基於志賀毒素2型蛋白的方法和組合物的製作方法

2023-08-10 19:45:51 2

專利名稱：基於志賀毒素2型蛋白的方法和組合物的製作方法
技術領域：
一般而言，本發明涉及治療和預防志賀毒素(Shiga toxin)相關疾病的領域。
背景技術：
在美國，生成志賀毒素(Mx)的大腸桿菌(STEC)每年造成約110，000例感染。腸出血性大腸桿菌(EHEC)(最顯著地是血清型0157:H7)是被發現產生Stx介導的疾病的 STEC的子集(subset)。生成Mx的生物體的感染的一種可能併發症是溶血性尿毒症症候群(HUQ，其特徵在於溶血性貧血、栓塞性血小板減少症和腎衰竭。對於具有HUS的那些人而言，存在大約5-10%病死率，且倖存者可能具有持續的腎損傷。目前，沒有FDA批准的用於減輕或預防由Mx-介導的疾病引起的疾病的療法或疫苗，但是幾個在將來有前途的選擇包括結合和中和的人源化的單克隆抗體，和嵌合的ΜχΑ2/ΜχΒ1類毒素，其引起中和應答並提供對Mxl或或Mxl和Stx2的致死攻擊(challenge)的保護。基本上存在Mx的2個主要類型Α χ/Μχ 和Mx2。Mx由痢疾志賀氏菌 (Shigella dysenteriae) 1型生成，而Stxl和Stx2由大腸桿菌生成。Stx和Stxl基本上相同，僅在A亞基中存在1個胺基酸差異。Mxl和的成熟的A和B亞基分別具有68%和 73%相似性。儘管存在胺基酸序列差異，Stx和的晶體結構非常類似(圖1)。通過多克隆抗血清可以辨別這些毒素針對Mxl產生的多克隆抗血清不會中和Mx2，反之亦然。 存在 Stxl 和 Stx2 的變體，包括 Stxlc、MxlcUtx2c、Mx2cUtx2d-可活化的(Stx2_act.)、 Stx2e 和 Stx2f0志賀毒素是具有AB5結構的複雜的全毒素。活性結構域(A)含有將60S核糖體亞基的^S rRNA脫嘌呤化的N-糖苷酶，其終止蛋白合成，並最終導致細胞死亡。A亞基是 32kDa，且被胰蛋白酶(trypsin)或弗林蛋白酶(furin)蛋白水解性地切割成 ^kDa A1亞基和 5kDa A2肽，它們通過單個二硫鍵相連。A1亞基含有活性結構域，且A2肽將該活性結構域非共價地連接到結合(B)結構域上。(B)結構域由5個相同的 7. 7kDa單體組成，所述單體形成五聚體，A2肽的C-端貫穿該五聚體。B亞基單體中的每一個具有2個半胱氨酸殘基，它們在每個單體內形成二硫鍵。B五聚體結合真核受體三聚己糖神經醯胺(三己糖基神經醯胺，globotriaosyl ceramide) (Gb3)(或 Gb4,如對於 Stx2e 的情況)。儘管已知暴露於這些毒素的結果，目前尚不存在對Mx-介導的疾病的已知治療或疫苗。抗生素的使用可能通過增加細菌的毒素釋放而加重該情況。因而，需要預防或治療由志賀毒素造成的EHEC感染的併發症的化合物。這樣的化合物可以用於治療受感染的受試者，並減少毒素對中樞神經系統(CNS)、血液和腎的系統性作用。另外，如果可以中和毒素，可以安全地給予抗生素，以殺死胃腸(GI)道中的細菌。由於抗生素通過誘導攜帶毒素基因的噬菌體而增加毒素生成的可能性，STEC感染的抗生素治療被禁忌。這樣的化合物也可以用於預防感染的併發症，其通過在個體獲得EHEC感染之前治療暴露的或高危的個體而進行。這樣的個體將包括日間住院醫療的兒童或在醫護療養所中的老年人，該處已經鑑別出EHEC腹瀉的病例。這些個體處於發展EHEC感染的高危中，經常具有嚴重的併發症，且EHEC在這些環境中的傳播並不罕見。

發明內容
單克隆抗體11E10會識別的A亞基，並中和它的細胞毒性。儘管MxAl和 MxA2之間存在68%胺基酸(aa)序列相似性，11E10單克隆抗體不會結合MxAl。我們已經發現，11E10表位包括跨MxA2單體上的3個區域的不連續的或構象的表位。發現3個不同性區域在Stx2A亞基的晶體結構上的位置彼此鄰近，所述3個不同性區域包括胺基酸 42-49 (SEQ IDNO 1) ,96-100 (SEQ ID NO 2)和 244-259 (SEQ ID NO :3)。因此，我們已經發現，11E10表位包括以SEQ ID NO :1、2和3示出的序列中的至少1個、2個或所有3個。因此，本發明的特徵在於一種多肽，其包括在SEQ ID N0:l、2和3中所述的胺基酸序列的至少1個、2個或3個，其中所述多肽不是全長Mx2。所述多肽至少包括在SEQ ID NO 1中所述的胺基酸序列。理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO :1和2中所述的胺基酸序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID NO :1、2和3中所述的胺基酸序列。在一個實施方式中，在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的一個或多個被插入非-Stx2蛋白支架(protein scaffold)中。在某些實施方式中，所述蛋白支架是與Mxl或其片段基本上相同的蛋白， 例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%相同。在一個實施方式中，所述蛋白支架是^^、Stx或攜帶一個或多個保守點(位點，point)突變的 Mxl。在另一個實施方式中，本發明的多肽包括與在SEQ ID NO :8中所述的胺基酸序列基本上相同的胺基酸序列。在另一個實施方式中，所述多肽可以包括的片段，其包括SEQ ID N0:l、2或3;SEQ ID NO :1和2;或SEQ ID NO :1、2和3，例如，Stx2多肽序列的胺基酸四-297、胺基酸1-158或胺基酸，其中所述片段不是全長Mx2。在有些實施方式中， 所述片段被插入蛋白支架(例如，Stx或Mxl)中。本發明的特徵還在於一種多肽，其包括與在SEQ ID NO :8中所述的胺基酸序列的片段基本上相同的胺基酸序列。在一個實施方式中，所述片段包括與SEQ ID NO :8的胺基酸 64-122 至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 相同的序列，且另外至少包括在SEQ ID NO :1中所述的胺基酸序列。