嗜熱毀絲黴菌株及其在產角蛋白酶方面的應用的製作方法

2023-08-11 10:41:16

專利名稱：：嗜熱毀絲黴菌株及其在產角蛋白酶方面的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及嗜熱毀絲黴菌株及其應用。
背景技術：
：角蛋白酶(keratinase)是一種專一性很強的蛋白酶，能特異性地分解角蛋白，而角蛋白廣泛存在於自然界中，主要來源於動物的外胚層細胞，包括皮膚以及皮膚的衍生物，是其結構蛋白，可分為a和|3兩種類型。該類蛋白質化學結構穩定，是一種抗性很強的硬性蛋白，它的結構通過二硫鍵、氫鍵、鹽鍵和其它交鍵作用使得非常穩定，不溶於水，難以被胰蛋白酶、胃蛋白酶等常見蛋白酶降解，但能被角蛋白酶所降解。角蛋白酶具有降解天然角蛋白的特性，屬於鹼性絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶族，被認為是一類誘導酶。由於角蛋白酶具有能特異性地分解角蛋白的特性，使其在飼料工業、肥料工業、醫學領域、皮革工業、洗滌用品、美容產品、食品工業、環境治理及紡織工業等方面均有廣泛的應用。因此，研究與開發產角蛋白酶意義重大。嗜熱菌具有在發酵中利用其嗜熱特性可以提高反應溫度，以增大反應速度，提高單位時間內的產率，節約成本；減少中溫型雜菌的汙染機率等優勢。而嗜熱真菌產角蛋白酶的研究尚未見報導。毀絲黴屬的其他真菌也尚未見報導可以產生角蛋白酶。
發明內容本發明的目的在於提供嗜熱的、產角蛋白酶能力強且生長快速的嗜熱毀絲黴菌株。本發明的另一目的是提供該嗜熱毀絲黴菌株在產角蛋白酶方面的應用。本發明的再一目的是提供該嗜熱毀絲黴菌株產角蛋白酶的方法。嗜熱毀絲黴菌株從四川平武的土樣中分離而獲得，已於2009年7月15日保藏在中國典型培養物保藏中心(地址中國武漢武漢大學)，名稱為嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.l(MyceliophthorathermophilaGZUIFR-H94.1)，保藏號CCTCCNO:M209140。本發明的嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1，具有以下形態學特徵在PDA培養基上，38t:培養2.5天，菌落直徑85mm，平展，褐色，邊緣白色，延長培養全部變為褐色，絨狀至粉狀，表面有菌絲呈網狀分布；正反面顏色一致。菌絲具隔膜，半透明，表面光滑，氣生菌絲明顯分為粗細兩種類型，均可育，細菌絲寬O.9-1.8ym，粗菌絲寬3.6-6.3(8.1)ym。無球拍狀菌絲。頂生和側生分生孢子，無柄，或生在短柄或短突或側枝上，單生或雙生或3個成鏈，半透明，光滑或具瘤，大多橢圓形，大小4.5-7.2X2.3-4.5iim，單孢，雙孢極少，基痕寬O.5-2iim，產孢豐富。無間生孢子。厚垣孢子未見。有性型未知。此菌為嗜熱真菌，在2(TC時幾乎不生長，25t:培養7天菌落直徑為15mm，最適生長溫度為35-40。C，53。C培養7天，直徑達45mm。60。C下未見生長。本發明嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1菌株產角蛋白酶的方法，是以雞毛粉20.10g/L3為碳、氮源和誘導物、尿素0.98g/L為補充氮源、NaCl5g/L，K2HP046g/L，KH2P04lg/L為產酶培養基，產酶溫度為3『C初始pH為7.9，連續培養6天，酶活測定時間為培養的第6天。本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本菌株從四川平武的土樣中分離而獲得，為中國本土的菌株，並非從國外引進。該菌株的產角蛋白酶能力強。由於是一個嗜熱菌株，因而在發酵中可以提高反應溫度，以增大反應速度，提高單位時間內的產率，節約成本；而且有減少中溫型雜菌的汙染機率等優勢。同時，由於本菌株生長快速，可以縮短髮酵周期，也有提高單位時間產率，減少汙染機會，節約生產成本等優勢。以下通過具體實施方式來進一步說明本發明的有益效果。具體實施例方式實施例1:(1)材料來源採自四川平武的土樣。馬丁氏培養基KH2P04lg，MgS04.7H200.5g，蛋白腖5g，葡萄糖10g，瓊脂18g，孟加拉紅1/300mL。滅菌條件12rC，30min。用前待溫度冷卻在4(TC左右，加青黴素20/mg，鏈黴素40iig/mg。PDA培養基馬鈴薯200g切塊，加水約500mL，煮沸30min，過濾，加葡萄糖20g，瓊脂20g，水補足1000mL，pH自然。