可溶性sars病毒核衣殼蛋白的表達和純化的製作方法
2023-08-11 09:37:26
專利名稱：可溶性sars病毒核衣殼蛋白的表達和純化的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子和細胞生物學研究領域，具體涉及在宿主細胞中可溶性SARS病毒核衣殼蛋白(SARS Nucleocapsid protein)的表達和純化。
背景技術：
自2002年底至2003年初，一種被稱為「非典型肺炎(severe acuterespiratory syndrome，SARS)」的病例在我國廣東省被首次發現，隨後在世界30多個國家和地區爆發，SARS在我國內地的北京、山西、內蒙等25個省市自治區「肆意橫行」，對我國人民群眾的生命財產構成嚴重威脅。SARS是一種傳染性強、生存強、致死率高的新型病毒，截止到2003年5月19日，全球累計報告病例已達7864人，死亡病例643人。SARS已被世界公認為人類的共同敵人。SARS爆發後，引起了各國政府和研究機構的高度重視，世界衛生組織(WHO)已派遣技術人員前往疫區指導防治工作，各國科研人員緊密合作，共同尋找SARS的病原體和防治方法。經過多國科研人員的努力，終於發現SARS冠狀病毒(Coronavirus)是SARS感染、病人發病和致死的元兇。SARS病毒的全基因組已分別被加拿大、美國和中國的科學家測定，這對於研究SARS病毒的致病機理以設計抗SARS藥物具有重要意義。
核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，簡稱N蛋白)是冠狀病毒(Coronavirus)的一種重要結構蛋白。在成熟的病毒顆粒中，N蛋白和RNA結合位於病毒顆粒的核心。N蛋白在冠狀病毒的生理過程中有兩個方面的作用1、在病毒包裝的過程中和病毒RNA結合併與M蛋白(small membrane protein)相互作用使病毒RNA和N蛋白複合體被包裹進病毒衣殼中。2、在病毒RNA的轉錄和複製過程中與mRNA有相互作用，可能影響病毒RNA的轉錄和複製。在前一個過程中，存在一個N蛋白和病毒RNA相互識別的過程。N蛋白只會和完整的病毒RNA結合，也只有這樣的複合體才會被M蛋白包裹起來。一般認為，N蛋白通過識別病毒RNA中一個CDS-orflab 3』端的一段核酸序列(packagingsignal)來區別完整的病毒RNA和RNA片斷。在鼠肝炎病毒(murine hepatitisvirus)中的研究表明packaging signal位於病毒RNA 20304-20364的位置，長為69nt。對鼠肝炎病毒N蛋白的研究表明，N蛋白存在三個保守的區域(domain)，位於第二個區域中的一段序列(177-231)具有RNA結合活性，序列中存在SRXX的特徵序列。因此N蛋白對於病毒基因組RNA特徵性序列的識別及其與其他結構蛋白的相互作用，對於病毒粒子的準確組裝有著重要意義。
SARS冠狀病毒N蛋白是結構蛋白質區第二大編碼蛋白，長度為423個胺基酸。通過對50種N蛋白的進化樹分析，這50種N蛋白分成三枝，而SARS的N蛋白並不屬於這三枝，因此從由N蛋白構建的進化樹中可以看出SARS在進化上是一個特殊的病毒。通過對SARS病毒(SARS virus)、人冠狀病毒229E(Human coronavirus 229E)、鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus)、牛冠狀病毒(Bovine coronavirus)、鳥感染性支氣管炎病毒(Avian infectiousbronchitis Virus)的N蛋白的胺基酸序列比對，儘管N蛋白整體胺基酸同源性很低，但是存在兩個保守胺基酸集中的區域，其生物學意義不明。經同源比較發現SARS病毒N蛋白的178-205aa位，也就是在第一個保守胺基酸集中區域的末尾，存在一個SRXX富集區，而鼠肝炎病毒的相應區域正好是其RNA結合區，因而推測該區域有可能是SARS病毒N蛋白的RNA結合區的一部分。
另外研究還發現，在N蛋白373-389位附近，存在一個賴氨酸富集區(KKKKTDEAQPLPQRQKK/KTFPPTEPKKDKKKKTD)，該區域符合核轉移信號的基本特徵。這一特徵的生物學意義尚不能確定，既有可能是N蛋白核病毒RNA相互作用的證據，也可能意味著N蛋白能轉運進入宿主細胞核內，發揮某種核蛋白的作用。上述推測，還有待更進一步的實驗予以證實。
因此，在體外大量表達和純化可溶性SARS病毒N蛋白以探索其重要的生物學功能將具有重要的理論和現實意義。本發明者經過反覆實驗利用實驗過程中所積累的獨特相關技術經驗，在宿主細胞中成功表達和純化了可溶性SARS病毒N蛋白，從而完成了本發明。