優選地，所述片段另外包含在SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :2和3中所述的(一個或多個)胺基酸序列。所述片段的長度可以是，例如，20、40、59、60、150、200、219、236、250、300或314個胺基酸。在某些實施方式中，所述多肽被類毒素化。所有上述多肽都被包括在術語「本發明的多肽」內。本發明也包括編碼任一種本發明的多肽的核酸分子，包括其中所述核酸被連接到載體中的表達構建體上，且其中該載體被插入宿主細胞中。在一個有關的方面，本發明的特徵在於一種用於使用任一種本發明的多肽刺激針對的免疫應答的組合物。理想地，所述多肽包括在SEQ IDNO :1和2中所述的序列，或更理想地，所述多肽包括在SEQ ID N0:l、2和3中所述的序列。在這些實施方式的任一個中，所述組合物可以另外包括佐劑(adjuvant)。在某些實施方式中，所述組合物不會刺激針對Mxl的免疫應答。本發明的特徵還在於任一種本發明的多肽(例如，蛋白支架如Stxl，其插入了在 SEQ ID N0:l、2或3中的至少1個、2個或所有3個中所述的胺基酸序列)的應用。這樣的肽可以用於針對任意志賀毒素有關的疾病進行免疫或治療，所述疾病包括溶血性尿毒症症候群和與大腸桿菌和痢疾志賀氏菌感染有關的疾病。在一個實施方式中，所述肽與在SEQ ID NO 8 中所述的胺基酸序列具有至少 75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在另一個方面，本發明的特徵在於生產特異性地結合乂口的11E10表位的抗-Stx2抗體(例如，單克隆和多克隆抗體)或其片段的方法。這樣的抗體或片段特異性地結合Mx2，而不結合乂^。該方法包括，用多肽免疫哺乳動物，所述多肽包括的片段(S卩，非全長Mx2)，所述的片段包括在SEQ IDNO=U 2和3中所述的序列的至少1個、2個或3個，其中該多肽不包括全長Mx2。優選地，所述方法包括，使用這樣的多肽，所述多肽至少含有在SEQ ID NO :1中所述的序列，更優選在SEQ ID NO :1和2中所述的序列，甚至更優選在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列。在一個實施方式中，所述肽包括蛋白支架，例如與Mxl基本上相同的蛋白，其插入了在SEQ ID NO 1,2 和3中所述的一個或多個胺基酸序列。所述方法可以包括，用含有11E10表位的多肽(例如，如本文所述的)免疫哺乳動物，其中所述多肽不包括全長Mx2。在一個實施方式中，用含有與在SEQ ID NO :8中所述的胺基酸序列基本上相同的胺基酸序列的多肽免疫哺乳動物。使用本領域已知的或本文所述的標準方法，可以篩選通過上述方法生產的抗_Stx2抗體，所述方法包括，例如，體外中和試驗，以鑑別特異性地結合且不結合Mxl的抗體。 還包括免疫原性多肽和製備該多肽的方法、以及編碼該多肽的核酸分子(包括其中該核酸被連接到載體中的表達構建體上，且其中該載體被插入宿主細胞中)，作為本發明的有關方面。本發明的特徵還在於特異性地結合的11E10表位的抗-Stx2抗體或其片段， 其中所述抗體或其片段特異性地結合且不結合Mxl。優選的本發明的抗體結合這樣的表位，其包括在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的至少1個、2個或所有3個，理想地至少包括SEQ ID NO :1，更理想地至少包括SEQ ID NO 1和2，最理想地含有SEQ ID NO :1、2 和3。所述抗體表位可以是構象表位，其中基於蛋白支架的構象，所述胺基酸序列是鄰近的， 例如，如在本文所述的嵌合蛋白中，其中在SEQ ID N0:l、2和3中所述的乂口序列的一個或多個被插入與Mxl基本上相同的蛋白支架中。所述抗體可以是IgG、IgM、IgE、IgD、IgA、 Fab、Fv、單克隆和多克隆抗體或抗體片段，且可以通過本文所述的方法開發。所述抗體優選地以小於 10011]\1、5011]\1、1011]\1、111]\1、10(^]\1、1(^]\1或讓]\1或更小的1((1結合乂12。在一個實施例中，本發明的抗體抑制11E10抗體與的結合或與含有11E10表位的嵌合蛋白的結合， 包括以IOOnM至IpM的Kd值進行抑制。本發明的抗體可以抑制結合真核受體三聚己糖神經醯胺(彌；3)。本發明的抗_Stx2抗體特別地排除下述抗體的任何小鼠、人源化或嵌合形式11E10、TMA-15、VTM1. 1、5C12(包括 5C12 人單克隆抗體和 r5C12)、6G3、5H8、11F11、 11G10、2E1、10E10、IG3、2F10、3E9、4H9、5A4、5F3、5C11、1A4、1A5、BC5BB12、DC1、EH5、EA5BA3、 ED5DF3、GB6、BA4和c α Stx2抗體。本發明另外包括生產任一種本發明的抗體的雜交瘤細胞系。本發明的另一個方面的特徵在於使用任一種本發明的抗_Stx2抗體檢測生物樣品(例如，組織、細胞、細胞提取物、體液和活組織檢查樣品)中的的方法。本發明的檢測方法包括、但不限於，ELISA、RIA、蛋白印跡法、免疫沉澱和流式細胞術。本發明包括，基於樣品中的鑑別診斷志賀毒素相關疾病。本發明的特徵還在於用於檢測志賀毒素相關疾病的免疫檢驗試劑盒，所述試劑盒包括本發明的抗體，和用於檢測所述抗體和樣品中存在的之間的相互作用的裝置(means)。本發明的另一個方面的特徵在於使用本文提供的或通過任一種前述方法生產的抗體治療志賀毒素相關疾病的方法。志賀毒素相關疾病的實例包括溶血性尿毒症症候群 (HUS)和與大腸桿菌和痢疾志賀氏菌感染有關的疾病。這些抗體可以與其它治療聯合給予， 所述其它治療包括但不限於特異性地結合其它志賀毒素相關蛋白(例如，Stxl)的抗體。「11E10表位」是指這樣的胺基酸序列，其作為線性結構或三維構象的結果，形成 11E10抗體的結合位點。該術語可以包括任意的非全長乂口蛋白，所述非全長蛋白包括與在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的1個、2個或3個(例如，SEQ ID NO 1和2， 或SEQ ID N0:l、2和3)相同或基本上相同的序列。