滅菌條件121°C，30min。(2)菌株的分離純化稱取2g土樣加入盛有20mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min左右，使土樣均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液。吸取lmL土壤懸液到9mL無菌水中，依次按10倍法稀釋，通常稀釋在10—110一3。採用混菌法接種，吸取lmL懸液於直徑為9cm的滅菌培養皿中，然後傾注已熔化並冷卻到45t:的雙抗馬丁氏培養基，充分混勻，待凝固後倒置，4(rC保溫培養。待菌落長出後轉移到新的培養皿進行純化，獲得GZUIFR-H94.1菌株。(3)分離株的鑑定把待鑑定菌株移入PDA培養基中，採用點中法接種，倒置放於38t:溫箱中培養7天。採用膠帶粘帖法進行標本片的製作並採用Motic數碼顯微鏡進行顯微攝影，描述記載待定菌株的菌落特徵和微觀形態特徵。通過經典形態學鑑定，該分離株為嗜熱毀絲黴，具體描述如下在PDA培養基上，38t:培養3天，菌落直徑85mm，平展，褐色，邊緣白色，延長培養全部變為褐色，絨狀至粉狀，表面有菌絲呈網狀分布；正反面顏色一致。菌絲具隔膜，半透明，表面光滑，氣生菌絲明顯分為粗細兩種類型，均可育，細菌絲寬0.9-1.8iim粗菌絲寬3.6-6.3(8.1)ym。無球拍狀菌絲。頂生和側生分生孢子，無柄，或生在短柄或短突或側枝上，單生或雙生或3個成鏈，半透明，光滑或具瘤，大多橢圓形，大小4.5-7.2X2.3-4.5iim，單孢，雙孢極少，基痕寬O.5-2iim，產孢豐富。無間生孢子。厚垣孢子未見。有性型未知。此菌為嗜熱真菌，在2(TC時幾乎不生長，25t:培養7天菌落直徑為15mm，最適生長溫度為35-40。C，53。C培養7天，直徑達45mm。60。C下未見生長。實施例2:嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1菌株產角蛋白酶的方法，包括以下步驟(1)培養基搖瓶發酵培養基雞毛粉20.10g，尿素0.98g，NaCl5g，K2HP046g，KH2P04lg，水1000m，初始pH為7.9。[OOSO](2)液體發酵培養將本發明的菌株接種在含固體PDA培養基的培養皿中，38t:培養3天，用直徑7mm的打孔器打空，然後將菌絲塊接種到裝有50mL復篩液體培養基的250mL三角瓶中，每瓶接3孔菌絲塊，每組作3個重複，放入3『C搖床中，140rpm保溫靜止培養，測定酶活力。(3)粗酶液的製備孢子液的製備取4t:冰箱保存的菌種，用接種環挑取少量菌絲，用劃線法將其接種於PDA培養基上，38t:培養。長好後，用滅菌的0.05%的Tween-80輕輕洗出平板表面的分生孢子，並在無菌條件下用16層紗布過濾，所得孢子懸液以血球計數板計數後置於4t:保存備用。粗酶液的提取取適量的孢子液加入250mL的三角瓶中(內裝50mL發酵液)，於38t:，120rpm搖床上培養。6天後取發酵液，4000rpm離心5min，然後再用快速定性濾紙過濾，取濾液既得粗酶液。(4)角蛋白酶活力的測定在9.5mL0.1M，pH8.0的Tris-HCl緩衝液中加底物(雞毛粉20mg)和酶液(0.5mL)，於38°C、120rpm的搖床中反應2h，冰浴冷卻10min，先用濾紙過濾，濾液再用真空纖維微孔過濾器(0.45iim)過濾，280nm測光吸收。酶活力定義為pH8.0、38t:條件下，lh水解角蛋白使光吸收值(對對照)每增加O.Ol，所對應的酶量為l個活力單位(U)。測量3次，取平均值。則酶活力(U/L)=1000X測定所得的活力單位(即0.5mLX2X2hX(1/2)X(OD值/0.01)X1000)。嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1菌株產角蛋白酶的方法選擇實驗例—、不同補充碳源對產角蛋白酶的影響在發酵基礎培養基中分別加入2%的可溶性澱粉、麥芽糖、甘油、葡萄糖，發酵第6天時，測定酶活力的結果如表1。由表可知，在所試條件下，分別加入可溶性澱粉、麥芽糖和甘油時，所得到的酶活均高於用發酵基礎培養基發酵時所得的酶活，即相對於發酵基礎培養基，它們對產酶均有促進作用。其中，可溶性澱粉對產酶的促進作用最大，使每升溶液的酶活增加了1000個單位；而加入葡萄糖時的酶活與不加葡萄糖時的酶活相同，即在所試條件下葡萄糖對產酶沒有影響表1補充C源對嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1產角蛋白酶的影響tableseeoriginaldocumentpage6二、不同補充氮源對產角蛋白酶的影響在發酵基礎培養基中分別加入0.1%的硝酸鈉、硝酸氨、氯化鈉、尿素，發酵第6天時測定酶活力，結果見表2。