一種蛋白酶生產工藝的製作方法

2023-08-11 11:28:21

專利名稱：一種蛋白酶生產工藝的製作方法
一種蛋白酶生產工藝技術領域
本發明屬於酶生產技術領域，具體涉及一種利用地衣芽孢桿菌來生產蛋白酶的工藝。
背景技術：
目前，國內常採用技術水平較落後的固體發酵法來生產蛋白酶，其存在勞動強度大，生產環境條件差，染菌率高等弊端，產品多為固體粗製酶，僅能用於皮革、絲綢脫膠等少數行業，不能適應食品、飼料、洗滌劑等行業發展的需要。因而，食品、飼料、洗滌劑等對蛋白酶質量要求較高的行業普遍使用的是進口產品，其價格昂貴，增加了企業的生產成本。發明內容
本發明目的在於提供一種蛋白酶生產工藝，該工藝原料利用率高，蛋白酶品質好。
本發明通過以下技術方案來實現上述目的。
一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟1)種子培養將地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)接入斜面培養基在好氧條件下於30— 37°C培養24—30h，然後將培養好的斜面菌種接入種子培養基中，於30— 37°C恆溫搖床培養32— 37h ;再把培養好的菌種接入一級種子培養基於31 — 38°C培養9. 5 — 13h ；2)發酵將培養好的一級種子接入發酵培養基於32—38°C培養31 — 35h ；3)提取蛋白酶將培養好的發酵液轉入回收罐並向其中加入硅藻土和珍珠巖，攪拌均勻，經固液分離、超濾膜超濾處理及噴霧乾燥後即得。
具體的，所述步驟I)中，斜面培養基組成為蛋白腖O. 3—0. 5%，牛肉膏O. 2— O. 3%，磷酸二氫鉀O. 2—0. 5%，瓊脂I. 5—1. 7%，pH自然。種子培養基組成為蛋白腖O. 3— O. 5%，牛肉膏O. 2—0. 3%，磷酸二氫鉀O. 2—0. 5%，pH自然；一級種子培養基組成豆柏3— 5%,薯乾粉 2. 4—3. 2%,麩皮 3. 6—3. 9%,磷酸氫二鈉 O. 4—0. 6%,磷酸二氫鉀 O. 03—0. 07%, 菜籽油O. 4一O. 8%, pH自然。
所述步驟2)中，發酵培養基組成豆柏3—5%，薯乾粉2. 7—3. 5%，麩皮3. 8—4. 3%， 磷酸氫二鈉O. 4—0. 6%，磷酸二氫鉀O. 03—0. 07%，菜籽油O. 4—0. 8%，pH自然。
所述步驟3)中，硅藻土、珍珠巖的添加量均為發酵液重量的2—6% ;所用超濾膜的截留分子量為10000。
所述的蛋白酶生產工藝,具體步驟如下一、種子培養將地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)接入斜面培養基在30— 37°C恆溫培養箱中培養24— 30h，然後將培養好的斜面菌種接入(接種量2 — 5%)裝有種子培養基的搖瓶中， 於 30— 37°C恆溫搖床(轉速 140— 150r/min)培養 32— 37h。
將一級種子培養基投入種子罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)，然後通風降溫到31 — 38°C，將搖瓶培養好的菌種以I一5%的接種量接入一級種子培養基，保證罐壓在O. 05—0. 08Mpa，風量在12 — 26m3/hr (發酵罐內的空氣需進行殺菌過濾處理);溫度控制在31— 38°C，210— 270 r /min培養9. 5 — 13h，鏡檢，確保成熟無雜菌轉入發酵罐。
二、發酵將發酵培養基裝入發酵罐進行滅菌(12fl23°c實消4(Γ45分鐘)，然後通風降溫到 32— 38°C。以5 — 8%的接種量，接入培養好的一級種子進行發酵，發酵時間31 — 35小時。