在希望的實施方式中，11E10表位包括 SEQ IDNO :1和2、或1、2和3。包括11E10表位的蛋白的一個實例是包括與在SEQ ID NO: 8中所述的胺基酸序列基本上相同的胺基酸序列的蛋白。術語「特異性地結合的11E10表位的抗體」或「11E10表位特異性的抗體」是指這樣的抗體，其以IOOnM-IpM的Kd值結合包含11E10表位的蛋白。這樣的抗體還被表徵為，微弱的或沒有可檢測的與Mxl蛋白的結合(例如，對於Mxl具有大於100nM、200nM、 500nM、1 μ Μ、10 μ Μ、100 μ Μ、ImM或更大的Kd值)。使用本領域已知的任意測定法，包括、但不限於基於表面等離子體共振的測定法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)和競爭測定法(例如RIA’s)，可以測定抗體親和力。另外，可以對抗體進行本文所述的體外中和測定。使用本文所述的或本領域已知的測定法，特異性地結合11E10表位的抗體可以中和的細胞毒性效應至少10%、20%、30%、40%、50%、75%或更大。該術語特別地排除了下述抗_Stx2 抗體的小鼠、嵌合、人源化或人形式=IlElO, TMA-15、VTM1. 1、5C12 (包括5C12人單克隆抗體和 r5C12(Akiyoshi 和 Tzipori (2005)Infect. Immun. 73 :4054-4061)、6G3、5H8、11F11、 llG10、2El、10E10(Perera 等人(1988)J. Clin. Microbiol. 26 :2127-2131)、IG3、2F10、 3E9、4H9、5A4、5F3、5Cll、lA4、lA5(Ma 等人(2008)Immunol. Lett. 121 :110-115Q008))、 BC5BB12、DC1EH5、EA5BA3、ED5DF3、GB6、BA4(Downes 等人(1988) Infect. Immun. 56 1926-1933), c α 抗體、在 Smith 等人((2006) Vaccine24 :4122-4129)中所述的抗體、 在 Donohue-Rolfe 等人((1999) Infect Immun. 67 :3645-364)中所述的抗體和在 Sheoran 等人((2003) Infect Immun. 71 :3125-3130)中所述的抗體。「抑制結合」是指，使一種蛋白與另一種蛋白的結合減少了至少50%，優選60%、 70 %、80%、90 %或更多，這通過例如本文所述的蛋白印跡法或通過ELISA或本領域已知的 Gb3受體結合測定法來測得。術語「抗體」以最廣泛的含義使用，包括單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)或抗體片段，只要這樣的分子具有所需的生物活性(例如，中和本文所述的毒素)。本文使用的「純化的」或「分離的」表示已經從它的天然環境的組分中鑑別出來和分離和/或回收的蛋白。它的天然環境的汙染物組分是通常幹擾所述蛋白的診斷或治療用途的物質，且可以包括酶、激素和其它蛋白性的(proteinaceous)或非蛋白性的 (non-proteinaceous)溶質。「類毒素化」是指，例如通過突變、結合(綴合，conjugation)或交聯，以減少細胞毒性且維持抗原性的方式改變。的類毒素化形式包括甲醛-和戊二醛-處理過的Stx2和具有Y77S突變的Mx2。類毒素化的Stx蛋白的其它非限制性實例是攜帶Y77S和 E167Q 突變的 Stx2 (Wen 等人(2006) Vaccine 24 :1142-1148)、攜帶 E167D 和 6 組氨酸標籤的 Stx2 (Robinson 等人(2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 103 :9667-9672)、攜帶 Y77S、 E167Q 和 R170L 突變的 ΜχΑ2/ΜχΒ1 類毒素(Smith 等人，Vaccine 24 :4122-4129 (2006))。 其它實例描述在 Gordon 等人((1992nnfect. Immunol. 60(2) :485-490)中。「非全長Stx2」是指這樣的蛋白，其含有全長多肽的小於90^^85^^80%, 75%、70%、65%、60%或更少的胺基酸。非全長 X2的實例包括、但不限於，在SEQ ID N0: 4-8中所述的胺基酸序列。其它實例包括這樣的多肽，其包含的胺基酸四-297、1-158 或四-1觀或由它們組成，包括，例如在圖IA中提供的嵌合多肽。野生型Mxl、Stx2或在本申請內描述的嵌合毒素的A亞基都具有22個胺基酸的前導序列，其被去除，從而產生成熟 A亞基蛋白。為了本說明書的目的，術語「全長Mx2」和片段的胺基酸編號表示全長成熟的MxA2亞基。該成熟A亞基以後被胰蛋白酶或弗林蛋白酶不對稱地切割成Al片段 (N-端 248個胺基酸)和A2肽(C-端 50個胺基酸)。A亞基(天然的或嵌合的形式) 通常存在於全毒素的背景下；但是，在單獨表達時(例如，沒有B亞基)，A亞基或其片段可以引起針對11E10表位的免疫應答。本文使用的術語「蛋白支架」或「支架」表示這樣的蛋白結構，其已經插入了異源蛋白的一個或多個胺基酸序列，例如，在SEQ ID N0:l、2或3中所述的乂口胺基酸序列。優選地，蛋白支架的三維結構是已知的，且異源蛋白的片段被插入在關鍵位置，例如，在表面暴露的環處，或在蛋白支架和異源蛋白之間的結構同源性區域。Stx2的片段的插入，可以伴隨著選擇性地刪除蛋白支架的某些序列，例如，與要被插入的序列具有結構同源性的序列。 在該實例中，蛋白支架的未刪除的序列可以用於確定與另一種蛋白(例如，Stxl)的序列同一性百分比。已經用作蛋白支架的示例性的蛋白是Stx或^xl (本文所述)、綠色螢光蛋白 (Abedi等人(1998) Nucleic Acids Res. 26 :623-630)、和細胞毒性T淋巴細胞-相關的抗原4(CTLA-4) (Hufton等人(2000) FEBS Iett. 475 :225-231)。