一種食用植物油中殘留dna的提取方法

2023-08-11 08:20:46

專利名稱：：一種食用植物油中殘留dna的提取方法
技術領域：
：本發明涉及化工過程中一個單元過程，特別涉及物理分離過程，確切地說是一種食用植物油中殘留DNA的提取方法。二
背景技術：
：目前轉基因技術在農業上得到了推廣與應用，比如轉基因棉花(抗蟲棉)、轉基因大豆等。由於轉基因植物存在的安全性問題使得轉基因農作物的標籤問題成為公眾關注的主要熱點，己有30多個國家制定了相應的法律法規對轉基因作物及其衍生產品進行標籤。隨著我國市場的進一步開放，一些未經標籤和認證的轉基因生物及其深加工產品進入國內市場的可能性大為增加，這就迫切地需要合適的檢測手段以確定這些產品中是否含有轉基因成分。在需要檢測的各類產品中，食用油脂首當其衝。食用植物油是油脂作物的深加工產品。在加工過程中細胞經過了許多極端的處理，如高溫、高壓、有機溶劑長時間的萃取等，這些過程導致油脂中的基因組DNA含量成指數級降低，同時造成染色體的斷裂和雙鏈DNA的變性等破壞性結果，大量的基因組DNA被降解成單鏈或者大小不一的基因片段，這些片段與其他雜質如蛋白質、多糖、色素、膽鹼等一起對提取方法構成幹擾。CTAB法被廣泛用於植物DNA的提取。CTAB(十六烷基三甲基溴化胺)是一種陽離子去汙劑，它能與蛋白質和大多數的多糖(酸性多糖除外)形成複合物，從而使DNA與多糖分開，再用乙醇沉澱DNA可除去CTAB從而得到純度較高的DNA，可以有效的除去多糖、蛋白等油脂中主要影響PCR擴增的主要雜質，得到高質量的DNA。但對富含酚類和脂肪類的植物DNA的提取效果多不夠滿意，而且對色素、膽鹼等雜質的清除能力不夠，使最終得到的DNA溶液呈淡黃色，且擴增效果差。瑞士ROCHE公司出品的食品DNA提取專用試劑盒HighPureGM0SamplePr印arationKit可用於食用油脂中殘留的DNA的提取，但價格昂貴，需要進口，不適用於商業化的市場監控。三
發明內容本發明旨在提供一種能獲得高純度目的基因組DNA的提取方法，所要解決的技術問題是在提取過程中成功地除去各種雜質。本發明的技術方案包括油脂中DNA的富集，然後提取、純化、分離、洗滌和乾燥得到高純度的目的基因組DNA。所謂富集就是利用DNA溶於水的特性用水乳化法將油脂中殘留的DNA逐次轉移並富集至無菌水中，也就是將足夠量油脂中的DNA轉移至一定體積無菌水中，比如將至少25份體積油脂中的DNA分批轉移至1份體積水中。所述的水乳化就是充分攪拌油水混合物。所謂提取就是將提取緩衝液加入富集有DNA的水中，漩渦振蕩後於6367'C水浴中保溫3060min得到水提取液。所述的提取緩衝液為每升水中含1525gCTAB、0.050.15molTris,l2molNaCl和0.O卜O.03molEDTA。優選20gCTAB、0.lmolTris、1.5molNaCl和0.02molEDTA。實驗表明，當提取緩衝液中添加有1525g/L0-巰基乙醇或/和812g/LPVP時，目標產物DNA為白色沉澱，其PCR擴增結果更穩定。優選同時添加20g/Le-巰基乙醇和10g/LPVP。所謂純化就是將純化劑加入水提取液中攪拌均勻後離心分離，分去有機相，保留水相即為純化液。所述的純化劑選自酚、氯仿和異丙醇按25:24:1的體積比混合得到的有機溶劑或/和高濃度鹽水飽和的乙醚，優選酚、氯仿和異丙醇按25:24:1的體積比混合得到的有機溶劑純化至少兩次。所謂分離就是將沉澱劑加入預冷至-8-12'C的純化液中攪拌後於-25-18'C條件下靜置，待DNA沉澱析出完全後分離、洗滌、乾燥得到目標產物。將DNA溶於TE緩衝液中，加入Rnase酶，低溫保存，備用。所述的沉澱劑為2.53.5mo1的NH4Ac溶液與異丙醇按1:56的體積比混合的沉澱劑，優選3mo1NH4Ac溶液與異丙醇按l:6的體積比混合，-2(TC下靜置至DNA沉澱完全。本提取方法首先用水乳化法將DNA自油脂中轉移至水中，同時也將其他水溶性組分如多糖、多酚、色素、膽鹼等也轉移至水中形成雜質，以後的處理過程均是除去雜質的過程。CTAB—方面可以沉澱除去大部分多糖，另一方面通過65'C保溫45min促進殘留細胞的裂解和細胞內包括完整DNA組在內的內容物的釋放。