在所試條件下，分別加入硝酸鈉、硝酸氨和氯化氨時，所得到的酶活均低於用發酵基礎培養基發酵時所得的酶活，即相對於發酵基礎培養基，它們對產酶均有抑制作用。其中，氯化氨對產酶的抑制作用最大，使每升溶液的酶活減少了700個單位，幾乎抑制了產酶；而加入尿素時使每升溶液的酶活比不加入尿素時增加了200單位，說明尿素對產酶有促進作用。表2補充N源對嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1產角蛋白酶的影響tableseeoriginaldocumentpage6三、不同補充S源對產酶活力的影響在發酵基礎培養基中分別加入0.5mmol/L的亞硫酸鈉、巰基乙醇、硫代硫酸鈉、二硫蘇糖醇、硫酸鈉。發酵第6天時測定酶活力的結果見表3。由表可知，在所試條件下，分別加入硫酸鈉、亞硫酸鈉、巰基乙醇和二硫蘇糖醇時，所得到的酶活均低於用發酵基礎培養基發酵時所得的酶活，即相對於發酵基礎培養基，它們對產酶均有抑制作用。其中，二硫蘇糖醇對產酶的抑制作用最大，使每升溶液的酶活減少了700個單位，幾乎抑制了產酶；而加入硫代硫酸鈉時使每升溶液的酶活增加了600個單位，即相對於發酵基礎培養基，它對產酶有較強的促進作用。表3補充S源對嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1產角蛋白酶的影響酶活(U/L)補充S源KerationaseActivity(U/DSulfurSource加入補充S源的酶活(U/L)用發酵基礎培養基的酶活(U/L)(對昭)"、、/碌K代石克酸鈉1400800碌酸鈉300800亞錄^酸鈉300800巰基乙醇300800二碌u蘇糖醇200800四、不同無機離子對產酶活力的影響在發酵基礎培養基中分別加入0.01%的MgS047H20、CaCl2、CuS045H20、ZnS047H20和FeS047H20，在發酵第6天時測定酶活力。由表4可知，在所試條件下，分別加入CuS045H20和MgS047H20時，所得到的酶活均低於用發酵基礎培養基發酵時所得的酶活，即相對於發酵基礎培養基，它們對產酶均有抑制作用。其中，MgS047H20對產酶的抑制作用最大，使每升溶液的酶活減少了700個單位，幾乎抑制了產酶；而分別加入CaCl2和ZnS047H20時，所得到的酶活均高於用發酵基礎培養基發酵時所得的酶活，即相對於發酵基礎培養基，它們對產酶均有促進作用。其中，CaCl2對產酶的促進作用最大，使每升溶液的酶活增加了900個單位；而加入FeS047H20時的酶活與不加FeS047H20時的酶活相同，即在所試條件下FeS0471120對產酶沒有影響。表4無機離子對嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1產角蛋白酶的影響7酶活(U/L)無機離子Keratio腦eActivity(U/Uinorganicions加入無機離子的酶活(U/L)用發酵基礎培養基的酶活(U/L)(對照)氯化釣1700800硫酸鋅1100800錄u酸i失800800硫酸銅500800硫酸4美100800五、培養條件對嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1產角蛋白酶的影響實驗材料與方法1.1試驗用培養基搖瓶發酵培養基雞毛粉20.10g，尿素0.98g，NaCl5g，K2HP046g，KH2P04lg，水1000m，初始pH為7.9。1.2液體發酵培養將研究菌株接種在含固體PDA培養基的培養皿中，3『C培養3天，用直徑7mm的打孔器打空，然後將菌絲塊接種到裝有50mL復篩液體培養基的250mL三角瓶中，每瓶接3孔菌絲塊，每組作3個重複，放入38t:搖床中，140rpm保溫靜止培養，測定酶活力。1.3粗酶液的製備孢子液的製備取4t:冰箱保存的菌種，用接種環挑取少量菌絲，用劃線法將其接種於PDA培養基上，38t:培養。長好後，用滅菌的0.05%的Tween-80輕輕洗出平板表面的分生孢子，並在無菌條件下用16層紗布過濾，所得孢子懸液以血球計數板計數後置於4t:保存備用。粗酶液的提取取適量的孢子液加入250mL的三角瓶中(內裝50mL發酵液)，於38t:，120rpm搖床上培養。