蛋白支架特別地排除異源蛋白序列與其末端融合的蛋白標籤，例如，FLAG表位或穀胱甘肽-S-轉移酶。「基本上相同的」是指，當最佳地比對(例如使用下述的方法)時，與第二核酸或胺基酸序列(例如，Stx2、Stxl或嵌合蛋白，諸如在SEQ ID NO 8中所述的序列)具有至少 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 序列同一性的核酸或胺基酸序列。「基本同一性」可以用於表示不同類型和長度的序列， 諸如全長序列、表位或免疫原性肽、功能結構域、編碼和/或調節序列、外顯子、內含子、 啟動子和基因組序列。以不同的方式測定2個多肽或核酸序列之間的同一性百分比，所述方式屬於本領域的常識，例如，使用可公開得到的計算機軟體，諸如Smith Waterman比對(Smith, Τ. F.和 Μ. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147 :195-7)；「最佳擬合」 (Smith 禾口 Waterman (1981) Advances inApplied Mathematics, 482—489),其整合進 GeneMatcher Plus 中(Schwarz禾口Dayhof (1979)Atlas of Protein Sequence and Structure,Dayhoff, M. 0.編，第；353-358頁)；BLAST程序(基礎的局部比對搜索工具(Altschul，S. F. ,W. Gish, 等人(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST_2、 ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign (DNASTAR)軟體。另外，本領域技術人員可以確定用於測量比對的適當參數，包括在要對比的序列長度上實現最大比對所需的任意算法。一般而言，對於蛋白，對比序列的長度可以是至少5個胺基酸，優選10、25、50、100、150、200、300 或315個胺基酸或更多達到蛋白的整個長度。對於核酸，對比序列的長度通常可以是至少 15、75、150、300、450、600、900或945個核苷酸或更多達到核酸分子的整個長度。應當理解， 對於測定序列同一性的目的，當對比DNA序列和RNA序列時，胸腺嘧啶核苷酸等同於尿嘧啶核苷酸。在一個實施方式中，可以在SEQ ID NO :8的片段(例如，SEQ ID NO :8的胺基酸 64-122或64-282)長度上，測量蛋白(例如，志賀毒素蛋白的成熟A亞基)的序列同一性。 對於胺基酸序列，保守替換(替代、置換，substitutions)通常包括在下述組內的替換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺；絲氨酸、 蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。「片段」是指多肽或核酸分子的一部分，其含有參照核酸分子或多肽的整個長度的小於 100%，優選至少 2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%。 片段可以含有，例如，10、15、75、150、300、450、600、900或945或更多個核苷酸，或4、5、10、 25、50、100、150、200、300、315個胺基酸或更多。志賀毒素1型或志賀毒素2型蛋白的片段可以包括小於全長蛋白的任意部分，例如，長度為4、5、8、10、25、50、100、150、200、300、315、或更多個胺基酸的片段。在一個實施例中，片段包括SEQ ID NO :8的胺基酸64-122或64-282。「志賀毒素相關疾病」是指由表達志賀毒素的病原體導致的任意疾病。術語「志賀毒素相關疾病」意在包括溶血性尿毒症症候群、志賀細菌性痢疾(shigellosis)、和由生成志賀毒素的大腸桿菌和痢疾志賀氏菌感染導致的疾病。


圖IA示出了最初的雜種(雜交，hybrid) Mxl/Stx2A亞基。Stxl以黑色顯示，Stx2 以白色描繪。在各個嵌合蛋白的左側顯示了嵌合毒素的名稱，在嵌合的A亞基的下面列出了 的區域。圖IB顯示了用兔抗-Stxl和抗-Stx2多克隆(上圖)或單克隆11E10 (下圖)探測(作為探針檢測，probe)的Stxl、Mx2和最初的嵌合毒素的蛋白印跡分析。泳道1和2 分別含有25ng純化的Stxl或Stx2。泳道3-8含有下述嵌合毒素泳道3，Stxl (2A29_297)； 泳道 4，Stxl (2Ah58)；泳道 5，Stxl(2A29_128)；泳道 6，Mxl QA29_76)；泳道 7，Stxl (2A42_76)；泳道 8，Stx 1(2A42_49)。圖IC顯示了 11E10單克隆抗體對最初的嵌合毒素的中和百分比。將中和數據標準化，使得全的％中和設定為100% (實際的％中和=65% )，並以標準化的全長 Stx2中和的百分比，給出其它毒素的中和水平。誤差棒代表標準化的值的標準誤差。圖2A顯示了 MxAl和MxA2在包含1 IElO單克隆抗體表位的3個區域中的胺基酸比對。黑色和灰色胺基酸分別描繪了保守的和非保守的胺基酸；點代表相同的殘基。11E10 單克隆抗體表位的3個區域如下區域A (MxA2殘基42-49)、區域B (StxA2殘基96-100)、區域C (StxA2殘基M4-259)。在比對中顯示的胺基酸的編號是相對於MxAl成熟蛋白。StxAl 具有在位置185處的額外胺基酸；該添加造成區域C(在MxA2中的表位)成為與Mxl的對應區域不同的一個編號。圖2B顯示了晶體結構的條帶圖，它用淺灰色顯示了 Μχ2Α1和B亞基，11E10單克隆抗體表位的3個區域除外。區域A(綠色)、B (藍色)和C(青色)分別用黑色、灰色和白色的箭頭標記。用黑色描繪A2肽，且用星號標記活性部位(紅色)。圖2C顯示了晶體結構的填空表示(spacefill representation)。用箭頭指示區域A、B和C。圖3A示出了含有嵌合的A亞基的第二代嵌合毒素。