其中，在發酵過程中不同時間點的發酵溫度如下所述時，效果較好0 — 2h於32— 38°C培養；2—IOh時，每小時升1°C，即到第IOh溫度升至40—46°C;10—20h時，每小時降 1°C，即到第20h溫度降至30—36°C。保證罐壓O. 05—0. 08Mpa ;風量0 7小時190 — 2IOm3/ h,發酵液與風量比(m3 :m3/min，下同)為I 0. 45—0. 51 ;8 15小時風量250—280m3/h,發酵液與風量比為I :0. 59 — I. 63。第16小時左右泡沫開始升高，此時調節風量，16h至發酵結束，發酵液與風量比為I :0. 67 — O. 71，風量280— 300m3/小時。發酵結束時，酶活力最低約達到 32000U/ml。
發酵過程中，自第10 —12小時開始，每4小時取樣測酶活力、PH、鏡檢菌形；第 23—26小時開始，每2小時一次 取樣測酶活力、PH、鏡檢菌形。連續兩次檢測酶活力不上升， 鏡檢菌形50— 60%芽孢以上，溫度上升緩慢或無上升趨勢，即可結束髮酵。
三、提取蛋白酶將培養好的發酵液轉入回收罐並向其中加入硅藻土和珍珠巖，攪拌均勻，板框過濾，濾液為粗酶液，粗酶液經板框二次過濾處理，進一步除去細菌等雜質，所得濾液再經超濾膜超濾處理及噴霧乾燥即可得到純的蛋白酶。
蛋白酶檢測方法依據GB/T23527-2009蛋白酶製劑進行。
採用本發明方法，發酵罐平均發酵水平37466u/mL，處於國內領先水平。本發明還把二次過濾和精濾除菌技術應用於酶的分離提取，開發出精製蛋白酶，填補了國內空白。
和現有技術相比，本發明優點I)研究開發了液體發酵法生產蛋白酶的工藝技術。在發酵工藝上，對產酶菌株的特性和產酶條件進行深入研究，採用稀醪發酵等工藝，縮短了發酵周期，提高了產酶水平，與傳統的固體發酵工藝相比，該工藝技術具有產率高、原料利用率高、勞動強度小，便於工業化生產，生產過程不易受雜菌汙染，酶系純等顯著優點。
2)在分離提取工藝上，採用二濾和精濾技術提高了收率和產品質量，成功開發出精製蛋白酶產品，填補國內不能生產精製液體蛋白酶的空白，並形成一套完整的深層液體發酵法生產蛋白酶的先進工藝技術，在35噸發酵罐的工業化生產中應用後，達到平均發酵單位37466u/mL，最高達42356 u/mL，產品總收率達80%以上。
3)採用本發明工藝所得蛋白酶產品性能穩定、質量可靠、價格適當可實現我國蛋白酶產品的升級換代，填補此類產品的空白，替代進口產品，滿足國內市場的需求。
具體實施例方式下面通過優選實施例來詳述本發明技術方案，但本發明的保護範圍並不局限於此。
實施例I一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟一、種子培養將地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis，購自上海市工業微生物研究所，商品編號B252)接入斜面培養基在30°C恆溫培養箱中培養26h，然後將培養好的斜面菌種接入(2%) 裝有種子培養基的搖瓶中，於30°C恆溫搖床(轉速140r/min)培養37h。
斜面培養基組成為蛋白腖O. 4%，牛肉膏O. 2%，磷酸二氫鉀O. 3%，瓊脂I. 6%，pH 自然。種子培養基組成為蛋白腖0.4%，牛肉膏0.3%，磷酸二氫鉀0.4%，pH自然。
將一級種子培養基(組成豆柏3%，薯乾粉2. 4%，麩皮3. 6%，磷酸氫二鈉O. 4%，磷酸二氫鉀O. 03%，菜籽油O. 5%，pH自然)投入種子罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)， 然後通風降溫到38°C，將搖瓶培養好的菌種以2%的接種量接入一級種子培養基，保證罐壓在O. 05Mpa，風量在12m3/h (發酵罐內的空氣需進行殺菌過濾處理)；溫度控制在38°C，210 r /min培養10h，鏡檢，確保成熟無雜菌轉入發酵罐。