對水提取液進行純化和沉澱可有效去除其他雜質，得到白色沉澱的DNA，且易溶於TE緩衝液中，本方法通用性好，用實驗室常用試劑即可對大豆油、玉米油、菜籽油和棉籽油中DNA實現提取且都得到了滿意的結果，僅一次提取即得到高純度的模板DNA，成功率高，一般不需重複提取。用實驗室常用試劑即可完成油脂DNA提取，同時產物純度超過專用試劑盒，在PCR之前無需對模板進行純化。對所提取的DNA可用紫外吸收光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測其純度。用Ultrospec3100pro型紫外分光光度計掃描200nm300nm樣品的吸收曲線，若吸收峰出現在260nm處，表明雜質幹擾少。測定DNA樣品在260nm和280nm波長處讀數，並根據比值OD260/OD280判斷DNA純度。為了測量的準確性和可靠性，測定時溶液的0D值(光密度)讀數應在0.051之間。0D260/0D280值為1.71.9時DNA質量好，含雜質少。對於純的DNA，OD260值為1時相當於50ug/mL雙鏈DNA。故DNA(雙鏈)含量為OD260nm值X50ug/mLX比色皿的稀釋倍數。結果見表l。表1:tableseeoriginaldocumentpage5四圖1是兩種提取方法提取4種油脂總DNA0.8鬼瓊脂糖凝膠電泳圖。A、B、C、D分別是大豆油、玉米油、油菜籽油、棉籽油的提取結果；1泳道是本方法提取結果，2泳道是試劑盒法提取結果。五具體實施例方式現以超市採購的大豆色拉油、玉米色拉油、油菜籽調和油、棉籽油為例，非限定實施例敘述如下(一)儀器MINI小型高速離心機3K15型高速冷凍離心機Mycyclerthermalcycler型PCR擴增儀PowerPacBasic型電泳儀GelDocXR型凝膠成像系統MLS-3750型高壓滅菌鍋Ultrospec3100pro型紫外分光光度計德國Eppendorf公司；德國Sigma公司;美國Bio-Rad公司；美國Bio-Rad公司；美國Bio-Rad公司；日本SANYO公司；瑞典Pharmaciabiotech公司；ELGAPURELABClassicDI型超純水儀英國ELGALabWater公司；移液槍5mL、lmL、200uL、100uL、20uL、10nL、1pL德國Eppendorf公司；超淨工作檯、超低溫冰箱、恆溫水浴鍋、製冰機、漩渦振蕩器各類槍頭及耗材等。(二)試劑CTAB、NaOH、Tris、HC1、EDTA、e-巰基乙醇、可溶性PVP(MW40000)、NaCl、歸c、苯酚氯仿異戊醇(25:24:1)、異丙醇、70%乙醇、無水乙醇、TE緩衝液(IOmmol/LTris-HC1pH8.0，lmmol/LEDTApH8.0)、Rnase酶IC液(10mg/mL)、瓊脂糖、硼酸、MgCl2、10倍PCRreactionbuffer,引物、TaqDNA聚合酶，dNTPs、溶液HighPureGM0SamplePr印arationKit、乙醚、溴化乙錠(EB)、6倍電泳加樣緩衝液、無菌去離子超純水。(三)油脂中DNA的提取1、乳化富集取600mL食用油轉入一個已滅菌的lOOOmL的燒杯中，再加入100mL無菌ddH20，用磁力攪拌器在4。C充分乳化2小時，4°C12000g離心3min，去除上層油脂層，再向下層水溶液中加入600mL食用油脂，乳化，離心，去除上層油脂層，反覆五次，即將3000mL食用油中殘留的DNA轉移至100mL水中。取水相用保存在4'C冰箱，用於DNA提取。2、DNA提取取500叱水相至2mL離心管，立即加入等體積的預熱至65。C的CTAB提取緩衝液[20g/LCTAB,0.lmol/LTris,10g/LPVP，20g/LP-巰基乙醇1.4mol/LNaCl,0.02mol/LEDTA，(pH8.0)],漩渦振蕩30s，在65。C水浴中保溫45min。放至室溫，得到水提取液，待純化。3、純化向水提取液中加入等體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1),輕輕顛倒混勻5min,12000g室溫下離心5min，重複純化一次(如果上清液還比較渾濁，再重複此步驟)，將上清液轉移至新的離心管中。