Mxl以黑色顯示，而以白色描繪。在各個嵌合蛋白的左側顯示了嵌合毒素的名稱，在嵌合的A亞基的下面列出了 Stx2 的區域。區域 A、B 和 C 分別表的胺基酸 42-49 (SEQ ID NO 1) ,96-100 (SEQ ID NO 2)、244-259(SEQ IDNO 3)。圖:3B描述了用兔抗-Stxl (上圖)或11E10單克隆抗體(下圖)探測的Mxl、Stx2 和5個第二代嵌合毒素的蛋白印跡分析。泳道1含有25ng純化的Mx2。泳道2_6含有下述嵌合毒素泳道2，Stxl+A ；泳道3，Stxl+AB ；泳道4，Stxl+AC ；泳道5，Stxl+BC ；泳道6， Stxl+ABCο圖3C顯示了 11E10單克隆抗體對第二代雜種毒素的中和。將中和的水平標準化為100%，如在圖IC中所示。誤差棒代表標準化的值的標準誤差。圖4A顯示了使用11E10單克隆抗體對和變體的蛋白印跡分析。泳道 1含有25ng純化的Mx2。泳道2-5含有下述毒素泳道2，Stx2c ；泳道3，Stx2d ；泳道4， Stx2dact ；泳道5，Mx2e。用兔抗_Stx2多克隆抗體(上圖)或單克隆抗體11E10 (下圖)探測蛋白印跡。圖4B描述了 11E10對變體的中和百分比。將中和的水平標準化為 100%，如在圖IC中所示。誤差棒代表標準化的值的標準誤差。圖5描述了通過兔網織紅細胞裂解物中螢光素酶mRNA的翻譯測得的蛋白合成抑制。將純化的的0. 2ng等分試樣與0、0. 2或2ng 11E10相混合，並加入網織紅細胞裂解物中。通過螢光素酶mRNA的翻譯的減少，指示蛋白合成抑制，並在向螢光素底物加入毒素-處理過的裂解物以後，通過生物發光測量。將2ng同種型-匹配的(isotype-matched) 無關的抗體13C4樣品與2ng 相混合，作為陰性對照。誤差棒代表從平均比標準誤差計算出的95%置信區間。從雙尾Mudent氏t_檢驗衍生出的概率值指示含有和沒有抗體的樣品之間的生物發光信號的顯著差異(P < 0. 005)。圖6A-6J證實，單克隆抗體11E10會改變Vero細胞中的總細胞分布。將 Stx2與PBS (A、H-J)或11E10 (B、C和E-G)相混合，然後加給Vero細胞他。作為對照，在沒有
存在下，將11E10加給Vero細胞(D)。用針對的多克隆抗體、然後用AlexaFluor 488結合的第二抗體檢測毒素(A和B)，而用AlexaFluor 488結合的抗-小鼠IgG檢測 11E10(C和D)。通過中毒的細胞的雙重標記，評估與初級內體(內涵體，endosome)標誌物EEAl的共區域化。用抗_Stx2單克隆IlFll和綠色螢光第二抗體，使在有(圖E)和沒有(圖H)抗體11E10存在下的乂口分布顯現出來(可視化，visualize)。用山羊抗-EEAl 和紅色螢光第二抗體，使內體標誌物EEAl的分布顯現出來(圖F和I)。使這些染色圖案重疊(圖G和J)，並用黃-橙染色(用箭頭指示)，指示毒素與內體的共區域化。圖7A-7D顯示了 x2區域A(SEQ ID NO 1)(圖 7A)、Stx2 區域 B (SEQ ID NO 2) (圖 7B)、Stx2 區域 C (SEQ ID NO :3)(圖 7C)和 Stx2e 區域 B (SEQ ID NO :19)(圖 7D)的胺基酸序列。
圖8A顯示了 Mxl+A嵌合體的胺基酸序列(SEQ ID NO 4)。加工過的前導序列標有下劃線，Stx2A區域是粗體且標有下劃線。未加工的蛋白的長度是315個胺基酸；成熟蛋白的長度是293個胺基酸。圖8B顯示了 Mxl+AB嵌合體的胺基酸序列(SEQ ID NO :5)。加工過的前導序列標有下劃線，Stx2A和B區域是粗體且標有下劃線。未加工的蛋白的長度是315個胺基酸； 成熟蛋白的長度是293個胺基酸。圖8C顯示了 Mxl+AC嵌合體的胺基酸序列(SEQ ID NO :6)。加工過的前導序列標有下劃線，Stx2A和C區域是粗體且標有下劃線。未加工的蛋白的長度是315個胺基酸； 成熟蛋白的長度是293個胺基酸。圖8D顯示了 Mxl+BC嵌合體的胺基酸序列(SEQ ID NO 7)。加工過的前導序列標有下劃線，Stx2B和C區域是粗體且標有下劃線。未加工的蛋白的長度是315個胺基酸； 成熟蛋白的長度是293個胺基酸。圖8E顯示了 Mxl+ABC嵌合體的胺基酸序列(SEQ ID NO 8)。加工過的前導序列標有下劃線，Stx2A, B和C區域是粗體且標有下劃線。未加工的蛋白的長度是315個胺基酸；成熟蛋白的長度是293個胺基酸。圖9A顯示了 Mxl操縱子的DNA序列(SEQ ID NO 9)，其從MxAl起始密碼子處開始，並在MxBl終止密碼子處結束。圖9B顯示了 MxAl的DNA序列(SEQ ID NO :10)，其從MxAl起始密碼子處開始， 並在MxAl終止密碼子處結束。圖9C顯示了 StxBl的DNA序列(SEQ ID NO :11)，其從MxBl起始密碼子處開始， 並在MxBl終止密碼子處結束。圖IOA顯示了 MxAl的胺基酸序列(SEQ ID N0:12)。加工過的前導序列標有下劃線。未加工的蛋白的長度是315個胺基酸；成熟蛋白的長度是293個胺基酸。圖IOB顯示了 StxBl的胺基酸序列(SEQ ID N0:13)。加工過的前導序列標有下劃線。未加工的蛋白的長度是89個胺基酸；成熟蛋白的長度是69個胺基酸。圖IlA顯示了操縱子的DNA序列(SEQ ID NO 14)，其從MxA2起始密碼子處開始，並在MxB2終止密碼子處結束。圖IlB顯示了 MxA2的DNA序列(SEQ ID NO 15)，其從MxA2起始密碼子處開始， 並在MxA2終止密碼子處結束。圖IlC顯示了 MxB2的DNA序列(SEQ ID NO 16)，其從MxB2起始密碼子處開始， 並在MxB2終止密碼子處結束。圖12A顯示了 MxA2的胺基酸序列(SEQ ID NO 17)。加工過的前導序列標有下劃線。未加工的蛋白的長度是319個胺基酸；成熟蛋白的長度是297個胺基酸。圖12B顯示了 StxB2的胺基酸序列(SEQ ID NO 18)。加工過的前導序列標有下劃線。未加工的蛋白的長度是89個胺基酸；成熟蛋白的長度是70個胺基酸。