二、發酵將發酵培養基(組成豆柏3%，薯乾粉2. 7%，麩皮3. 8%，磷酸氫二鈉O. 4%，磷酸二氫鉀O.03%，菜籽油O. 5%，pH自然)裝入發酵罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)，然後通風降溫到38°C。以8%的接種量，接入培養好的一級種子進行發酵，發酵33小時。
三、提取蛋白酶將培養好的發酵液轉入回收罐並向其中加入娃藻土和珍珠巖(娃藻土、珍珠巖的添加量分別為發酵液重量的2%和3%)，攪拌均勻，板框過濾，濾液為粗酶液，粗酶液經板框二次過濾處理，進一步除去細菌等雜質，所得濾液再經截留分子量為10000的超濾膜(型號 PES10-8040，下同)超濾處理後噴霧乾燥即可得到符合GB/T23527-2009要求、酶活力為 150000u/g左右的蛋白酶。
實施例2一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟一、種子培養將地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis，購自上海市工業微生物研究所，商品編號 B252)接入斜面培養基在32°C恆溫培養箱中培養28h，然後將培養好的斜面菌種接入(3%) 裝有種子培養基的搖瓶中，於32°C恆溫搖床(轉速145r/min)培養35h。
斜面培養基組成為蛋白腖O. 45%，牛肉膏O. 25%，磷酸二氫鉀O. 4%，瓊脂I. 65%， pH自然。種子培養基組成為蛋白腖O. 45%，牛肉膏O. 25%，磷酸二氫鉀O. 45%，pH自然。
將一級種子培養基(組成豆柏4%，薯乾粉2. 6%，麩皮3. 7%，磷酸氫二鈉O. 5%，磷酸二氫鉀O. 05%，菜籽油O. 6%，pH自然)投入種子罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)， 然後通風降溫到36°C，將搖瓶培養好的菌種以4%的接種量接入一級種子培養基，保證罐壓在O. 06Mpa，風量在18m3/h (發酵罐內的空氣需進行殺菌過濾處理)；溫度控制在36°C，240 r /min培養12h，鏡檢，確保成熟無雜菌轉入發酵罐。
二、發酵將發酵培養基(組成豆柏4%，薯乾粉3. 0%，麩皮4. 0%，磷酸氫二鈉O. 5%，磷酸二氫鉀O.05%，菜籽油O. 6%，pH自然)裝入發酵罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)，然後通風降溫到36°C。以6%的接種量，接入培養好的一級種子進行發酵，發酵34小時。
三、提取蛋白酶將培養好的發酵液轉入回收罐並向其中加入娃藻土和珍珠巖(娃藻土、珍珠巖的添加量分別為發酵液重量的3%和3. 5%)，攪拌混勻後板框過濾，濾液為粗酶液，粗酶液經板框二次過濾處理，進一步除去細菌等雜質，所得濾液再經截留分子量為10000的超濾膜超濾處理及噴霧乾燥即可得到符合GB/T23527-2009要求、酶活力為200000u/g左右的蛋白酶。
實施例3一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟一、種子培養將地衣芽孢桿菌(BaciIIus licheniformis，購自上海市工業微生物研究所，商品編號 B252)接入斜面培養基在35°C恆溫培養箱中培養30h，然後將培養好的斜面菌種接入(4%) 裝有種子培養基的搖瓶中，於35°C恆溫搖床(轉速150r/min)培養32h。
斜面培養基組成為蛋白腖O. 5%，牛肉膏O. 3%，磷酸二氫鉀O. 5%，瓊脂I. 7%，pH 自然。種子培養基組成為蛋白腖0.5%，牛肉膏0.2%，磷酸二氫鉀0.5%，pH自然。
將一級種子培養基(組成豆柏5%，薯乾粉3. 0%，麩皮3. 8%，磷酸氫二鈉O. 6%，磷酸二氫鉀O. 06%，菜籽油O. 7%，pH自然)投入種子罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)， 然後通風降溫到32°C，將搖瓶培養好的菌種以5%的接種量接入一級種子培養基，保證罐壓在O. 08Mpa，風量在24m3/h (發酵罐內的空氣需進行殺菌過濾處理)；溫度控制在32°C，260 r /min培養13h，鏡檢，確保成熟無雜菌轉入發酵罐。
