一種連翹降血脂有效部位及其製備方法和應用的製作方法

2023-08-11 02:33:21 3

專利名稱：：一種連翹降血脂有效部位及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及了一種從連翹葉脂溶性部位提取製備降血脂有效部位，同時還涉及該有效部分的製備方法，以及從該有效部位在製備抗氧化藥物中的應用。
背景技術：
：連翹(Fora^/H'fl^^mse(thumb.)Vahl)為木犀科連翹屬植物，性微寒，味苦，歸肺、心、小腸經。具有清熱解毒，消腫散結之功效，主治癰疽、瘰癧、溫熱、丹毒、小便淋閉等症。高脂血症(Hyperlipaemia，HLP)主要是指血清總膽固醇(TC)或甘油三酯(TG)水平過高和(或)血清高密度脂蛋白一膽固醇(HDL-C)水平過低。高脂血症是中老年的常見病和多發病，隨著人們生活水平的提高和生活習慣的改變，該病的發病率明顯增加，發病的年齡也有所提前。高脂血症所引起的動脈粥樣硬化是造成冠心病、高血壓和腦血管疾病的主要原因，嚴重危害到了人類生命健康。目前，西藥調節血脂雖有肯定的療效，但有不同程度的副作用，且作用靶點單一。目前公認為調脂最有效並廣泛應用的西藥是他汀類，但費用高，且有肝臟和肌肉毒性等副作用。近年來，中藥調血脂以其療效好、副作用小的優勢而成為研究的熱點。連翹的莖、葉、果實、根均可入藥，傳統以果實入藥，隨著一些學者的研究，連翹葉化學工作與藥理研究發現，連翹葉中的化學成分與果實中有極大的相似度，且連翹葉也具有良好的藥理活性，如連翹葉茶具有清除自由基和抗氧化作用，作為一種純天然的預防和治療有活性氧引起的各種疾病(如衰老、心腦血管、高血壓、老年性痴呆症甚至癌症等)的藥物及新型的天然食品抗氧化劑具有廣泛的應用前景。但目前，對連翹葉的應用開發主要集中在極性大的水部位進行，其主要活性成分是連翹苷或連翹酯苷，而對脂溶性部位的研究，特別是藥效成分的研究尚未見報導。
發明內容本發明的目的在於提供一種從連翹葉脂溶性部位提取製備乙酸乙酯有效部位。同時，本發明的目的還在於提供一種該有效部分的製備方法。另外，本發明的目的還在於提供一種該有效部分在製備抗氧化活性方面的應用。為了實現上述目的，本發明的技術方案採用了一種連翹降血脂有效部位，該有效部分為連翹葉經丙酮與水提取後經濃縮而得的乙酸乙酯部位。進一步講，本發明的乙酸乙酯部位的製備方法為將連翹葉或者連翹果實用丙酮與水按體積比7:3配成的溶液重複冷浸3次，每次7天，過濾，合併濾液減壓回收溶劑得濃縮物，將濃縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位。經體外抗氧化篩選發現，乙酸乙酯部位具有好的抗氧化活性，並且還具有良好的體內外降血脂作用。更進一步地講，將乙酸乙酯部位進行矽膠常壓柱(200-300目)層析，石油醚一乙酸乙酯按體積比15:1洗脫，洗脫物經過丙酮凝膠柱層析，氯仿環己烷甲醇=9:9:2的體積比進行凝膠柱層析，得到連翹脂素。此單體化合物連翹脂素具有良好的體內外降血脂作用。乙酸乙酯部位進一步製備而得的單體化合物經鑑定為連翹脂素，其結構式為連翹脂素(Phillygenin)化合物連翹脂素，經體外抗氧化實驗表明，具有良好的抗氧化活性。本發明所製備的化合物連翹脂素及其所在的有效部位——乙酸乙部位在體外具有較好的抗氧化活性，體內實驗也表明乙酸乙酯部位和連翹脂素能降低高脂血症小鼠的血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，且可通過氧化途徑(升高超氧化物岐化酶SOD、降低脂質過氧化產物一丙二醛MDA)來降低血脂水平。並且乙酸乙酯部位對高脂血症小鼠血清總膽固醇的降低作用，要好於連翹脂素和決明子降脂片，對連翹葉乙酸乙酯有效部位進行進一步開發，發揮其多靶點協同預防和治療高血脂等疾病的作用，將具有很好的應用前景。體外抗氧化實驗鑑於此，我們對連翹葉脂溶性部位進行研究，發現了降血脂有效部位為乙酸乙酯部位，並對此部位進行進一步研究得到了單體化合物。