具體實施例方式一般而言，本發明的特徵在於與蛋白的11E10表位的發現有關的組合物和方法。我們已經發現，11E10表位包括在SEQ ID NO :1、2和3中所述的序列的至少1個、2個或3個。本發明的組合物和方法可以用於檢測、治療或預防志賀毒素相關疾病。例如，用含有11E10表位的肽或用特異性地結合蛋白的11E10表位的抗體，可以治療具有志賀毒素相關疾病(例如，溶血性尿毒症症候群和與大腸桿菌和痢疾志賀氏菌感染有關的疾病) 或處於發展所述疾病的風險中的受試者(主體、對象，subject)。I.適應症志賀毒素相關疾病包括由生成志賀毒素的痢疾志賀氏菌或腸出血性 (enterohemorrhagic)大腸桿菌(EHEC)(最特別地，血清型0157:H7)的感染導致的那些疾病。這些感染經常導致溶血性尿毒症症候群(HUQ，其特徵在於溶血性貧血、栓塞性血小板減少症和腎衰竭。本發明的化合物和方法可以用於治療具有志賀毒素相關疾病或處於發展所述疾病的風險中的受試者。這樣的受試者包括日間住院醫療的(in day care)兒童或在醫護療養所中的老年人。在一個實施例中，所述受試者是在日間住院醫療中或在醫護療養所中，該處已經檢測出EHEC腹瀉的病例。在該實施例中，所述受試者可能已經或沒有發展所述疾病。本發明的方法和組合物可以用於治療受EHEC感染的個體中的感染、檢測其它受感染的個體、和預防EHEC在日間住院醫療或醫護療養所中的傳播。II.抗體本發明包括特異性地結合志賀毒素2型(Stx2)蛋白的11E10表位的抗體的生產和抗體本身。理想地，這樣的抗體不會可檢測地結合Mxl。抗體的識別和特異性地結合靶蛋白的獨特能力，提供了用於診斷和治療與生成志賀毒素的大腸桿菌(STEC)有關的疾病的方案。本發明提供了抗體的生產，所述抗體包括、但不限於，多克隆和單克隆抗體、抗-獨特型(anti-idiotypic)抗體、鼠和其它哺乳動物抗體、抗體片段、雙特異性抗體、抗體二聚體或四聚體、單鏈抗體(例如，scFv' s和結合抗原的抗體片段諸如Fab、雙抗體和Fab'片段)、基於抗體結合區的重組結合區、嵌合抗體、靈長類動物化的抗體、人源化抗體和全人抗體、結構域刪除(缺失，deleted)的抗體、和用可檢測的標誌物標記或用毒素或放射性核素偶聯的抗體。這樣的抗體通過本領域已知的常規方法生產。在一個方面，本發明包括特異性地結合的11E10表位的單克隆抗體或抗體片段的製備，其中所述製備包括，使用多肽，所述多肽含有選自在SEQ ID NO :1、2或3中所述的序列的至少1個、2個或3個序列。 一個實例是在SEQ ID NO 8中所述的蛋白。多克隆抗體通過如下免疫兔或其它動物，可以製備多克隆抗體注射抗原，隨後以適當的間隔進行強化。給動物抽血，並通常通過ELISA，針對純化的蛋白測定血清。通過多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射抗原和佐劑，可以在動物體內產生特異性地結合11E10表位的多克隆抗體。使用雙功能試劑或衍生劑(例如，馬來醯亞胺苯甲醯磺基琥珀醯亞胺酯(通過半胱氨酸殘基結合)、N-羥基琥珀醯亞胺(通過賴氨酸殘基結合)、 戊二醛或琥珀酸酐)，將含有11E10表位的肽結合到在被免疫的物種中呈免疫原性的蛋白上(例如，鑰孔嘁血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制劑)，這是有用的。例如，可以針對11E10表位，用免疫原性結合物或衍生物免疫動物，其通過下述進行將Iyg至Img所述肽或結合物(分別對於兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑(Freund' s complete adjuvant)混合，並將此溶液在多個位點皮內注射。一個月後，通過在多個位點皮下注射，用佔原始量1/5至1/10的在弗氏完全佐劑中的肽或結合物強化 (boost)動物。7-14天後，抽取動物血樣，並測定血清的針對抗原或其片段的抗體效價。強化動物，直至效價平穩。優選地，用相同多肽的結合物強化動物，但是所述結合物結合不同的蛋白和/或通過不同交聯劑結合。還可在重組細胞培養物中製備結合物，作為蛋白融合物。還適當地使用明礬等凝聚劑來增強免疫應答。可以在人免疫球蛋白基因的轉基因動物中，或通過從原料(起始材料，starting material)受試者分離2種或更多種反應性的B-淋巴細胞，生產嵌合的、人源化的或全人多克隆抗體。也可以純化和選擇多克隆抗體(例如，對於構象限制的抗原肽，通過親和力)，在必要時重複，以提供單克隆抗體。可替換地或附加地，可以採用從淋巴細胞克隆出編碼單個抗體的核酸。單克隆抗體在本發明的另一個實施方式中，從基本上同源的抗體的群體(即除了可能存在少量天然產生的突變以外，構成(including)群體的單獨抗體是相同的)，得到單克隆抗體。 因此，術語「單克隆」指示抗體的特徵不是離散抗體(discrete antibodies)的混合物。通過本領域已知的方法可以製備單克隆抗體，所述方法例如Kohler和Milstein 的雜交瘤方法，其通過使來自免疫的小鼠的脾細胞與連續複製的腫瘤細胞(諸如骨髓瘤或淋巴瘤細胞)融合而進行(Kohler 和 Milstein(1975)Nature 256 :495-497 ;Gulfre 和 Milstein(1981)Methods in Enzymology Jmmunochemical Techniques 73 :1-46,Langone 和Banatis編，Academic Press)。然後通過有限稀釋方法，克隆雜交瘤細胞，並通過ELISA、 RIA或生物測定，測定上清液的抗體生產。在另一個實施方式中，可以通過重組DNA方法製備單克隆抗體。為了製備特異性地結合IlElO表位的單克隆抗體(Mab)，可以使用由培養的連續細胞系生產抗體分子的任意技術。例如，由上面的Kohler和Milstein((1975)最初開發的、以及在 Kohler 和 Milstein(1976)Eur J Immunol. 6 :511-519 ;Kohler 等人(1976)Eur J Immunol. 