本發明的一個目的是提供能夠在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒N蛋白的表達質粒。
本發明的另一個目的是提供用該表達質粒轉化的宿主細胞。
本發明的再一個目的是提供可溶性SARS病毒N蛋白在宿主細胞中的表達方法。
本發明的還有一個目的是提供SARS病毒N蛋白表達產物的純化方法。
發明內容
本發明的一個方面提供可在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒N蛋白的表達質粒N-pQE30，保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，分類名稱為大腸桿菌M15/pQE30-SARS-N，保藏日2003年5月30日，保藏號CCTCC No.M203046。
本發明的另一個方面提供用質粒N-pQE30轉化的宿主細胞。所述宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。
本發明的再一個方面提供在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒N蛋白的方法，包括以下步驟1)採用PCR技術從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒N蛋白DNA片段(TRO2)；2)用pQE30載體構建SARS病毒N蛋白表達質粒pQE30-N；3)將pQE30-N質粒轉化於宿主細胞中，並在宿主細胞中表達。
本發明的還有一個方面提供可溶性SARS病毒N蛋白表達產物的純化方法，包括細胞裂解、裂解液透析、NTA-Ni柱層析和分子篩純化。
附圖的簡單說明
圖1所示為可溶性SARS病毒N蛋白表達質粒(N-pQE30)構建示意圖。
圖2所示為SARS病毒N蛋白PCR產物DNA電泳分析圖譜。
圖3所示為克隆產物的PCR鑑定圖。
圖4所示為克隆產物的酶切鑑定圖。
圖5所示為N-pQE30測序報告。
圖6所示為SARS病毒N蛋白純化產物蛋白質聚丙烯醯胺電泳分析圖譜。圖中，M為標記物(Marker)；E2，含咪唑的N蛋白粗提物；E3-E6為經分子篩純化後的N蛋白。
圖7所示為SARS病毒N蛋白純化產物液質聯用總離子流圖。
具體實施例方式
實施例1 SARS病毒N蛋白表達質粒(N-pQE30)的構建利用PCR技術從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒N蛋白DNA片段(基因序列依據TRO2)，按圖1所示，構建表達可溶性的SARS病毒N蛋白的表達質粒(N-pQE30)。
1)設計引物，擴增N蛋白的序列引物序列FW5』ATTAGGATCCTCTGATAATGGACCCCAATCA 3』RV5』TTAAGTCGACTGCCTGAGTTGAATCAGCAGA 3』PCR擴增反應(100μl)模板2μl；10×緩衝液(PyrobesTMbuffer)10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；高保真DNA聚合酶(pyrobest DNA polymerase)1μl；水71μl。
反應條件95℃ 8分鐘；(95℃ 1分鐘；60℃ 1分鐘；72℃ 2分鐘)30循環；72℃ 10分鐘。
圖2所示為SARS病毒N蛋白PCR產物DNA電泳分析圖譜。
2)將N的PCR產物克隆到pQE30載體上N的PCR產物和pQE30分別用BamHI和SalI酶切(實驗方法參照《分子克隆》第二版)；用試劑盒(華舜公司)回收酶切產物(回收N的PCR酶切產物近1300bp；pQE30酶切產物近3.5kb)；用T4DNA連接酶連接；連接產物轉化入感受態細胞M15；挑選正確的克隆(PCR篩選和酶切鑑定)。
PCR鑑定利用N蛋白的特異性引物篩選正確的克隆。正確的克隆應擴增出近1300bp的片段(實驗方法和以上PCR反應的方法一致)。結果，在克隆產物的PCR鑑定圖(圖3)上顯示有正確的克隆。
酶切鑑定(實驗方法參照《分子克隆》第二版)HindIII在基因內部353bp，在載體上也有一個HindIII的酶切位點，正確的克隆應切出一條900bp左右的片段。經進一步酶切鑑定結果顯示，確實有正確的克隆(見圖4)。
DNA測序報告N-pQE30表達載體測序報告如圖5所示，N-pQE30DNA測序結果和N蛋白原DNA序列比較，第1125位(以N蛋白原序列的序列號為準)的G，在所測的11號克隆中相應處為A，這個鹼基位於密碼子的第三位，並不影響胺基酸編碼。