4、分離將上述得到的上清液預冷至-15t:，加入0.71倍體積的沉澱劑攪拌後於-2(TC靜置，有白色DNA沉澱析出，待沉澱完全後離心分離，用70%乙醇洗滌沉澱兩次，乾燥後溶於TE緩衝液中，並加入Rnase酶，_20°<:冷藏備用。沉澱劑為3molNH4Ac溶液與異丙醇按1:6的體積比混合的沉澱劑。(四)試劑盒提取法用HighPureGM0SamplePr印arationKit試劑盒，參照說明書。取50(mL水相於2mLEP管中，加入lmLBufferI,渦旋30s,80。C水浴30min,期間顛倒兩次。12000g離心10min。在另一2mLEP管中加入400叱Buffer11，加入約1500^離心後的上清液，再加入80叱的Bufferni,用槍頭上下混勻，72'C水浴10min。等分水浴後的混合液，到另2mLEP管中，加入200叱的異丙醇,用槍頭上下混勻。取600ML的混合液加入到帶有套管的純化柱中，5000g離心lmin。棄去套管中的液體，重複此步驟直到混合液被完全去除。加入450PL的BufferIV到純化柱中，5000g離心lmin,棄去濾管中的液體。重複此步驟。棄去濾管中的液體，13000g離心10s。將純化柱放到一個新的1.5mLEP管中，加入70。C水浴過的30ABufferV到純化柱中，室溫放置5min。5000g離心lmin,棄去純化柱，此時1.5mLEP管中即為提取的DNA，-20'C冷藏備用。權利要求1、一種食用植物油中殘留DNA的提取方法，包括油脂水乳化富集、提取、純化、分離、洗滌和乾燥，其特徵在於所述的乳化富集就是用水乳化法將油脂中的DNA逐次轉移並富集至無菌水中；所述的提取就是將提取緩衝液加入富集有DNA的水中，漩渦振蕩後於63～67℃水浴中保溫30～60min得到水提取液，提取緩衝液為每升水中含15～25gCTAB、0.05～0.15molTris，1～2molNaCl和0.01～0.03molEDTA；所述的純化就是將純化劑加入水提取液中，攪拌均勻後離心分離得到水純化液，純化劑選自酚、氯仿和異丙醇按25∶24∶1的體積比混合得到的有機溶劑或/和高濃度鹽水飽和的乙醚；所述的分離就是將沉澱劑加入預冷至-8～-12℃的水純化液中攪拌後於-25～-18℃條件下靜置，當DNA沉澱析出完全後分離，沉澱劑為2.5～3.5mol的NH4Ac溶液與異丙醇按1∶5～6的體積比混合的沉澱劑。2、根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於所述的提取緩衝液為每升水中含20gCTAB、0.lmolTris、1.5molNaCl和0.02molEDTA。3、根據權利要求1或2所述的提取方法，其特徵在於所述的提取緩衝液中含1525g/Le-巰基乙醇或/和812g/LPVP。4、根據權利要求3所述的提取方法，其特徵在於所述的提取緩衝液中含2Og/L0-巰基乙醇和10g/LPVP。5、根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於所述的純化就是用酚、氯仿和異丙醇按25:24:1的體積比混合有機溶劑純化至少兩次。6、根據權利要求1所述的提取方法，其特徵在於所述的沉澱是加入沉澱劑後於-20'C下靜置至DNA沉澱析出完全。7、根據權利要求1或6所述的提取方法，其特徵在於所述的沉澱劑為3mol/LNH4Ac溶液與異丙醇按l:6的體積比混合的沉澱劑。全文摘要一種食用植物油中殘留DNA的提取方法，首先用水乳化法將油脂中的DNA逐次轉移並富集至無菌水中，然後加入含有CTAB、Tris、NaCl和EDTA的提取緩衝液於63～67℃水浴中保溫30～60min得到水提取液，向水提取液中加入由酚、氯仿和異丙醇混合的純化劑進行純化，分去有機相、水相即為純化液，最後將沉澱劑加入預冷的純化液中攪拌後於-25～-18℃靜置至DNA沉澱析出完全後分離，經洗滌、乾燥得到目標產物。本方法用實驗室常用試劑即可對大豆油、玉米油、菜籽油和棉籽油中DNA實現提取，僅一次提取就可得到高純度的模板DNA，產物純度超過專用試劑盒，在PCR之前無需對模板進行純化。文檔編號C07H1/08GK101100479SQ20071002557公開日2008年1月9日申請日期2007年8月3日優先權日2007年8月3日發明者亞王,彥陳申請人:安徽大學