6天後取發酵液，4000rpm離心5min，然後再用快速定性濾紙過濾，取濾液既得粗酶液。1.4角蛋白酶活力的測定在9.5mL0.1M，pH8.0的Tris-HCl緩衝液中加底物(雞毛粉20mg)和酶液(0.5mL)，於38°C、120rpm的搖床中反應2h，冰浴冷卻10min，先用濾紙過濾，濾液再用真空纖維微孔過濾器(0.45iim)過濾，280nm測光吸收。酶活力定義為pH8.0、38t:條件下，lh水解角蛋白使光吸收值(對對照)每增加O.Ol，所對應的酶量為l個活力單位(U)。測量3次，取平均值。則酶活力(U/L)=1000X測定所得的活力單位(即0.5mLX2X2hX(1/2)X(OD值/0.01)X1000)。81.5對產酶重要因子的篩選及結果優化用SAS軟體中的Plackett-Burman設計對產角蛋白酶重要因素進行篩選，在此基礎上用RSA法優化試驗結果，尋找最佳試驗點。2.實驗結果2.lPlackett-Burman設計對產角蛋白酶重要因素的篩選結果在單因子優化實驗的基礎上，分別選擇可溶性澱粉、尿素、CaCl2、ZnS047H20、Na2S203作為C-源、補充N-源、補充S-源、無機離子，並對以上因素與培養溫度、初始pH、搖床轉速等，使用Plackett-Burman設計，考察它們對發酵產角蛋白酶的影響。本試驗中Plackett-Burman試驗設計如表5，各個因素的水平及其效應見表6。表5N=12的Plackett-Burman試驗設計表及其響應值Table5TheresultofPlackett-Burmandesigntableseeoriginaldocumentpage9表6各因素的名稱、水平及其影響效應Table6Name,levelandmaineffectofeachvariabletermfactorLowlevelHighlevelestimateStderrtPr>|t|prominenceX,可溶性澱粉2%2.5%-550528.01160.5864720.5987675X2尿素0.0.125%-450528,0116-3.518830.038952X3CaCl20.01%0.0125%-716.6667528.01160.0977450.9282997X4ZnS(V7H200.01%0.0125%-283.3333528.01161.3684340.2646494X5Na&Q,0.05%0.0625%650528.0116-O.293240.7884566X6PH78.8616.66667528.01164.0075570.027871X7轉速120150-250528.0116-2.932360.0608853X8溫度35440528.0116t18設定t檢驗大於t值概率高於95%的因素為顯著影響因素，由表3.5可以看出pH、尿素對產酶影響顯著。由於在發酵過程中雞毛粉起到了非常重要的作用，一方面雞毛粉可作為C、N源，另一方面也是重要的產酶誘導物，所以在進一步的優化中選擇對雞毛粉和對產酶影響顯著的PH和尿素作為優化目標，確定其最佳量。2.2RSA法優化實驗結果本試驗中按Box-Behenken設計法的設計，各因素所取水平見表7，實驗設計的表格及結果如表8。表7三因素水平的取值Table7Levelandcodeof3keyfactorsforBox_Behenkendesign10tableseeoriginaldocumentpage11表8Box-Behenken實驗設計與結果Table8TheresultsofBox_Behenkendesigntableseeoriginaldocumentpage119-10-122001010-1350011-10128001210118001300053001400052001500053002.3試驗結果分析表8結果經過SAS軟體的分析得出二次回歸方程為Y丄=5266.667-25X^162.5X2_212.5X3_1058.333X^-175X^2-575X^3-1783.333X22-1633.333X32從上面的方程的平方項的係數均為負數可知，此方程的拋物面開口向下，有極大值點。經計算該模型的決定係數R2=0.9940，離回歸標準差0.172723，表明回歸方程擬合程度好。由表9回歸係數的估計可知WX3對酶活力影響的線性關係不顯著；X/、X/、X/對酶活力影響的曲面效應顯著；^、X3對產酶活力的交互影響效應顯著，XpX2，X2、X3交互影響效應不顯著。