6 :292-295 ；Hammerling ^A (1981) B =Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y.，第563-681頁)中的雜交瘤技術，和三源雜交瘤技術，人B-細胞雜交瘤技術(Kozbor等人(198 Immunol Today 4 :72-79)，和用於生產人單克隆抗體的 EBV-^^^^^ (Cole^A (1985) B =Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R. Liss, Inc.，第77-96頁)。這樣的抗體可以屬於任意的免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、 IgE、IgA、IgD和它們的任意子類。可以在體外或在體內培養在本發明中生產Mab的雜交瘤。在本發明的另一個實施方式中，使用本領域已知的技術，可以在無菌動物中生產單克隆抗體。—般而言，用包括IlElO表位的多肽免疫小鼠或其它合適的宿主動物(如倉鼠)， 以誘導淋巴細胞，該淋巴細胞生產或能生產可特異性地結合用於免疫的抗原或其片段的抗體。可替換地，在體外免疫淋巴細胞。取出免疫的宿主動物(例如，小鼠)的脾細胞，並使用合適的融合劑(如聚乙二醇)，使所述脾細胞與合適的細胞系(例如，骨髓瘤細胞系)融合，以形成雜交瘤細胞(Goding(1986)Monoclonal Antibodies Principles andPractice,第59-103頁，Academic I^ress)。根據本發明，可以使用任意合適的骨髓瘤細胞系；但是，優選的骨髓瘤細胞是有效地融合、支持選擇的抗體生產細胞的穩定的高水平抗體生產、且對培養基(諸如HAT培養基)敏感的那些。在它們中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓瘤系，諸如來源於可從Mlk Institute Cell Distribution Center, San Diego，Calif. USA 得到的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤的那些，和可從美國典型培養物保藏中心，Rockville, Md. USA得到的SP-2細胞。可以在合適的培養基中，接種和培養如此製備的雜交瘤細胞，所述培養基優選地含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。然後可以測定通過這樣的選擇和/或培養基(在其中維持雜交瘤細胞)得到的雜交瘤細胞，以鑑別特異性地結合IlElO表位的單克隆抗體的生產。優選地，通過免疫沉澱或通過體外結合試驗諸如放射免疫測定(RIA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)或使用Biacore儀器，測定由雜交瘤細胞生產的單克隆抗體的結合特異性。通過例如Munson和Rodbard ((1980) Anal Biochem. 107 220-239)的katchard分析，可以測定單克隆抗體的結合親和力。鑑別出生產具有所需的特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞後，通過有限稀釋過程，可以亞克隆所述克隆，並通過標準方法培養(Goding，同上)。此外，所述雜交瘤細胞可作為動物的腹水瘤(ascites tumors)在體內生長。通過常規的免疫球蛋白純化方法，例如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石色譜法、凝膠電泳、透析或親和色譜法，可以使由亞克隆分泌的單克隆抗體適當地從培養基、腹水液或血清中分離出來。使用常規方法(例如，使用能夠特異性地結合編碼鼠抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)，可以容易地分離並測序編碼本發明的單克隆抗體的DNA。本發明的雜交瘤細胞用作這類DNA的優選來源。分離後，可以將所述DNA置於表達載體中，然後轉染進宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞、COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中合成單克隆抗體(參見例如，Skerra等人(199;3)Curr Opin Immunol. 5 :256-262 和 Pluckthun(1992)Immunol Rev. 130 151—188)。還可以修飾DNA，例如通過使人重鏈和輕鏈恆定結構域的編碼序列的全部或一部分代替同源的鼠序列(Morrison 等人(1984) Proc Natl AcadSci. U. S. A. 81 :6851-6855), 或通過將非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或一部分共價地連接到免疫球蛋白編碼序列上。以此方式，製備嵌合或雜種抗體，它們具有抗-IlElO表位單克隆抗體的結合特異性。 通常，這種非免疫球蛋白多肽代替本發明抗體的恆定結構域，或者它們代替本發明抗體的抗原結合位點的可變結構域，以產生嵌合的二價抗體，所述嵌合的二價抗體包括一個具有對根據本發明的IlElO表位的特異性的抗原結合位點和另一個具有對不同抗原的特異性的抗原結合位點。修飾的抗體本發明的修飾的抗體包括、但不限於嵌合的單克隆抗體(例如，人-小鼠嵌合體)、人單克隆抗體和人源化的單克隆抗體。嵌合抗體是這樣的分子，其中不同的部分源自不同的動物物種，諸如具有人免疫球蛋白恆定區和源自鼠mAb的可變區的那些(參見，例如，美國專利號4，816，567和4，816，397)。非人(例如，鼠)抗體的人源化形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗體的其它抗原結合子序列)，所述免疫球蛋白鏈或其片段含有源自非人免疫球蛋白的最小序列，諸如一個或多個來自非人物種的互補性決定區(CDR)和來自人免疫球蛋白分子的框架區(參見，例如，美國專利號5，585,089)。