實施例2 可溶性SARS病毒N蛋白的表達將N-pQE30質粒轉化於大腸桿菌M15中，IPTG(濃度0.8mM)誘導，氨苄西林和卡那黴素為雙抗生素，溫度30℃，表達時間10小時。在上述表達條件下，6升LB培養基經4℃、4000rpm離心30分鐘後，將得到的18克細菌沉澱物以每份3克分裝，-80℃保存。
實施例3 表達產物的純化在4℃下，將3克細菌沉澱物懸浮於15mL裂解緩衝溶液(50mMTris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，1mM EDTA，1mM PMSF)中，超聲波破碎(超聲強度200～300W；超聲環境冰水混合物；總超聲時間15分鐘，每超聲1.5分鐘間隙1分鐘)。經4℃、15,000rpm超速離心1小時後，棄去沉澱物。將得到的14mL上清液在4℃下透析(透析緩衝液PBS，10mM咪唑)過夜後，用NTA-Ni柱(Pharmacia公司產品)純化蛋白，其中洗滌緩衝液為，PBS+60mM咪唑；洗脫緩衝液為，PBS+500mM咪唑。將得到的10mL蛋白粗提物經蛋白純化系統FPLC(Pharmacia公司產品)分子篩進一步純化得到純SARS病毒N蛋白(如圖6所示)。
實施例4 SARS病毒N蛋白質譜檢測1)N蛋白序列MRGSHHHHHH GSSDNGPQSN QRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPK QRRPQGLPNN60TASWFTALTQ HGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGD GKMKELSPRW120YFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGT RNPNNNAATVLQLPQGTTLP180
KGFYAEGSRG GSQASSRSSS RSRGNSRNST PGSSRGNSPA RMASGGGETA LALLLLDRLN 240QLESKVSGKG QQQQGQTVTK KSAAEASKKP RQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGD300QDLIRQGTDY KHWPQIAQFA PSASAFFGMS RIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKD360NVILLNKHID AYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQ 420NSMSGASADS TQAGRPAAKL N4412)N蛋白的酶解(膠內酶解)A.切下考馬斯蘭染色膠帶，置於離心管中，用30％ACN/100mM NH4HCO3脫色至膠帶呈無色透明狀。
B.棄去上清，加入100mM的NH4HCO3(pH8.3)，平衡5分鐘。
C.棄去上清，加入ACN脫水3分鐘。
D.棄去上清，冷凍乾燥。
E.將乾燥好的膠用50mM NH4HCO3浸潤，加入胰蛋白酶至酶物比為1∶30(W/W)；輕輕渦旋混合。
F.35℃保溫，反應過夜。
G.吸出上清，置於另一離心管1。
H.用60％ACN(0.1％TFA)提取肽段三次，提取液與前一次的上清合併置於離心管。
J.濃縮至15μ1，進行LC-MS檢測。
3)N蛋白液質聯用(LC-MS)分析HPLC儀採用Agilent HP1100質譜儀LCQ Deca ion-trap質譜儀(Finnigan公司)液相柱C830×2.1mmID，Tum(AQUAPORE，RP-300)流動相AH2O(0.1％HCOOH)，BACN(0.1％HCOOH)
時間(分鐘) A B0 95％ 5％2 95％ 5％15 85％ 15％35 50％ 50％45 5％ 95％47 5％ 95％53 95％ 5％60 95％ 5％質譜電噴霧電離電壓(ESI voltage)5KV毛細管電壓(capillary voltage)3V毛細管溫度(capillary temperature)220℃鞘氣(sheat gas)流速40arb輔助氣(Aux gas)流速3arb覆蓋率202/441＝45.81％N蛋白酶解後液質聯用(LC-MS)分析結果見表1。
表1 N蛋白經酶解後所得肽段及相關信息
產業上利用的可能性利用本發明可在宿主細胞中獲得大量的可溶性SARS病毒N蛋白(如，在大腸桿菌中，每升LB培養基可生產15毫克N蛋白)，利用NTA-Ni柱層析和分子篩提純方法即可得到純化的蛋白。本發明具有操作簡單、蛋白純度高等特點。