材料與試劑連翹葉乙酸乙酯部位、水提取物、連翹脂素均由實驗室製備提供。二苯代苦味肼基自由基DPPH(日本東京化成工業株式會社)；Fe3+-三吡啶三啞嗪TPTZ(Acrosorganics);Trolox(Aldrich);ABTS[2，2'-連氨-(3_乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽](Fluka);BHT(Acrosorganics);甲醇，醋酸鈉，FeCl3*6H20，冰醋酸，過二硫酸鉀均為分析純。主要儀器UV-2000型紫外可見分光光度計(尤尼可上海儀器有限公司)，電子天平(梅特勒-託利多儀器有限公司)，旋轉蒸發儀(東京理化)，電熱套(北京中興偉業儀器有限公司)，超聲波清洗器(崑山市超聲儀器有限公司)。試驗方法本實驗採用清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH，)、鐵離子還原/抗氧化力測定法(ferricreducing/antioxidantpowerassay,FRAP)禾口清除ABTS自由基三種方法，並以BHT作為陽性對照，來研究連翹葉乙酸乙酯部位和化合物連翹脂素抗氧化活性。結果見表l:表l樣品的抗氧化活性TestedmaterialDPPHIC5(ng/ml)ABTSIC50(ng/ml)FRAPValue(nmol/g)b乙酸乙酯部位ethylacetateextract24.796.411555.48水提取物waterextract16.2512.811382.55連翹脂素Phillygenin15.513.582376.45BHTa17.216.042065.86注ICs。為半數抑制率，指清除率為5(m時所需抗氧化劑的濃度(ug/ml)。a為陽性對照品b表示每克樣品的自由基清除能力相當於Trolox的自由基清除能力的微摩爾數(單位為Mmol/g)，艮卩抗氧化當量(TroloxEquivalentAntioxidantCapacity-Trolox)o(Trolox為參照物)，b值越大說明其抗氧化能力越強。DPPH法測定結果以上四種測試物的抗氧化順序為連翹脂素〉BHT〉水提取5物〉乙酸乙酯部位；ABTS法測定結果連翹脂素〉BHT〉乙酸乙酯部位〉水提取物；FRAP法測定結果連翹脂素〉BHT〉乙酸乙酯部位〉水提取物。由表1三種抗氧化方法比較可知，乙酸乙酯部位的抗氧化活性要高於水提取物，連翹脂素的抗氧化活性最強，高於乙酸乙酯部位，和陽性對照品BHT。體內降血脂抗氧化試驗動物昆明小鼠，空腹體重為23±2g，全部雄性。由河南省醫學動物實驗中心提供。材料與試劑連翹葉乙酸乙酯部位、連翹脂素由河南大學天然藥物研究所製備提供。決明子降脂片，吉林吉春製藥有限公司批號070501。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固斷HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒，北京中生生物工程高技術公司提供。試驗方法高脂乳劑的配製豬油20%、膽固醇10%、丙硫氧嘧啶1%、2%膽鹽(配成10%溶液)、丙二醇2%和吐溫801%。動物分組與處理取50隻小鼠，平均體重23士2g，按實驗要求分為正常對照組，高脂模型組，給藥組(包括連翹脂素給藥組和連翹乙酸乙酯部位給藥組)，陽性對照組。正常對照組動物上午ig(灌胃)給於蒸餾水，下午ig0.5%CMC-Na，高脂模型組均於每天上午ig給於高脂乳劑(0.2ml/10g-d)，下午ig0.5%CMC-Na，給藥組分別於每天上午ig給於高脂乳劑(0.2ml/10g*d)，下午ig給藥，給藥量見表2。IO天后，各組小鼠均禁食12h，眼底靜脈叢取血，離心分離血清用於血脂及SOD、MDA的測定。表2動物分組與處理tableseeoriginaldocumentpage6指標測定方法TC，TG，LDL-C，HDL-C，MDA，SOD的測定按試劑盒說明方法進行數據處理實驗數據X士S表示，實驗統計採用SPSS10.0統計軟體進行單因素方差分析。