表9回歸係數的估計Table9EstimatevalueofregressioncoefficientEstimateStderrtPr>|tlprominenceX-2561.0669-0.409390.699203x2-162.561.0669-2.661020.044829X3-212.561.0669-3.479790.017663X晶-1058.33389.88805-11.77390.0001**(非常顯著)Xl*X2-17586.36164-2.026360.098567Xl*X3-57586.36164-6.658050.001153*(顯著)12**(非常顯0.0001著)1林(非常顯0.0001_著)由表10回歸方程的各項方差分析可知此模型中各因子與響應值之間的關係高度顯著，其中平方項和交互相的影響顯著，一次項影響不顯著。失擬項很小，說明可以用此模型來解釋預測試驗。表10回歸方程各項方差分析表TablelOAnalysisofmean叫imredeviationSourc6DFSSMSFPr〉FModel92455483272831591.451890.0001(Linear)35775001925006.4525140.035917(Quadratic)322532337510778251.75790.0001(CrossProduct)31445000481666.716.145250.00527Error5149166.729833.33(Lackoffit)31425004750014.250.066284(PureError)26666.6673333.333Tota1424704000SourceDFSSMSFPr>F分析此模型可知存在最大值點，當X:=0.010154，X2=-0.046059，X3=-0.066838時，即以羽毛粉為20.10g/L、尿素為0.9770g/L、初始PH為7.933和其他無機離子(NaCl5g/L，K2HP046g/L，KH2P04lg/L)為發酵培養基，發酵條件在所試範圍之時能夠得到預期最大的酶活為5277.38U/L。而驗證性試驗證明在優化條件下，角蛋白酶活達到了4443.55U/L，此結果是以基礎培養基發酵時所得酶活800U/L的5.6倍。綜上所述，嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1菌株產角蛋白酶的最佳培養基配方和培養條件為以雞毛粉20.10g/L為碳、氮源和誘導物，尿素0.98g/L為補充氮源，NaCl5g/L，13X2*X2-1783.333X2*X30X3*X3—1633.33389.88805-19.839586.36164089.88805-18.1708K2HP046g/L，KH2P04lg/L為產酶培養基，產酶溫度為38。C初始pH為7.9，連續培養6天，酶活測定時間為培養的第6天。不同金屬離子對酶活的影響差異顯著。在O.lg/L的濃度和所試條件下，&2+均表現出明顯的增強作用，Zn2+也有增強作用，而Mg"和Cu"表現出明顯的抑制作用。Fe3+對產酶沒有影響。權利要求一種嗜熱毀絲黴菌株GZUIFR-H94.1(MyceliophthorathermophilaGZUIFR-H94.1)，其特徵在於所屬菌株保藏號為CCTCCNOM209140。2.如權利要求1所述的嗜熱毀絲黴菌株在產角蛋白酶方面的應用。3.—種嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.l菌株產角蛋白酶的方法，是以雞毛粉20.10g/L為碳、氮源和誘導物、尿素0.98g/L為補充氮源、NaCl5g/L，K2HP046g/L，KH2P04lg/L為產酶培養基，產酶溫度為38t:初始pH為7.9，連續培養6天。全文摘要本發明公開了一種嗜熱毀絲黴菌株及其在產角蛋白酶方面的應用，嗜熱毀絲黴菌株GZUIFR-H94.1(MyceliophthorathermophilaGZUIFR-H94.1)，其菌株保藏號為CCTCCNOM209140。嗜熱毀絲黴GZUIFR-H94.1菌株產角蛋白酶的方法，是以雞毛粉20.10g/L為碳、氮源和誘導物、尿素0.98g/L為補充氮源、NaCl5g/L，K2HPO46g/L，KH2PO41g/L為產酶培養基，產酶溫度為38℃初始pH為7.9，連續培養6天。本菌株是一個生長快速、嗜熱的菌株，且具有較強的產角蛋白酶能力。文檔編號C12N1/14GK101717727SQ200910102968公開日2010年6月2日申請日期2009年12月23日優先權日2009年12月23日發明者張繼偉,杜文,梁宗琦,梁建東,韓燕峰申請人:貴州大學