利用本發明得到的SARS病毒N蛋白可用於1)結構生物學方面的研究A.培養SARS病毒N蛋白晶體，通過X-射線晶體衍射技術解析SARS病毒N蛋白晶體結構；B.開展NMR研究，以探求SARS病毒N蛋白溶液狀態下的三維結構。
2)與人體重要蛋白相互作用研究利用本發明得到的SARS病毒N蛋白以及生物物理技術可開展與人體重要蛋白(如免疫系統)相互作用研究，以探索SARS病毒感染人體正常細胞的途徑，為抗SARS藥物設計提供依據。
3)SARS診斷抗體研究利用本發明得到的SARS病毒N蛋白與其他生物工程技術相結合，可開展SARS診斷抗體研究。
序列表CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGACAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAAACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGA GGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
權利要求
1.可在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒N蛋白的表達質粒，保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏號CCTCC No.M203046。
2.如權利要求1所述的表達質粒，含有如下序列CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGACAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCA CCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACA4AACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAA4CCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAAACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATTGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
3.一種用權利要求1所述表達質粒N-pQE30轉化的宿主細胞。
4.如權利要求3所述的宿主細胞，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。
5.如權利要求4所述的宿主細胞，所述宿主細胞為大腸桿菌。
6.在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒N蛋白的方法，包括以下步驟1)用PCR技術從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒N蛋白DNA片段；2)用pQE30載體構建SARS病毒N蛋白表達質粒pQE30-N；3)將pQE30-N質粒轉化於宿主細胞中，並在宿主細胞中表達。
7.可溶性SARS病毒N蛋白表達產物的純化方法，包括將細胞裂解液透析、NTA-Ni柱層析和分子篩純化。
全文摘要
本發明提供可在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒N蛋白的表達質粒N－pQE30(保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏號CCTCC No.M203046)。還提供在宿主細胞中表達可溶性SARS病毒N蛋白的方法，包括採用PCR技術從SARS病毒cDNA文庫中獲得SARS病毒N蛋白DNA片段(TRO2)；用pQE30載體構建SARS病毒N蛋白表達質粒pQE30－N；和將pQE30－N質粒轉化於宿主細胞中，並在宿主細胞中表達。進一步提供可溶性SARS病毒N蛋白表達產物的純化方法，包括將細胞裂解液進行透析、NTA－Ni柱層析和分子篩純化。本發明的方法操作簡單、得到的蛋白純度高。
文檔編號C07K14/165GK1472318SQ0312907
公開日2004年2月4日 申請日期2003年6月2日 優先權日2003年6月2日
發明者沈旭, 蔣華良, 陳克勤, 陳靜, 沈建華, 羅小民, 陳凱先, 莊賢韓, 沈 旭 申請人:中國科學院上海藥物研究所, 上海先導藥業有限公司, 上海單抗製藥技術有限公司