結果(1)連翹葉乙酸乙酯部位和化合物連翹脂素對高脂血症小鼠血脂的影響，結果見表3。連翹乙酸乙酯部位、化合物連翹脂素、陽性給藥組的血漿中TC，TG，LDL-C均較高脂模型對照組有所降低，數據差異有顯著意義，而對HDL-C無顯著影響；且連翹乙酸乙酯部位給藥組與陽性藥組相比，能更加顯著的降低血眾中LDL-C的水平。(2)連翹葉乙酸乙酯部位和化合物連翹脂素對高脂血症小鼠抗氧化能力的影響，由表3數據可知，連翹乙酸乙酯部位、化合物連翹脂素、陽性給藥組與高脂模型對照組相比，血漿中MDA的含量均有所下降，數據差別有顯著意義，且乙酸乙酯部位可使血漿中SOD酶的活性有所升高，可提高機體的抗氧化能力，抑制氧化低密度脂蛋白LDL-C的產生。表明連翹可能通過氧化途徑(升高S0D、降低MDA)來降低血脂水平。表3連翹葉乙酸乙酯部位與連翹脂素對營養性高脂血症小鼠血脂及抗氧化能力的影響(x±s)tableseeoriginaldocumentpage7注與正常對照組比較A代表顯著性差異，AA代表非常顯著性差異，AAA代表極顯著性差異；與高脂模型組比較*代表顯著性差異，**代表非常顯著性差異，***代表極顯著性差異。由連翹的體內外實驗可知，含有連翹脂素的部位作用效果上與單體相似，但對總膽固醇的降低作用有差異，好於單體和決明子降脂片的作用，可能是該部位含有不同的木脂素單體的原因，目前我們己經分離得到該部分的木脂素5個，經過結構確證發現都是駢四氫呋喃木脂素，同時，該部分還有槲皮素的存在，這些化合物可能是多靶點作用，並且有協同增效。另外，該部位也能極顯著的降低LDL，已知LDL主要是與膽固醇呈現正相關，當LDL含量高的時候，TC和TG也相應的增多。以下是對連翹葉乙酸乙酯部位進行了有效成分的含量測定。紫外法測定儀器試劑UV-2000型紫外可見分光光度計(尤尼可上海儀器有限公司)，電子天平(梅特勒-託利多儀器有限公司)，旋轉蒸發儀(東京理化)，電熱套(北京中興偉業儀器有限公司)，甲醇為國產分析純。樣品的製備取7月連翹葉1.1264g，8月葉1.0369g，分別用100ml乙酸乙酯提取2次，合併濾液，減壓回收溶劑，得7月葉浸膏0.1277g，8月葉浸膏0.1715g。取7月葉浸膏0.0076g，8月浸膏0.0080g，分別用甲醇溶解至3ml，再分別取100ul稀釋至4ml備用。標準曲線的建立取標準品連翹脂素1.4mg，用甲醇配製成一系列濃度，並在280nm波長處用紫外分光光度計測定其吸光度，見表4。據表4做標準曲線，見圖1。表4標準品濃度mg/ml吸光度A0.01750.3510.0280.4220.0560.6550.070.7570.280.912樣品的測定以甲醇為空白對照，測定7月葉浸膏和8月葉浸膏的吸光度分別為0.366、0.533，根據標準曲線求出木脂素含量。結果(1)7月採集連翹葉浸膏(乙酸乙酯提取)得率為11.34%，浸膏中總木脂素含量為315.2mg/g，原藥材中木脂素含量35.73mg/g;(2)8月葉浸膏(乙酸乙酯提取)得率為16.54%，浸膏中木脂素的含量為617.9mg/g，原藥材中木脂素的含量為102.20mg/g。8圖1為標準品濃度與吸光度之間的標準曲線圖。具體實施方式實施例1本實施例的有效部位——乙酸乙酯部位的製備方法如下取乾燥連翹葉，用丙酮與水按體積比為7:3冷浸3次，每次7天，過濾，合併濾液減壓回收溶劑得濃縮物。將濃縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位。實施例2取實施例l製得的乙酸乙酯部位，進行矽膠常壓柱(200-300目)層析，石油醚一乙酸乙酯15:l洗脫，洗脫物經過丙酮凝膠柱層析，氯仿環己垸甲醇=9:9:2凝膠柱層析，得到化合物連翹脂素。結構鑑定-性狀無色針狀結晶(甲醇重結晶)鑑定分子式C21H2406，分子量372儀器材料熔點用四川科學儀器廠生產的XRC-1型顯微熔點儀測定，溫度計未校正；1H，13CNMR圖譜由Brukeram-400MHz核磁共振儀測定。