二、發酵將發酵培養基(組成豆柏5%，薯乾粉3. 2%，麩皮4. 2%，磷酸氫二鈉O. 6%，磷酸二氫鉀 O. 06%，菜籽油O. 7%，pH自然)裝入發酵罐進行滅菌(121 123°C實消40 45分鐘)，然後通風降溫到32°C。以5%的接種量，接入培養好的一級種子進行發酵，發酵32小時。
三、提取蛋白酶將培養好的發酵液轉入回收罐並向其中加入娃藻土和珍珠巖(娃藻土、珍珠巖的添加量分別為發酵液重量的5%和4%)，開啟攪拌，混勻後經板框過濾，濾液為粗酶液，粗酶液經板框二次過濾處理，進一步除去細菌等雜質，所得濾液再經截留分子量為10000的超濾膜超濾處理及噴霧乾燥即可得到符合GB/T23527-2009要求、酶活力為100000u/g左右的蛋白酶。
權利要求
1.一種蛋白酶生產工藝，其特徵在於，包括以下步驟1)種子培養將地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)接入斜面培養基在好氧條件下於30— 37°C培養24— 30h，然後將培養好的斜面菌種接入種子培養基中，於30— 37°C恆溫搖床培養32— 37h ;再把培養好的菌種接入一級種子培養基於31 — 38°C培養9. 5 — 13h ；2)發酵將培養好的一級種子接入發酵培養基於32—38°C培養31—35h ；3)提取蛋白酶將培養好的發酵液轉入回收罐並向其中加入硅藻土和珍珠巖，攪拌均勻，經固液分離、超濾膜超濾處理及噴霧乾燥即得。
2.如權利要求I所述的蛋白酶生產工藝，其特徵在於，所述步驟I)中，斜面培養基組成為蛋白腖O. 3—0. 5%，牛肉膏O. 2—0. 3%，磷酸二氫鉀O. 2—0. 5%，瓊脂I. 5—1. 7%，pH 自然；種子培養基組成為蛋白腖O. 3—0. 5%，牛肉膏O. 2—0. 3%，磷酸二氫鉀O. 2—0. 5%， pH自然；一級種子培養基組成豆柏3 — 5%，薯乾粉2. 4—3. 2%，麩皮3. 6—3. 9%，磷酸氫二鈉 O. 4—0. 6%，磷酸二氫鉀 O. 03—0. 07%，菜籽油 O. 4—0. 8%, pH 自然。
3.如權利要求I所述的蛋白酶生產工藝，其特徵在於，所述步驟2)中，發酵培養基組成豆柏3 — 5%，薯乾粉2. 7—3. 5%，麩皮3. 8—4. 3%，磷酸氫二鈉O. 4—0. 6%，磷酸二氫鉀 O. 03—0. 07%，菜籽油 O. 4—0. 8%, pH 自然。
4.如權利要求I所述的蛋白酶生產工藝，其特徵在於，所述步驟3)中，硅藻土、珍珠巖的添加量均為發酵液重量的2—6% ;所用超濾膜的截留分子量為10000。
全文摘要
本發明涉及一種蛋白酶生產工藝，其包括以下步驟1)種子培養將地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)接入斜面培養基在好氧條件下於30—37℃培養24—30h，然後將培養好的斜面菌種接入種子培養基中，於30—37℃恆溫搖床培養32—37h；再把培養好的菌種接入一級種子培養基於31—38℃培養9.5—13h；2)發酵將培養好的一級種子接入發酵培養基於32—38℃培養31—35h；3)提取蛋白酶將培養好的發酵液轉入回收罐並向其中加入硅藻土和珍珠巖，攪拌均勻，經固液分離、超濾膜超濾處理及噴霧乾燥即得。採用該工藝收率高，所得蛋白酶品質好。
文檔編號C12N9/56GK102911925SQ20121044598
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年5月21日
發明者常東民, 孫利鵬, 管寧 申請人:河南仰韶生化工程有限公司