人源化的抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體(recipient)的互補性決定區(CDR)的殘基被具有所需的特異性、親和力和能力的來自非人物種(供體抗體) (諸如小鼠、大鼠或兔)的CDR的殘基替代。在有些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被對應的非人殘基替代。人源化的抗體還可以包括在受體抗體中和在輸入的CDR或框架序列中都不存在的殘基。一般而言，人源化的抗體包括基本上所有的至少一個、通常2個可變結構域，其中所有或基本上所有的CDR區域與非人免疫球蛋白的CDR區域相對應，且所有或基本上所有的FR區域是人免疫球蛋白共有序列的FR區域。人源化的抗體還最適宜地至少包括免疫球蛋白恆定區(Fe)的一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。通過本領域已知的重組DNA技術，例如使用在下述文獻中所述的方法，可以生產嵌合的和人源化的單克隆抗體:WO 87/02671 ；EP 184,187 ；EP171,496 ；EP 173,494 ； WO 86/01533 ；US 4, 816, 567 ；EP 125，023 ;Better 等人(1988) kience 240:1041-1043; Liu 等人((1987) Proc Natl Acad Sci. U. S. A. 84:3439-3443) ；Liu 等人((1987) J Immunol. 139 :3521-3526) ；Sun 等人((1987) Proc Natl Acad Sci. U. S. A. 84 :214-218)； Nishimura 等人((1987)Cancer Res. 47 :999-1005) ；Wood 等人((1985)Nature 314 446-449) ；Shaw 等人((1988)J Natl Cancer Inst. 80 :1553-1559) ；Morrison ((1985) Science 229 :1202-1207) ；Oi 等人((1986)Biotechniques. 4 :214) ；US5, 225，539 Jones 等人((1986)Nature 321 :552-525) ；Verhoeyan 等人((1988)Science 239 :1534)；和 Beidler等人((1988) J Immunol. 141 :4053-4060)。關於人源化的抗體和與其有關的方法的進一步討論，參見下面。Newman ((1992)Biotechnology. 10 :1455-1460)公開了另一種生產重組抗體的非常有效的方法。也參見美國專利號5，756，096 ；5, 750, 105 ；5，693，780 ；5, 681, 722 ；和 5，658，570。將非人抗體人源化的方法是本領域眾所周知的。人源化可以基本上按照如上所述的 Winter 和同事的方法(包括 Jones 等人 0 ((1986) Nature 321 :522-525) ；Riechmann 等人((1988) Nature 332 :323-327) ；Verhoeyen 等人((1988) Science 239 :1534-1536)來完成，其通過用齧齒動物CDR或CDR序列代替人抗體的相應序列進行。因此，這種人源化的抗體是嵌合抗體(參見美國專利號4，816，567和6，331，415)。在實踐中，人源化的抗體通常是人抗體，其中一些CDR殘基和一些可能的FR殘基被齧齒動物抗體中類似位點的殘基替代。要用於製備人源化的抗體的人可變結構域(輕鏈和重鏈)的選擇，對於減少抗原性而言是非常重要的。根據所謂的最佳擬合方法，針對已知人可變結構域序列的整個文庫，篩選齧齒動物抗體的可變結構域序列。然後接受與齧齒動物的序列最接近的人序列， 作為人源化的抗體的人框架(FR) (Sims 等人(1993) J Immunol. 151 =2296-2308 ；Chothia 和Lesk (1987) JMolBiol. 196 :901-917)。另一種方法使用源自輕鏈或重鏈的特定子集 (subgroup)的所有人抗體的共有序列的特定框架。相同的框架可以用於幾種不同的人源化的抗體(Carter 等人(1992)Proc Natl Acad Sci. U. S. A. 89 :4285-4289 ；Presta 等人 (1993)J Immunol. 151 :2623-2632)。
還希望，被人源化的抗體保留對抗原(即，Stx2的11E10表位)的高親和力和其它有利的生物特性。為實現這一目的，通過使用親本序列和人源化序列的三維模型，分析親本序列和不同概念的人源化產物，來製備人源化的抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且是本領域技術人員熟知的。可獲得例證並展示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的電腦程式。檢查這些展示(顯示，displays)，可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析這些殘基影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力。以此方式，可以選擇FR殘基，並與共有和輸入(import)序列結合，從而得到所需的抗體特徵， 諸如增加的對(一種或多種)靶抗原的親和力。一般而言，⑶R殘基直接地並最顯著地參與影響抗原的結合。全人抗體可用於人受試者的治療性處理。例如，使用不能表達內源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因、但是可以表達人重鏈和輕鏈基因的轉基因小鼠，可以生產這樣的抗體。可以以常見方式，用選擇的抗原(例如，包括11E10表位的多肽)免疫轉基因小鼠。例如，參見 PCT
發明者安傑拉·邁爾頓-塞爾桑, 艾利森·奧博萊, 詹姆斯·辛克萊爾, 麥可·史密斯 申請人:傑克孫 M. 亨利基金會先進軍事醫學有限公司