化合物連翹脂素，mpl33134。C。'H-麗R(DMSO-oQS:8.93(1H，S，4-0H)，6.77.0(6H，Ar-H),4.79(1H，d，力5.9Hz，H-7')，4.31(1H，d，戶6.9Hz，H-7)，4.06(1H，dd，,9.2Hz，aH-9)，3.76、3.75、3.74(9H,3xOCH3)，3.72、3.69(eH-9，eH-9')，3.40(1H，m，aH-9')，3.05(1H，m，H—8)，2.82(1H，m，H—8)。13C—麗R(DMSO-oQS:132.3(C-l)，110.2CC-2)，147.5(C-3)，145.9(04)，115.1(C—5)，118.6(C-6)，87.0(C-7),53.9(C-8)，70.3(C-9),131.2(C-1')，109.3(C—2')，148.4(C-3')，147.5(C-4')，111.4(C-5117.5(C-6')，81.2(C-7')，49.3(C—8')，68.8(C-9')，55.4、55.4、55.5(3xOCH3)。13C_NMR譜中在S100150有12個不飽和碳信號，提示分子中可能存在兩個不對稱苯環。力-麗R譜中S8.93(1H，s)為酚羥基質子信號，53.75(9H，s)為三個與芳環相連的甲氧基上的質子信號，結合130麗R譜中存在555.5，55.4，55.4三個連氧碳信號，提示分子中含有三個甲氧基。13C-麗R譜中除去兩組苯環及三個甲氧基碳信號，還有六個脂肪碳及連氧碳信號，提示該化合物可能為非對稱的木脂素類化合物。結合文獻報導，鑑定該化合物為連翹脂素(phillygenin)。最後所應說明的是以上實施例僅用以說明，而非限制本發明的技術方案，儘管參照上述實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解依然可以對本發明進行修改或者等同替換，而不脫離本發明的精神和範圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。權利要求1、一種連翹降血脂有效部位，其特徵在於該有效部分為連翹葉經丙酮與水提取後經濃縮而得的乙酸乙酯部位。2、一種如權利要求1所述的連翹降血脂有效部位的製備方法，其特徵在於包括以下步驟將連翹葉或者連翹果實用丙酮與水按體積比7:3重複冷浸3次，每次7天，過濾，合併濾液減壓回收溶劑得濃縮物，將濃縮的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，得乙酸乙酯部位。3、一種如權利要求1所述的連翹降血脂有效部位在製備降血脂及抗氧化活性藥物方面的應用。4、根據權利要求3所述的連翹降血脂有效部位在製備降血脂及抗氧化活性藥物方面的應用，其特徵在於具體為將乙酸乙酯部位進行矽膠常壓柱(200-300目)層析，石油醚一乙酸乙酯按體積比15:l洗脫，洗脫物經過丙酮凝膠柱層析，氯仿環己烷甲醇=9:9:2的體積比進行凝膠柱層析，得到連翹脂素。全文摘要本發明涉及一種連翹降血脂有效部位及其製備方法和應用，該有效部分為連翹葉經丙酮與水提取後經濃縮而得的乙酸乙酯部位。本發明所製備的化合物連翹脂素及其所在的有效部位——乙酸乙部位在體外具有較好的抗氧化活性，體內實驗也表明乙酸乙酯部位和連翹脂素能降低高脂血症小鼠的血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇，且可通過氧化途徑(升高超氧化物岐化酶SOD、降低脂質過氧化產物—丙二醛MDA)來降低血脂水平。並且乙酸乙酯部位對高脂血症小鼠血清總膽固醇的降低作用，要好於連翹脂素和決明子降脂片，對連翹葉乙酸乙酯有效部位進行進一步開發，發揮其多靶點協同預防和治療高血脂等疾病的作用，將具有很好的應用前景。文檔編號A61K127/00GK101537046SQ20081004939公開日2009年9月23日申請日期2008年3月21日優先權日2008年3月21日發明者宋豔麗,康文藝,李彩芳,李曉梅,王金梅,許啟泰申請人:河南大學