細胞添加到含有β-氨基丙腈的溶液中進行水解反應，最後對轉化液進行分離，即得所述的β-氨基丙酸。
6.如權利要求5所述的人蒼白桿菌ZJB-061在製備β-氨基丙酸中的應用，其特徵在於所述發酵培養基組成為葡萄糖5～12％，MgCl20.01～1.0％，Na2HPO40.1～0.5％，KH2PO40.05～0.2％，酵母膏0.2～0.6％，餘量為去離子水；發酵培養條件為pH6～8、溫度28～32℃下培養3～4天。
7.如權利要求5所述的枯草桿菌ZJB-061在微生物水解製備β-氨基丙酸中的應用，其特徵在於所述水解反應的反應條件為反應溫度30～40℃，反應pH 5～9，反應3～10小時。
8.如權利要求5所述的枯草桿菌ZJB-061在微生物水解製備β-氨基丙酸中的應用，其特徵在於所述水解反應在0.2N、pH6.0的磷酸鹽緩衝液轉化體系中進行。
9.如權利要求5所述的人蒼白桿菌ZJB-061在微生物水解製備β-氨基丙酸中的應用，其特徵在於所述轉化液的分離方法為將轉化液離心分離，上清調pH至4-5，通過柱IWA-2樹脂、用氨水洗脫，收集洗脫液蒸掉大部分氨水，再通過柱IID201-FC樹脂、用鹽酸洗脫，最後通過柱IIIWA-2樹脂、用氨水洗脫，濃縮結晶，得所述的β-氨基丙酸。
全文摘要
本發明提供了一種從土壤中篩選到的微生物菌株人蒼白桿菌ZJB－061(Ochrobactrum anthropi ZJB－061)，及其在催化β－氨基丙腈製備β－氨基丙酸中的應用。所述人蒼白桿菌ZJB－061保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NoM 206039，保藏日期2006年4月14日。將人蒼白桿菌ZJB－061菌種接種到適用於人蒼白桿菌的發酵培養基中、並在所述的發酵培養基中添加少量的β－氨基丙腈，進行發酵培養，然後對發酵液進行離心，得到菌體，將菌體細胞或處理過的菌體細胞添加到含有β－氨基丙腈溶液中進行水解反應，最後對轉化液進行分離，即得所述的β－氨基丙酸。本發明通過篩選得到一株新的菌株來生物法合成β－氨基丙酸，代替化學合成的方法。具有轉化率高，環境友好，過程綠色等優點。
文檔編號C12P13/00GK101063090SQ20061005059
公開日2007年10月31日 申請日期2006年4月29日 優先權日2006年4月29日
發明者鄭裕國, 徐亞蓉, 柳志強, 沈寅初 申請人:浙江工業大學